符路娣

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東廣州 510405）

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）是我國(guó)四大老年病之一，是一種嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量和社會(huì)生產(chǎn)力的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病。該病不僅發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨損傷，還累及整個(gè)關(guān)節(jié)，包括關(guān)節(jié)軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜和關(guān)節(jié)周?chē)∪?，最終發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨退變，纖維化，斷裂潰瘍及整個(gè)關(guān)節(jié)面的損害[1]。近年來(lái)，隨著對(duì)OA 發(fā)病機(jī)制研究的深入，認(rèn)識(shí)到在OA 的病理過(guò)程中白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 是促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的致炎因子。目前對(duì)OA 的治療方法頗多但效果不夠理想。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用家兔OA 模型進(jìn)行研究，觀察比較臭氧和藥物治療的效果?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 OA 模型制備及分組

新西蘭兔80只，體重2.2-2.5kg，雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0020。隨機(jī)抽取10只作為正常對(duì)照組（簡(jiǎn)稱(chēng)A組），正常組不做任何處理，正常喂養(yǎng)。其余70只，分別于實(shí)驗(yàn)的第1 天、第4天于右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Ⅱ型膠原蛋白酶溶液0.5ml 制備骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，造模成功后隨機(jī)分為模型對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)B組)和治療組，治療組又分為:10ug/ml 臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)C10組）,20ug/ml 臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)C20組）；40ug/ml 臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)C40組）；低劑量活血止痛膠囊灌胃治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)D低組）,中劑量活血止痛膠囊灌胃治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)D中組）；高劑量活血止痛膠囊灌胃治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)D高組），每組10只。

1.2 方法

1.2.1 造模方法

（1）II 型膠原蛋白酶的配制：將II 型膠原蛋白酶按2mg/0.5ml 的濃度溶解于生理鹽水中，用0.2um 的無(wú)菌試管濾器過(guò)濾后裝入50ml 無(wú)菌瓶中，并置于0℃以下冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）蛋白酶溶液的注射：將新西蘭兔固定于固定架上，剪去膝關(guān)節(jié)處的兔毛，75%酒精消毒后用左手從下方和兩旁將關(guān)節(jié)固定，在髕韌帶附著點(diǎn)外上方約0.5cm 處進(jìn)針。針頭從上前方向下后方傾斜刺入，直至針頭遇阻力變小為止，然后針頭稍后退，以垂直方向推入，當(dāng)出現(xiàn)落空感時(shí)，表明已進(jìn)入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，即可注入藥液。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測(cè)

A.經(jīng)耳中動(dòng)脈抽取5ml 血液，4000 轉(zhuǎn)離心10 min，分離血清約600μl，保存于-80℃冰箱備檢。

B.雙抗體ELISA 法測(cè)定IL-1β、TNF-α 的含量。根據(jù)血清樣品的吸光度值,通過(guò)擬合后的公式計(jì)算出其濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與藥物

A.實(shí)驗(yàn)設(shè)備：意大利ECO3 di Franco Sardi 公司生產(chǎn)的Ozonline-E80 型醫(yī)用臭氧發(fā)生器；

B.藥物：活血止痛膠囊（中藥制劑，主要組成：當(dāng)歸、三七、土鱉蟲(chóng)等）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并以均數(shù)上標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果。

2 結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組血清TNF-α和IL-1β 活性的測(cè)量結(jié)果詳見(jiàn)下表。

由表可見(jiàn)，B、C、D組與A組比較有顯著性差異（p＜0.05）,這說(shuō)明造模成功；C組與B組比較沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）,這說(shuō)明臭氧無(wú)抑制已升高的血清TNF-α和IL-1β含量的作用；D組與B組比較有顯著性差異（p＜0.05），這說(shuō)明藥物灌胃治療均能抑制已升高的血清TNF-α和IL-1β含量的作用。

表各組血清TNF-α和IL-1β 濃度

3 討論

3.1 IL-1β 在OA 病程中的作用

在骨性關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程中,關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的病理變化是由一系列細(xì)胞因子的變化引起的。其中備受關(guān)注的細(xì)胞因子是IL-1β和TNF-α，經(jīng)研究證實(shí)，這兩種細(xì)胞因子是OA 病理變化過(guò)程中加速軟骨基質(zhì)降解和促使關(guān)節(jié)軟骨退變的最重要的兩種細(xì)胞因子[2]，是炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑。1983年Wood等首先報(bào)道了在骨性關(guān)節(jié)炎和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中檢測(cè)到了高水平的IL-1，提出IL-1 可能直接參與了骨關(guān)節(jié)炎的病理增生過(guò)程。在隨后的研究中，有更多學(xué)者證實(shí)了Wood的觀點(diǎn)，并進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞因子的活性與關(guān)節(jié)軟骨的破壞嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。IL-1 為17KDb 的細(xì)胞因子，主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，也能由中性粒細(xì)胞合成，分為膜結(jié)合型（IL-1α）和可溶型（IL-1β）兩種。IL-1 多存在于血液和組織中，它在OA 中主要參與刺激前列腺炎等介質(zhì)釋放，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子受體表達(dá)，以及促進(jìn)膠原酶和其他中性蛋白酶合成，從而增強(qiáng)滑膜和滑液內(nèi)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)滑膜細(xì)胞增生正常狀態(tài)下保持平衡；失衡時(shí)，產(chǎn)生免疫病理反應(yīng)[3-6]。有研究證明IL-1是炎癥調(diào)節(jié)的始動(dòng)因素，與受體（IL-1RI）結(jié)合后形成復(fù)合物，繼而發(fā)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致NO、PGE2、IL-6、IL-8以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)水平增高，從而介導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，合成II型膠原和蛋白多糖的能力損害，以及軟骨基質(zhì)降解[7-8]。

3.2 TNF-α 在OA 病程中的作用

TNF-α 是體內(nèi)炎癥細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，是復(fù)合體，具有多種生物學(xué)活性。在骨性關(guān)節(jié)炎滑液中TNF-α 是最早出現(xiàn)的細(xì)胞因子，而且影響關(guān)節(jié)軟骨的降解過(guò)程[9]。TNF-α 可通過(guò)直接與破骨細(xì)胞前體上的TNFR-1 結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的成熟，或者使間充質(zhì)細(xì)胞上的巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）表達(dá)增加，進(jìn)一步誘導(dǎo)破骨細(xì)胞發(fā)育成熟或破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)，導(dǎo)致骨質(zhì)吸收和骨質(zhì)破壞[10]。

本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到OA 模型中的血清IL-1β和TNF-α含量都升高,與其他研究結(jié)果一致,采用臭氧進(jìn)行局部治療的血清IL-1β和TNF-α含量的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這也說(shuō)明臭氧的局部應(yīng)用并沒(méi)有對(duì)這兩種細(xì)胞因子的產(chǎn)生起到抑制或降低其含量的作用。臭氧對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制,仍需進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。

活血止痛膠囊治療的血清IL-1β和TNF-α含量的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這可能是活血止痛膠囊通過(guò)降低骨關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α 的含量,從而降低關(guān)節(jié)的局部炎癥反應(yīng)、消腫鎮(zhèn)痛等作用。這些可能與藥物中當(dāng)歸、三七、土鱉蟲(chóng)等成分具有抗炎、止痛作用有關(guān)。

[1]吳雷，黃朝梁.骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯窟M(jìn)展.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007,23(12):1742.

[2]Sandra K,Leo AB,T,Al i son MB,et al.Different roles of tumour necrosi.factor a and interleukin-1 in murine strep-tococcalcellwalkarthritis.[J]Cytokine,1998,10:690-702.

[3]Baggioline M,Dewald B,Moswv B.IL-8 and related chemotactic cytokines CXC and Chemokines.Adv Immunol,1994,55:97-179.

[4]Nishimura A,A kahoshi T,Takahashi M,etal.Attenuation of monosodium urate crystal induced arthritis in rabbits by neuralizingantibody against IL-8.J leukoc Biol,1997,62:441-449.

[5]DinarelloCA.IL-1andIL-1antagonisM.Blood,1991,77:1627-1652.

[6]Wahl SM,Allen JB,Wong HL,etal.Antagonistic and agonistic effects of trans for minggrowthfactor-βandIL-1inrheumatoid synovium.J Immunol,1990,45:2514-2519.

[7]Femandes JC,Martel-Pelletier J,Pelletier JP.The role ofcytokines in osteoarthritis pathophysiology[J].Biorheology,2002,39(12):237-246.

[8]Abramson SB,Attur M,Amin ar,et al.Nitric oxide and inflammatory mediators in the perpetuation of osteoarthritis[J].Curr Rheumatol Rep,2001,3(6):535-541.

[9]17.Venn G,Nietfeld JJ,Duits AJ,et al.Elevated synovial fluid levels of interleukin-6 and tumor necrosis factor associated with early experimental canine osteoarthritis[J].Arthriti、Rheum,1993 Jun;36(6):819-826.

[10]Herman S,Kronke G,Schett G.Molecular mechanisms of inflammatory bondamage:emerging targets for therapy[J].Trends Mol Med，2008 Jun;14(6)245-253.