溫 海 秦海斌 張匯東 賀星亮

LAMP方法快速診斷犬瘟熱感染一例

溫 海 秦海斌 張匯東 賀星亮

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（Distemper virus，CDV）引起的犬科、貓科、鼬科、浣熊科等動(dòng)物的一種急性、高度接觸性傳染病，可導(dǎo)致犬50%～100%的發(fā)病率和60%～90%病死率，康復(fù)犬典型后遺癥是犬嗅覺功能下降或喪失。我國1972年首次報(bào)道本病在犬流行，并陸續(xù)在貉、貂、狐、大小熊貓、猴等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)本病。自20世紀(jì)80年代以來，隨著我國警、軍犬工作的發(fā)展及伴侶動(dòng)物的增多，使人們對(duì)本病及病原有了高度的重視。

近幾年，眾多非典型犬瘟熱臨床病例的出現(xiàn)使得犬瘟熱臨床癥狀越來越復(fù)雜，僅根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、包涵體檢查和病毒分離等常規(guī)方法很難確診CDV感染，國內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)CDV診斷進(jìn)行了大量研究，建立了RTPCR、巢式PCR、套式PCR、原位雜交、原位雜交與RT-PCR結(jié)合等多種分子生物學(xué)檢測(cè)方法，這些分子生物學(xué)技術(shù)從CDV的 RNA入手，通過基因水平來鑒定病毒的存在，具有高度的敏感性、特異性、可信度高等優(yōu)點(diǎn)，但其反應(yīng)擴(kuò)增過程、結(jié)果判斷環(huán)節(jié)上均要求具備先進(jìn)的儀器設(shè)備，因而在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用受到限制，因此，讓這些技術(shù)走出實(shí)驗(yàn)室、滿足獸醫(yī)臨床應(yīng)用一直是相關(guān)研究的焦點(diǎn)。

2000年，日本Eiken化工有限公司Notomi T等開發(fā)了一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)—環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），在恒溫條件（約60℃～65℃）下通過一步反應(yīng)既能完成靶基因的擴(kuò)增，若在反應(yīng)產(chǎn)物中加入一種熒光染料，通過反應(yīng)產(chǎn)物的顏色變化即可判斷是否出現(xiàn)了目的基因的擴(kuò)增，這些特點(diǎn)使該技術(shù)減少了對(duì)先進(jìn)儀器的依賴；同時(shí)LAMP技術(shù)大大提高了核酸擴(kuò)增的效率、減少了擴(kuò)增時(shí)間、簡(jiǎn)化了擴(kuò)增條件，能夠在15min～60min內(nèi)將DNA擴(kuò)增109倍～1010倍，成為一種具有臨床應(yīng)用前景的診斷方法。筆者所在實(shí)驗(yàn)室利用LAMP技術(shù)建立了犬瘟熱病毒的快速診斷方法，并將其與普通PCR方法的臨床診斷效果進(jìn)行了對(duì)比。現(xiàn)以一例犬非典型犬瘟熱感染的診斷為例，說明該方法在犬疫病防控中的有效性和可操作性。

一、發(fā)病及臨床癥狀

某犬場(chǎng)一窩德國牧羊犬，5頭38日仔犬齡全部發(fā)病，未接種疫苗，精神沉郁，鼻鏡干燥，其中3頭體溫高于41℃、另2頭39℃，眼瞼均有少量分泌物，鼻流清涕，發(fā)病1天后出現(xiàn)輕微嘔吐、腹瀉，3頭后期嘔吐、腹瀉漸重直至死亡。病程中均未呈現(xiàn)出典型犬瘟熱的膿鼻、鼻鏡干燥、足墊角質(zhì)化、雙相熱及神經(jīng)癥狀。臨床診斷為疑似非典型犬瘟熱，選擇兩頭癥狀較為明顯的病犬分別采集眼分泌物、鼻液、血液共6個(gè)樣本，3頭死亡犬采集肺臟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。紙條、RT-PCR、LAMP對(duì)比診斷結(jié)果見表1。

表1 不同臨床樣本三種檢測(cè)方法的效果比較

二、診斷

以犬瘟熱病毒免疫膠體金診斷試紙條、RT-PCR、LAMP技術(shù)3種方法對(duì)采集的臨場(chǎng)樣本進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，比較3種方法的檢測(cè)效果。結(jié)果如下：以進(jìn)口膠體金試診斷紙條進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，眼鼻分泌物中犬瘟熱診斷結(jié)果均為陰性，2個(gè)血液樣本犬瘟熱診斷陽性，肺臟樣品未診斷；以進(jìn)口試劑盒提取RNA，進(jìn)行CDV病毒的RT-PCR檢測(cè)，眼鼻分泌物中未檢測(cè)出CDV病毒基因，血液、肺臟樣品CDV病毒基因陽性；以RT-PCR檢測(cè)中提取的RNA模板，進(jìn)行LAMP診斷，除2個(gè)鼻液樣本中未檢測(cè)出CDV病毒外，其他樣本均呈現(xiàn)LAMP陽性結(jié)果。膠體金試

對(duì)比上述診斷結(jié)果可知，3種檢測(cè)方法均可有效檢出犬瘟熱病毒的存在，但是基于不同樣本中病毒含量的不同，3種檢測(cè)方法呈現(xiàn)出了不同的敏感性，以LAMP方法的敏感性和檢出率最高，RTPCR方法次之，膠體金的靈敏度和檢出率最低。證明LAMP方法在臨床檢測(cè)中具備敏感性優(yōu)勢(shì)。

另外，與RT-PCR方法比較，LAMP技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其結(jié)果的可視化，PCR方法只能依靠瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行最后結(jié)果的判斷，受儀器的局限性大；而LAMP技術(shù)除了傳統(tǒng)的瓊脂糖電泳外（圖1），也可通過添加SYBR GreenI、鈣黃綠素等染料進(jìn)行染色，來檢測(cè)擴(kuò)增是否發(fā)生，在LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR GreenI，由于SYBR Green I與長度不同莖環(huán)DNA結(jié)合，陽性產(chǎn)物在自然光下由橙色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，不需要借助儀器即可進(jìn)行結(jié)果的判斷，見圖2。因此，LAMP方法在臨床檢測(cè)中又兼具了操作上的優(yōu)勢(shì)。

三、治療

依據(jù)實(shí)驗(yàn)室的確診結(jié)果，以單克隆抗體抗病毒治療為主，輔助結(jié)合平衡、消炎療法。（一）生理鹽水250ml/d，1次/d。（二）犬瘟熱單克隆抗體2 ml/d，1次/d。（三）頭孢拉定250 mg/d，維生素C 200 mg/d，地塞米松0.5 mg/d，連繼治療5d。結(jié)果3頭犬治療不愈死亡，2頭犬癥狀逐漸減輕直至痊愈。

四、討論

早發(fā)現(xiàn)、早確診，對(duì)于犬瘟熱后期治療和病情轉(zhuǎn)歸極為關(guān)鍵，尤其在近幾年非典型犬瘟熱發(fā)病比例逐漸增多的情況下，診斷技術(shù)的靈敏性和操作便捷性對(duì)獸醫(yī)臨床極為重要。眾多研究表明LAMP技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)便、擴(kuò)增效率高、靈敏度高（可達(dá)常規(guī)PCR的100倍），可進(jìn)行電泳分析或者加入特定染料觀察染色后觀察顏色變化來定性檢測(cè)，這些特點(diǎn)說明LAMP技術(shù)作為一種新型的核酸檢測(cè)技術(shù)，可廣范應(yīng)用于犬的病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原微生物的定性檢測(cè)。

本文以一例非典型犬瘟熱的比較診斷作為范例，展示了LAMP技術(shù)在犬瘟熱病毒早期診斷中的靈敏性和有效性，為獸醫(yī)臨床診斷提供了一種新方法，但目前而言，LAMP技術(shù)的全部操作過程并未完全擺脫儀器設(shè)備的束縛，尤其在核酸提取環(huán)節(jié)仍需要具備一定實(shí)驗(yàn)儀器和技術(shù)水平，但它在靈敏度、便捷性上的改進(jìn)，將有望推動(dòng)和加快核酸擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的步伐。另外，LAMP技術(shù)也存在一定的缺陷，比如引物設(shè)計(jì)要求較高、存在一定比例的假陽性結(jié)果，但這些問題并非不可解決，隨著該技術(shù)的不斷完善和優(yōu)化，LAMP技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測(cè)領(lǐng)域必將會(huì)發(fā)揮更大的作用。

（作者單位：公安部南京警犬研究所，210012）

（編輯：李 冰）