李永輝，王佩香，陳俊，趙麗，丁崗，蕭偉*

（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口 571101）

中藥工業(yè)

復(fù)方南星止痛膏的頂空氣相色譜指紋圖譜研究

李永輝1，2，王佩香1，陳俊1，趙麗1，丁崗1，蕭偉1*

（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571101）

目的：建立復(fù)方南星止痛膏的頂空氣相指紋圖譜，全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量。方法：采用氣相色譜法，色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25mm，0.25μm），載氣為氮?dú)?，流速?mL·min－1，分流比：5∶1，F(xiàn)ID檢測(cè)器，程序升溫，頂空進(jìn)樣。并對(duì)10批復(fù)方南星止痛膏揮發(fā)性成分指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算。結(jié)果：10批復(fù)方南星止痛膏指紋圖譜中有6個(gè)共有峰，各峰分離度良好，樣品間相似度均大于0.95。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于復(fù)方南星止痛膏的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

復(fù)方南星止痛膏；氣相色譜；指紋圖譜

復(fù)方南星止痛膏是由肉桂、丁香、冰片、樟腦等12味藥材組成的中藥復(fù)方制劑，具有散寒除濕，活血止痛的功效。用于治療寒濕瘀阻所致的關(guān)節(jié)疼痛，腫脹，活動(dòng)不利，遇寒加重等［1］。該制劑為江蘇南星藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品（國(guó)藥準(zhǔn)字Z10970019），目前復(fù)方南星止痛膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有含量測(cè)定研究，未對(duì)其制劑進(jìn)行指紋圖譜研究［2］。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評(píng)價(jià)中藥制劑質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，以指紋圖譜作為中藥制劑的質(zhì)量控制方法，已成為目前行業(yè)的共識(shí)［3-5］。考慮到制劑中含有大量的揮發(fā)性藥材，采用氣相色譜進(jìn)行了復(fù)方南星止痛膏的指紋圖譜研究，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，能有效地控制該制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試劑

Agilent6890系列GC色譜儀，含7694E頂空進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱、FID檢測(cè)器等單元。安捷倫HP-5MS柱（30 m×0.25mm，0.25μm），樟腦對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110747-200507，供含量測(cè)定用）；復(fù)方南星止痛膏（江蘇南星藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)100416，100417，100418，100419，100420，100421，100422，100423，100424，100425，分別編號(hào)S1～S10）。甲醇、甲基硅油均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

頂空條件：樣品加熱溫度120℃，定量環(huán)溫度135℃，傳輸線溫度150℃；樣品加熱時(shí)間40 min，加壓時(shí)間0.2 min，定量環(huán)填充時(shí)間0.5 min，定量環(huán)平衡時(shí)間0.05 min，進(jìn)樣時(shí)間1.0 min。

色譜條件：程序升溫起始溫度為100℃，保持3 min，以2℃·min－1的速率升至130℃，以30℃·min－1的速率升至230℃，保持2 min。流速：1mL·min－1；分流比：5∶1；FID檢測(cè)；記錄時(shí)間：20 min。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取樟腦對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為1 mg·mL－1的溶液，即得參照物儲(chǔ)備液。精密吸取80μL參照物儲(chǔ)備液，置20mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入200 mg甲基硅油，壓蓋密封，80℃加熱10 min，超聲混勻，作為參照物樣品。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取復(fù)方南星止痛膏5 mg，置20mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入200mg甲基硅油，壓蓋密封，80℃加熱10 min，超聲混勻，作為供試樣品。

2.4 測(cè)定方法

分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，注入氣相色譜儀，按上述色譜條件操作，考察80 min內(nèi)供試品溶液的色譜分離情況，記錄20 min色譜圖。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 按照2.3供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備樣品，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5針，記錄色譜圖，以樟腦為參照峰，計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)面積，結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.03%；相對(duì)峰面積 RSD均小于3.72%，表明儀器精密度符合要求。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為100416的復(fù)方南星止痛膏，按2.3供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備供試品，分別于0，2，4，6，8 h進(jìn)樣考察其穩(wěn)定性，以樟腦為參照峰，計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)面積，結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.09%；相對(duì)峰面積RSD均小于3.55%，結(jié)果表明供試品樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為100416的復(fù)方南星止痛膏，按2.3供試品溶液的制備項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行分析，以樟腦為參照峰，計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)面積，結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.12%；相對(duì)峰面積RSD均小于4.24%，結(jié)果表明本試驗(yàn)方法的重復(fù)性符合要求。

2.6 指紋圖譜的建立［6］

2.6.1 共有指紋峰的標(biāo)定 采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共有指紋峰，以圖譜中樟腦色譜峰為參照峰（S），將各色譜峰保留時(shí)間與同一圖譜中參照峰的保留時(shí)間比較，其比值為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算10批樣品指紋圖譜中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，見表1。其中6個(gè)色譜峰為各樣品所共有，故標(biāo)定它們?yōu)楣灿兄讣y峰。

表1 共有指紋峰的保留時(shí)間

2.6.2 共有峰的相對(duì)峰面積 以圖譜中樟腦峰（2號(hào)峰）為參照峰，將各色譜峰峰面積與同一圖譜參照峰的峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對(duì)峰面積。見表2。

2.6.3 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 采用中國(guó)藥典委員會(huì)出版的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)》軟件（2004年 A版）進(jìn)行相似度計(jì)算。設(shè)置批號(hào)為100416的樣品圖譜為參照?qǐng)D譜，對(duì)照?qǐng)D譜生成方法采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.10，多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，生成對(duì)照指紋圖譜（S），見圖1～2。結(jié)果10批制劑的相似度均在0.99以上，表明建立的指紋圖譜的技術(shù)穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。見表3。

2.6.4 主要GC色譜峰的確認(rèn) 運(yùn)用對(duì)照品對(duì)比和GC-MS的分析方法，對(duì)2，3，4號(hào)主要色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)，結(jié)果顯示3個(gè)化合物分別為樟腦、異龍腦和龍腦，其質(zhì)譜碎片分別為樟腦（152，108，95，81，69，55），異龍腦（136，121，110，96，82，67，55）和龍腦（139，121，110，96，91，67，55）。

圖1 10批復(fù)方南星止痛膏GC指紋圖譜

圖2 復(fù)方南星止痛膏的對(duì)照指紋圖譜

表3 相似度計(jì)算結(jié)果

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱的選擇

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察了HP-INWAX色譜柱和HP-5MS柱，HP-INWAX柱對(duì)龍腦和異龍腦的分析效果較好，但是其他色譜峰數(shù)小于HP-5MS柱。綜合考慮，所以本文選擇了HP-5MS柱進(jìn)行指紋圖譜研究。

3.2 頂空溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)嘗試了正丁醇、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、水分別作為復(fù)方南星止痛膏的溶劑，結(jié)果正丁醇、二甲基亞砜和N，N-二甲基甲酰胺的溶劑峰較高，水為溶劑的信號(hào)峰較小。而采用高沸點(diǎn)的甲基硅油為溶劑，可以有效減少溶劑峰的氣化，同時(shí)隨著溫度上升，樣品峰的峰面積也增加較多，各組分能夠良好分離，色譜圖包含的色譜峰信息多。

3.3 頂空加熱溫度和時(shí)間的選擇

確定甲基硅油為頂空溶劑后，我們對(duì)加熱溫度分別選擇了100，120，140，160℃，加熱時(shí)間選擇20，40，60 min進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示加熱溫度超過(guò)120℃時(shí)，峰面積增加較少，但儀器精密度偏差大于10%，因此我們選擇了120℃作為加熱溫度。加熱時(shí)間考察結(jié)果顯示，加熱40 min后，峰面積不再有顯著的增加，所以選擇加熱時(shí)間為40 min。

3.4 其他

10批復(fù)方南星止痛膏的相似度均超過(guò)0.95，說(shuō)明復(fù)方南星止痛膏的生產(chǎn)工藝較穩(wěn)定。該方法可以用于復(fù)方南星止痛膏的質(zhì)量控制。然而在指紋圖譜相似度計(jì)算中使用的是相對(duì)峰面積比值，相似性代表的是圖譜中對(duì)應(yīng)峰比例的一致性，基本不受整體濃度的影響，因此評(píng)價(jià)藥材、中間體和制劑的質(zhì)量時(shí)，還應(yīng)該參考質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定項(xiàng)。

［1］談瑩瑩.復(fù)方南星止痛膏外治膝骨關(guān)節(jié)炎寒濕痹阻證的臨床示范性研究［D］.南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

［2］殷書梅，王宓，林新艷，等.UPLC法測(cè)定復(fù)方南星止痛膏中馬兜鈴酸A的含量［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（5）：396-397.

［3］劉小花，沈孝麗，石義凱，等.參橘止咳滴丸的指紋圖譜研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2012，26（1）：75-78.

［4］顏月園，蕭 偉，吳云，等.散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊中皂苷類成分的指紋圖譜研究［J］.中草藥，2012，43（3）：496-500.

［5］陳華，李嵐，陳小榮，等.健胃消食片HPLC指紋圖譜研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（5）：79-82.

［6］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）［S］.2000.

Fingerprint Chromatogram Analysis of Fufang Nanxing Zhitong Gao by Headspace GC

LIYong-hui，WANG Pei-xiang，CHEN Jun，ZHAO Li，DING Gang，XIAOWei
（1.Jangsu Kanion Pharmaceutical Co.，Ltd.，Lianyungang 222001，China；2.School of Pharmacy，Hainan Medical University，Haikou 571101，China）

Objective：To establish a headspace GC fingerprint chromatogram for analysis volatile compounds of Fufang Nanxing Zhitong Gao，and evaluated its quality.MethodsThe sample was conducted by GC with HP-5 column（30 m×0.25mm，0.25μm）.The carrier gas was N2at the flow rate of 1.0mL·min－1.Split ratio was 5∶1.The detection was FID.Ten batches of Fufang Nanxing Zhitong Gao was calculated to their similarity.Results：Six main peakswere clearly separated in 20 min.The similarity of ten batches was over 0.95.Conclusion：The headspace GC fingerprint chromatogram is successfully used on analysis and quality control of Fufang Nanxing Zhitong Gao.

Fufang Nanxing Zhitong Gao；GC；Fingerprint

* ［通訊作者］蕭偉，E-mail：kanionxw2010＠126.com

2012-05-18）