黃博，伍丕娥，周娟，卿艷，盧道會(huì)，趙文吉，李敏*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室，四川 成都 611137；2.四川省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川 成都 611731）

中藥科技

姜黃及其3種近源品種的姜黃素類成分薄層色譜鑒別及HPLC特征圖譜分析△

黃博1，伍丕娥2，周娟2，卿艷2，盧道會(huì)1，趙文吉1，李敏1*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室，四川 成都 611137；2.四川省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川 成都 611731）

目的：鑒別分析姜黃及其3種近源品種（蓬莪術(shù)、溫莪術(shù)、廣西莪術(shù)）的姜黃素類成分。方法：以姜黃對(duì)照藥材，姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素對(duì)照品為對(duì)照進(jìn)行薄層色譜鑒別；以姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素對(duì)照品為對(duì)照物質(zhì)，采用HPLC對(duì)10批姜黃進(jìn)行特征圖譜研究，建立HPLC特征圖譜共有模式，進(jìn)行相似度比較，并將姜黃與3種近源品種進(jìn)行相似度比對(duì)。色譜條件：采用月旭AQ-C18（200mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以乙腈－水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，柱溫30℃。結(jié)果：供試品色譜中，姜黃與3種莪術(shù)的斑點(diǎn)位置、顏色、數(shù)量有明顯差別；建立了姜黃的HPLC特征圖譜，確定了7個(gè)共有峰，10批姜黃藥材樣品的平均相似度在0.97，姜黃與3種近源品種的相似度均低于0.8，特征圖譜差異明顯。結(jié)論：姜黃及其3種近源品種的薄層色譜及HPLC特征圖譜差異明顯，且方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可作為姜黃及其3種近源品種的鑒別，同時(shí)也為姜黃對(duì)照藥材標(biāo)定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)。

姜黃；蓬莪術(shù)；溫莪術(shù)；廣西莪術(shù)；薄層色譜法；高效液相特征圖譜

姜黃素是姜科植物姜黃根莖提取物中的一種酚類化合物，具有抗炎性反應(yīng)、抗血小板聚集、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、降血脂等多方面的藥理作用［1］。姜黃素也是天然黃色色素，具有良好的染著性和分散性，廣泛應(yīng)用于食品及紡織行業(yè)［2-4］。在我國用姜黃屬植物根莖入藥的主要有姜黃Curcuma longaL、溫莪術(shù)Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling、蓬莪術(shù) Curcuma phaeocaulis Val.和廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang 4種，這4種姜黃屬植物根莖中均含有姜黃素。20世紀(jì)20年代以來，各國學(xué)者對(duì)這4種藥材做了大量的研究，主要集中在化學(xué)成分分離鑒定和含量測(cè)定方面。筆者首次建立了姜黃的HPLC特征圖譜，通過TLC和HPLC鑒別并有效區(qū)分了國產(chǎn)4種姜黃屬植物的根莖，為姜黃及其3種近源品種（溫莪術(shù)、蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)）的分析、鑒別提供了可靠依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

瑞士卡瑪CAMAG Linomat 5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀；CAMAG REPROSTAR薄層照相儀；Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng)，島津十萬分之一電子天平，Brasson超聲波清洗儀；KQ-100超聲波清洗儀。安捷倫1200液相色譜系統(tǒng)：包括1200泵，DAD檢測(cè)器，waterse 2695液相色譜儀，waterse 2998檢測(cè)器。硅膠G薄層鋁箔板（天津斯利達(dá)，20cm×10cm）。

1.2 材料

姜黃對(duì)照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121108-200502），姜黃素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110823-200603），去甲氧基姜黃素對(duì)照品（成都思科華生物技術(shù)有限公司，按98.0%計(jì)算），雙去甲氧基姜黃素對(duì)照品（成都思科華生物技術(shù)有限公司，按98.0%計(jì)算）。甲醇、乙醇、乙酸乙酯等試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），HPLC用甲醇、乙腈均為進(jìn)口色譜純?cè)噭?/p>

姜黃、溫莪術(shù)、蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)的樣品收集情況見表1，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定為正品。

表1 姜黃及3種近源品種樣品收集情況

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

取姜黃、蓬莪術(shù)、溫莪術(shù)、廣西莪術(shù)粉末各0.2 g，加無水乙醇20mL，振搖，放置30 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取姜黃對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素對(duì)照品，加無水乙醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 －甲醇 －甲酸（96∶4∶0.7）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，姜黃在與對(duì)照藥材色譜及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，姜黃與3種莪術(shù)的斑點(diǎn)位置、顏色、數(shù)量有明顯差別（圖1）。

2.2 HPLC特征圖譜方法研究

2.2.1 供試液的制備 取姜黃與3種莪術(shù)細(xì)粉0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中。精密加入甲醇10mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心。精密量取上清液1mL，置20mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻靜置，取上清液用0.45μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

圖1 姜黃及其近源品種薄層色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1mL含姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素0.5 mg的溶液作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 梯度洗脫條件 參照《中國藥典》2010年版一部中姜黃含量測(cè)定的流動(dòng)相及相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了篩選。最終確定采用乙腈－水梯度洗脫，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B。流動(dòng)相梯度洗脫條件見表2。0.996，0.971，相似度大于0.9，說明姜黃藥材特征圖譜相似度高。

表2 流動(dòng)相的梯度

圖2 10批姜黃特征色譜指紋圖譜共有模式（對(duì)照?qǐng)D譜）

2.2.4 色譜條件 采用月旭 AQ-C18（200mm×4.6mm，5μm）色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm；柱溫為30℃；流速為1.0mL·min－1；記錄時(shí)間：50 min。2.2.5特征圖譜的建立 取不同產(chǎn)地的姜黃（S1～S10）粉末（過二號(hào)篩），精密稱定，按選定的方法制備供試品溶液，精密吸取10μL，分別注入液相色譜儀，按確定的色譜條件測(cè)定，記錄50 min的HPLC圖，采用國家藥典委員會(huì) “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，將10個(gè)樣品的圖譜一起匹配并生成對(duì)照?qǐng)D譜，再將10個(gè)樣品測(cè)得的色譜峰與參照?qǐng)D譜進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成姜黃特征圖譜共有模式（即對(duì)照?qǐng)D譜，圖2），計(jì)算1～10號(hào)樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，分別為0.952，0.931，0.983，0.935，0.973，0.984，0.996，0.974，

2.2.6 特征峰的標(biāo)定 特征峰的標(biāo)定是在共有峰標(biāo)定的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，將藥材的指紋峰鎖定在8～40 min共有特征區(qū)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采取相對(duì)保留時(shí)間從10批樣品圖譜中選定7個(gè)主要共有峰作為姜黃對(duì)照藥材的特征峰（圖2）。經(jīng)過與混合對(duì)照品色譜圖（圖3）比對(duì)，確定S1號(hào)峰為雙去甲氧基姜黃素，S2號(hào)峰為去甲氧基姜黃素，S3號(hào)峰為姜黃素。10批姜黃中7個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間見表3。

圖3 混合對(duì)照品色譜圖

表3 特征峰的相對(duì)保留時(shí)間

姜黃藥材特征圖譜分析結(jié)果表明，10批姜黃藥材特征圖譜中呈現(xiàn)與參照物色譜峰相同的色譜峰，且相對(duì)保留時(shí)間均符合《中國藥典》規(guī)定。

2.2.7 姜黃及其近源品種特征圖譜比較 取姜黃、溫莪術(shù)、蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)的供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明蓬莪術(shù)有6個(gè)特征峰，溫莪術(shù)有8個(gè)特征峰，廣西莪術(shù)有6個(gè)特征峰，其中蓬莪術(shù)和溫莪術(shù)在18～19 min出現(xiàn)了姜黃所沒有的特征峰，廣西莪術(shù)在22～28 min僅有兩個(gè)特征峰。姜黃與3種近源品種莪術(shù)的相似度均低于0.8，特征圖譜差異明顯，結(jié)果見圖4。

圖4 姜黃及其近源品種特征圖譜比較

3 結(jié)論

4種姜黃屬植物的根莖（姜黃、溫莪術(shù)、蓬莪術(shù)和廣西莪術(shù)）中均含有姜黃素類成分，但含量差異較大。通過薄層色譜法觀察斑點(diǎn)的顏色、數(shù)量、位置可以快速地鑒別姜黃與其3種近源品種，試驗(yàn)表明該鑒別方法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確、靈敏、可行。首次建立了姜黃的HPLC特征圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版及B版對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，選取了7個(gè)特征峰構(gòu)成了姜黃的特征圖譜，結(jié)果表明其特征圖譜相似度高，獲得的HPLC特征圖譜能代表姜黃的基本特征，可明顯區(qū)別于蓬莪術(shù)、溫莪術(shù)、廣西莪術(shù)。綜上所述，利用TLC和HPLC可以有效地區(qū)分姜黃及其3種近源品種，結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可以應(yīng)用于姜黃及其近源品種的鑒別中，同時(shí)也為姜黃對(duì)照藥材標(biāo)定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］陽巍，廖端芳，庹勤慧.姜黃素抗動(dòng)脈粥樣硬化研究進(jìn)展［J］.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2012，32（1）：55-58.

［2］牛生洋，郝峰鴿，許秋亞，等.姜黃色的提取及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.河南科學(xué)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，36（4）：58-61.

［3］張保軍，李春林.天然姜黃素及其在果蔬飲料中的應(yīng)用［J］.飲料工業(yè)，2002，5（6）：38-40.

［4］張曉沖.姜黃素生理功能及其藥用前景［J］.中國醫(yī)藥指南，2012，10（2）：62-63.

Analysis Curcum inoids in Curcumae Longae Rhizoma and Its Three Near-source Species by TLC Identification and HPLC Fingerprint Chromatogram

HUANG Bo1，WU Pei-e2，ZHOU Juan2，QING Yan2，LU Dao-hui1，ZHAOWen-ji1，LIMin1
（1.Pharmacy School Chengdu university of TCM，Chengdu 611137，China；2.Sichuan Institute For Food and Drug Control，Chengdu 611137，China）

Objective：Researching Curcumae longae rhizoma and its three near-source species and Identificate the kinds of the curcuminoids.MetherdsTLC was used to identificate curcuminoids in Curcumae longae rhizoma and its three near-source species，with Curcumae longae rhizoma，Curcumine，Demethoxycurcumin，Diplo-demethoxycurcumin as reference substance.We established a HPLC fingerprint chromatogram to identificate the difference from near-source species.Results：The distinction of Curcumae longae rhizoma，and its three near-source species are obviously difference and can be identificated by TLC and HPLC fingerprint chromatogram.ConclusionThe identification methods were proved to be available and effective.

Curcumae longae Rhizoma；Curcuma phaeocaulis；Curcuma wenyujin；Curcuma kwangsiensis；TLC；HPLC

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目——“中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制和開發(fā)的技術(shù)平臺(tái)”——“標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性技術(shù)規(guī)范”（姜黃，2009ZX09308-001-3）

*［通訊作者］李敏，E-mail：028limin＠163.com

2012-05-02）