★ 曹運朝 梁新麗廖正根 趙國巍 招麗君 倪斌（江西中醫(yī)學院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室南昌 330004）

丹參為中國的傳統(tǒng)中藥，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品。Tan-ⅡA是從傳統(tǒng)的活血化淤類中藥丹參中提取的脂溶性有效成分，具有抗氧化、降低自由基水平、保護血管內皮細胞、抗動脈粥樣硬化形成、預防心絞痛與心肌梗塞及抗癌[1]，尤以治療冠心病及缺血性腦血管病最為常用[2]。由于Tan-ⅡA為脂溶性成分，無法直接注射給藥，乳劑[3]作為一種優(yōu)良的載體，可包載脂溶性藥物，輕易通過血腦屏障（BBB），達到治療腦部疾病的效果。本研究采用高速剪切法制備初乳，以Ke為考察指標，單因素篩選初乳的制備工藝；采用高壓均質機對初乳進行二次乳化，以Ke、平均粒徑、載藥量為考察指標，正交設計優(yōu)化Tan-ⅡA脂微球高壓均質的制備工藝。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；UV 2100 PC型紫外分光光度計（尤尼科上海儀器有限責任公司）；TG328A十萬分之一電子天平（德國Startorius公司）；Malvern納米粒度儀（英國馬爾文公司）；乳化機（FA25 model上海弗魯克流體機械制造有限公司）；HF6A型多頭磁力加熱攪拌器（常州國華電器有限公司）；高壓均質機（加拿大ATS公司）。

1.2 材料 注射用大豆油（LCT鐵嶺北亞藥用油有限公司，批號y11030103-2-01）；注射用中鏈脂肪酸甘油脂（MCT Lipoid，批號940031）；蛋黃卵磷脂（Lipoid E80，批號；20100021）；注射用油酸鈉（Lipoid sodium oleate B，批號204352-1）；注射用Tween-80（上海申宇醫(yī)藥化工有限公司）；注射用甘油（江西益譜生藥業(yè)有限公司，批號20100601）；泊洛沙姆F-68（珠海遠城醫(yī)藥化工公司）；Tan-ⅡA原料（西安昊軒生物有限公司，含量≥98%，批號DST-110105）；正辛醇（上海化學試劑公司）；甲醇（色譜純，德國Merk），水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 丹參酮ⅡA脂微球的評價方法

2.1 Tan-ⅡA含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex-C18，（4.6×150mm，5 μm）；流動相為甲醇：水=80：20；流速：1.0mL/分；檢測波長：270nm；柱溫：25℃ ；進樣量：20 μL。在上述色譜條件下，Tan-ⅡA對照品（A），空白脂微球（B），Tan-ⅡA脂微球（C）三色譜無干擾，見圖1。

圖1 Tan-ⅡA高效液相色譜圖

2.1.2 標準曲線的制備

精密稱取Tan-ⅡA對照品2.0mg，加甲醇定容至50mL的容量瓶中，得Tan-ⅡA濃度為44.8μg/mL的儲備液。精密量取Tan-ⅡA儲備液3mL置10mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，即得Tan-ⅡA濃度為13.44μg/mL，分別精密吸取13.44μg/mLTan-ⅡA對照品0.5、1、2、3、4、5、6mL加甲醇定容至10mL，配制成Tan-ⅡA對照品濃度分別為0.732 μg/mL、1.344μg/mL、2.688μg/mL、4.032μg/mL、5.376μg/mL、6.72μg/mL、8.064μg/mL的系列溶液。按“2.1.1”項下液相色譜條件，各對照品溶液分別進樣20 μL，測定峰面積。以峰面積（A）為縱坐標，溶液濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，其回歸方程如下：A=121.46C-1.4275，r=0.9998，線 性 范 圍 為 0.732～8.064μg/mL。

2.1.3 精密度實驗

分別用3種濃度的Tan-ⅡA供試品溶液（0.732、4.032、8.064μg/mL），在上述色譜條件下進樣20μL，1天內重復進樣5次，連續(xù)進樣5天，記錄Tan-ⅡA的峰面積。結果日內RSD分別為1.310%、0.374%和1.061%（n=5）日間RSD分別為2.192%、1.493%和1.1828（n=5），表明方法精密度良好。

2.1.4 回收率實驗

取濃度分別為（0.732、4.032、8.064μg/mL）Tan-ⅡA供試品溶液各5份，在上述色譜條件下進樣，每次進樣20 μL，測定Tan-ⅡA的峰面積，根據(jù)標準曲線計算Tan-ⅡA的濃度，以測定濃度與配制濃度之比計算回收率。高、中、低3個濃度的回收率為95.78%-105.7%，RSD為2.34%-4.43%。

2.2 離心穩(wěn)定性

乳劑的物理穩(wěn)定性變化表現(xiàn)為分層、析油等現(xiàn)象。將乳劑在一定轉速下離心一段時間，對乳劑的影響相當于自然靜置較長時間產(chǎn)生的影響，因此用離心分光光度法測得的穩(wěn)定性常數(shù)Ke可作為評價乳劑物理穩(wěn)定性的一個指標[4]。方法：將初乳劑2mL置于離心管中以1000r/分離心3分鐘，終乳以3000r/分離心10分鐘，用微量進樣器精密量取試管底部110uL至100mL容量瓶中，用過0.22μm微孔濾膜的蒸餾水稀釋定容，以蒸餾水為空白，用紫外-可見分光光度計在可見區(qū)500nm處測定吸收度n（=3），記為A。同法將未離心的乳劑在相同波長下測定吸收度（n=3），記為Ao。按以下方法計算乳劑穩(wěn)定性參數(shù)Ke：

公式中Ke為乳劑的穩(wěn)定性常數(shù)。Ke值越小，說明分散的乳滴在離心力的作用下上浮的越少，表示此乳劑越穩(wěn)定，故可以用Ke值來評價乳劑的物理穩(wěn)定性。

2.3 乳劑粒徑及粒徑分布

制備粒徑小而均勻的分散系，是體系物理穩(wěn)定性良好的基本保證[5]。取Tan-ⅡA脂微球溶液適量，以雙蒸水稀釋200倍后，用納米粒度分析儀測定納米粒的平均粒徑及粒徑分布。

3 內容和結果

3.1 單因素考察丹參酮ⅡA脂微球初乳的制備工藝

參照丹參酮磺酸鈉注射液的臨床使用劑量40-80mg/次/日。參照參考文獻，規(guī)定本品的規(guī)格為0.7mg/mL。在實驗的基礎上，將本品的基本處方暫定為：LCT：MCT=1：1 20g，磷脂 1g，F(xiàn)-68 0.4g，Tween-80 0.2g，甘油2.25g，油酸鈉0.03g，注射用水加至100mL。

3.1.1 初乳兩相混合順序的篩選

固定如下因素水平：制備溫度70℃，攪拌速度10 000r/分，攪拌時間10分鐘。以Ke為考察指標，考察兩相混合方式和混合順序對Ke的影響。

稱取處方量的混合油相，70℃加入1g卵磷脂并充分攪拌使其全部溶解，然后加入70mgⅡA使其徹底溶解，即得油相；同時在水相中加入處方量的F-68、Tween-80、甘油、油酸鈉 ，使其充分溶解，70℃保溫即得水相。稱取工藝一：油相恒速緩慢加入到攪拌中的全部水相中，攪拌10分鐘。工藝二：恒速緩慢將油相加入到70%的水相中，剩余的30%的水相70℃恒溫，待初乳制備完成后再加入剩余的30%的水，考察制備中相比變化的影響。工藝三：將油相一次性加入水相中，然后再高速攪拌，與恒速緩慢加入相比較。工藝四：先將油相先加入攪拌器中，然后緩慢加入水相。工藝五：將70%的水相恒速緩慢加入攪拌中的油相中，待初乳成型后再加入剩余量的水相稀釋。按離心法評價工藝優(yōu)越。初乳制備結果見圖2。

圖2 油水兩相不同的加入順序和相比變化對Ke的影響

結果：工藝1和工藝4較好，但工藝1和4沒顯著性差異?？紤]在實際操作中水相比較多，油相較少，工藝4操作不便，故選擇工藝1。

3.1.2 攪拌速度和時間的選擇

按上述優(yōu)化工藝，改變轉速和時間，考察機械力度對離心穩(wěn)定性常數(shù)的影響。在參考文獻的基礎上[6]，先固定攪拌時間為10分鐘，考察攪拌速度對乳劑Ke的影響，結果見圖3。結果表明攪拌速度為13 000r/分穩(wěn)定性較好；根據(jù)優(yōu)化的工藝，固定攪拌速度，考察攪拌時間對乳劑Ke影響，結果見圖4，結果表明攪拌時間10、12、14分鐘對Ke影響不大，考慮到節(jié)約時間，故選擇10分鐘。

圖3 不同攪拌速度對Ke的影響

表4 不同攪拌時間對Ke的影響

3.2 正交設計優(yōu)化高壓均質工藝

以Tan-ⅡA脂微球的Ke、平均粒徑、載藥量為考察指標，選擇均質壓力（A）、均質次數(shù)（B）及初乳制備溫度（C）作為考察因素[7]，每個因素又設定三個水平，根據(jù)因素水平表，選擇正交表L9[4]進行實驗。為在統(tǒng)一標準下加權評分[8]，三項指標最佳的分別定為30、30和40分，規(guī)定離心穩(wěn)定性常數(shù)最小的即3.9為30分，其余各值以公式：30-（離心穩(wěn)定性常數(shù)-3.9）×2計分；規(guī)定粒徑最小的即273nm為30分，其余各值以公式：30-（粒徑-273）計分；規(guī)定載藥量最大的即692μg為40分，其余各值以公式：40-（692-載藥量）/10計分；最后將三個指標的分值之和作為該試驗的分值，并進行方差分析，結果見表1、2。

表1 高壓均質工藝正交實驗設計結果

表2 Tan-ⅡA脂微球工藝考察方差分析表

以綜合評分為考察指標，由表1、2可知因素A與C對試驗影響顯著，因素B對試驗結果影響不明顯。對于Tan-ⅡA脂微球較優(yōu)的高壓均質工藝為A2B1C3即80℃，70Mpa，高壓均質8次。

3.3 Tan-ⅡA脂微球制備工藝的驗證

稱取處方量的混合油相，80℃加入1g卵磷脂并充分攪拌使其全部溶解，然后加入70mgⅡA使其徹底溶解，即得油相；同時在水相中加入處方量的F-68、Tween-80、甘油、油酸鈉，使其充分溶解，80℃保溫即得水相。油相恒速緩慢加入到攪拌中的全部水相中，13 000r/分剪切10分鐘，即得初乳，初乳經(jīng)高壓均質機70Mpa，均質8次。測定脂微球Ke、粒徑、載藥量，數(shù)據(jù)見表3。

表3 工藝驗證數(shù)據(jù)

從重復實驗數(shù)據(jù)可得，用單因素及正交優(yōu)選的Tan-ⅡA脂微球制備工藝較為穩(wěn)定、重復性好。

4 討論

丹參酮ⅡA幾乎不溶于水，實驗測得丹參酮ⅡA在水中的溶解度小于5 μg/mL。文中將丹參酮ⅡA制成微乳后，其含量大于700 μg/mL，較為顯著地提高了丹參酮ⅡA的溶解度。

脂微球的基本制備工藝為“初乳制備”，再“高壓均質”，使脂肪乳的粒徑一般控制在300 nm左右。本文以穩(wěn)定性常數(shù)Ke為指標，研究了初乳的制備溫度、高速剪切的轉數(shù)、剪切時間對初乳穩(wěn)定性的影響，篩選了初乳的制備工藝。進一步采用正交設計，優(yōu)化初乳的二步高壓均質機勻化工藝，考察了高壓均質壓力、均質次數(shù)等工藝因素對乳劑穩(wěn)定性、粒徑、載藥量的影響，確定了丹參酮ⅡA脂微球的高壓均質工藝。

采用本實驗結果對丹參酮ⅡA脂微球工藝進行驗證，結果表明用單因素及正交優(yōu)選的Tan-ⅡA脂微球制備工藝較為穩(wěn)定、重復性好。

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