梁柳琴， 陳偉玲， 邱 茜， 詹鐘平， 葉玉津， 楊岫巖， 許韓師

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕內(nèi)科，廣東廣州510080)

T細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性作用?！安±硇曰罨钡腡細(xì)胞不僅啟動(dòng)B細(xì)胞多克隆活化和擴(kuò)增，導(dǎo)致高球蛋白血癥和自身抗體過(guò)度產(chǎn)生，而且還廣泛浸潤(rùn)到多種組織和臟器，如腎臟、皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和關(guān)節(jié)等，從而導(dǎo)致組織的慢性炎癥損傷和功能失調(diào)［1－2］。T細(xì)胞由外周血進(jìn)入臟器組織是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，包括循環(huán)中游離的T細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮和穿過(guò)內(nèi)皮向組織遷徙。如果能夠控制T細(xì)胞的遷徙過(guò)程，則有可能減輕狼瘡的臟器損害。Rho激酶(Rho kinase，ROCK)是小分子GTP酶RhoA信號(hào)下游的一個(gè)關(guān)鍵性蛋白，廣泛參與細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，特別對(duì)細(xì)胞骨架形成、黏附、遷移等細(xì)胞活動(dòng)具有關(guān)鍵的調(diào)控作用［3－4］。但ROCK是否參與SLE的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。為此，本文將研究SLE患者T細(xì)胞ROCK活性情況，并探討其對(duì)SLE患者T細(xì)胞黏附和遷移是否有調(diào)控作用，以期為SLE的治療尋找新思路。

材料和方法

1 研究對(duì)象

33例SLE來(lái)自于2005年6月至2010年10月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院和門(mén)診患者，均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1982年診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中女性27例，男性6例，所有患者均未用過(guò)或停用3個(gè)月以上激素和免疫抑制劑，SLE疾病活動(dòng)指數(shù)為5～18分。另設(shè)健康成年人12例作為健康對(duì)照組(healthy control，HC)，同時(shí)還有9例活動(dòng)性類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者作為對(duì)照。

2 外周血T細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

抽取患者和對(duì)照組外周靜脈血，采用RosettSep T細(xì)胞提取試劑盒(StemCell Technologies)分離T細(xì)胞，按廠(chǎng)家提供的實(shí)驗(yàn)步驟操作。用抗CD3單抗(BD PharMingen)在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)T細(xì)胞純度，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞純度均在95%以上。把分離得到的T細(xì)胞用RPMI－1640培養(yǎng)基和10%FBS(均購(gòu)自Gibco)培養(yǎng)待用。用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活性，細(xì)胞活性均超過(guò)95%。

3 提取細(xì)胞總蛋白

用冷1×PBS洗滌T細(xì)胞1次，加入50 μL SDS樣本裂解緩沖液 A(50 mmol/L Tris － HCl，pH 7.5，10 mmol/L MgCl2，500 mmol/L NaCl，1%Triton X －100，0.5%去氧膽酸鈉，0.1%SDS，1 mmol/L PMSF，10 mg/L亮抑肽酶，10 mg/L抑肽酶)，勻漿后置冰上，超聲粉碎10～15 s，于95～100℃煮5 min，然后置冰上;4℃ 12 000 r/min離心5 min，吸取上清，分裝儲(chǔ)存于－20℃。

4 ROCK活性檢測(cè)

因?yàn)榧∏虻鞍琢姿崦赴衼喕?(myosine phosphatase target subunit 1，MYPT1)是ROCK的主要底物之一，其磷酸化被認(rèn)為是ROCK活化的重要標(biāo)志，所以ROCK活性用磷酸化MYPT1蛋白表達(dá)來(lái)表示。本文采用免疫印跡法檢測(cè)磷酸化MYPT1蛋白表達(dá)。

5 免疫印跡法

把樣品蛋白于95～100℃煮5 min，然后等量上樣于15%SDS－PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，開(kāi)始電壓為90 V，溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠層時(shí)調(diào)至120 V，待溴酚藍(lán)接近至凝膠底部時(shí)停止電泳(電泳緩沖液為1×Tris－甘氨酸緩沖液，pH 7.9)，用轉(zhuǎn)移緩沖液把凝膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上，膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，然后膜與不同濃度Ⅰ抗(磷酸化 MYPT1為1∶500，β －肌動(dòng)蛋白為1∶2 000，均購(gòu)自Santa Cruz)于4℃孵育過(guò)夜，接著膜在室溫下與Ⅱ抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG，1∶2 000，購(gòu)自Santa Cruz)孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液顯影，最后將結(jié)果進(jìn)行圖像分析，計(jì)算吸光度(A)值，ROCK活性以磷酸化MYPT1 A值與β－肌動(dòng)蛋白A值之比表示。

6 T細(xì)胞黏附能力測(cè)定

T細(xì)胞(5×105)懸浮于300 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，然后種植于包被有2 g/L透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA，購(gòu)自Sigma－Aldrich)的24孔培養(yǎng)板，置37℃孵育15、30和60 min。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，部分組別細(xì)胞用Y27632(20 μmol/L，購(gòu)自Chemicon)預(yù)處理30 min。孵育后，培養(yǎng)板用PBS沖洗3次，然后在顯微鏡(×100)下計(jì)數(shù)黏附細(xì)胞。所有樣本均設(shè)復(fù)孔。

7 T細(xì)胞遷移能力測(cè)定

T細(xì)胞的趨化性遷移實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室(直徑6.5 mm，孔徑5 μm，購(gòu)自Costar)。T 細(xì)胞(5 ×105)懸浮于100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，種植于包被有2 g/L HA的Transwell小室濾網(wǎng)，置37℃孵育包被有2 g/L HA(購(gòu)自Sigma－Aldrich)的24孔培養(yǎng)板，置37℃孵育30 min。把含有80 μg/L CXCL12(購(gòu)自R＆D systems)的無(wú)血清培養(yǎng)基加至Transwell的下室，然后再于37℃孵育2 h。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，部分組別細(xì)胞用Y27632(20 μmol/L)預(yù)處理30 min。最后對(duì)遷移至下室的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。所有樣本均設(shè)復(fù)孔。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SLE患者外周血T細(xì)胞ROCK活性的檢測(cè)

新鮮分離、未行體外培養(yǎng)的SLE患者T細(xì)胞ROCK活性顯著高于正常對(duì)照組和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，提示SLE患者體內(nèi)外周血T細(xì)胞中ROCK活性異常增高，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Measurement of ROCK activity in T cells from healthy control(HC)，rheumatoid arthritis(RA)and systemic lupus erythematosus(SLE)patients.T cells were isolated by RosettSep T cell purification kit.ROCK activity was assessed by evaluating p－MYPT1 with Western blotting analysis.ˉx±s.*P＜0.05 vs HC or RA.圖1 SLE患者外周血T細(xì)胞ROCK活性的檢測(cè)

2 SLE患者外周血T細(xì)胞體外黏附能力的檢測(cè)

如圖2所示，新鮮分離的SLE患者外周血T細(xì)胞體外黏附于HA包被膜的能力顯著高于RA患者和正常對(duì)照組。

Figure 2.Detection of in vitro adhesion of T cells from healthy control(HC)，rheumatoid arthritis(RA)and systemic lupus erythematosus(SLE)patients.ˉx±s.*P＜0.05 vs HC or RA.圖2 SLE患者外周血T細(xì)胞體外黏附能力的檢測(cè)

3 SLE患者外周血T細(xì)胞體外遷移能力的檢測(cè)

如圖3所示，在趨化因子CXCL12(80 μg/L)的誘導(dǎo)下，SLE患者外周血T細(xì)胞體外遷移的能力亦顯著高于RA患者和正常對(duì)照組。

Figure 3.Detection of migration of T cells from healthy control(HC)，rheumatoid arthritis(RA)and systemic lupus erythematosus(SLE)patients.Purified T cells were plated on the top chamber of a Transwell apparatus and incubated with serum－free RPMI－1640 medium for 30 min.Then RPMI－1640 supplemented with 80 μg/L CXCL12 was added into the lower chamber and incubated for 2 h at 37℃.ˉx±s.*P＜0.05 vs HC or RA.圖3 SLE患者外周血T細(xì)胞體外遷移能力的檢測(cè)

4 SLE患者T細(xì)胞黏附和遷移能力與SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLE disease activity index，SLEDAI)的相關(guān)性分析

如表1所示，SLE重度(SLEDAI＞15)活動(dòng)組T細(xì)胞黏附和遷移能力均高于輕度(SLEDAI≤9)和中度(SLEDAI 10～15)活動(dòng)組，但輕度和中度活動(dòng)之間則無(wú)顯著差異。

表1 不同疾病活動(dòng)度SLE患者T細(xì)胞黏附和遷移能力的比較Table 1.Comparison of adhesion and migration of T cell from SLE patients with different disease activity(ˉx±s)

5 ROCK抑制劑對(duì)SLE患者T細(xì)胞黏附能力的影響

用ROCK特異性抑制劑Y27632(20 μmol/L)預(yù)處理SLE患者T細(xì)胞30 min，然后檢測(cè)其黏附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y27632對(duì)SLE患者T細(xì)胞的體外黏附能力有顯著抑制作用，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Inhibitory effect of Y27632 on adhesion of T cells from SLE patients.ˉx±s.n=9.*P＜0.05 vs non－treatment.圖4 ROCK抑制劑Y27632對(duì)SLE患者T細(xì)胞黏附的影響

6 ROCK抑制劑對(duì)SLE患者T細(xì)胞遷移的影響

用ROCK特異性抑制劑Y27632(20 μmol/L)預(yù)處理SLE患者T細(xì)胞30 min，然后在CXCL12誘導(dǎo)下進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y27632顯著抑制SLE患者T細(xì)胞遷移，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Inhibitory effect of Y27632 on migration of T cells from SLE patients.T cells were treated with 20 μmol/L Y27632 for 30 min.Chemotactic migration of T cells was measured as described in the legend of figure 3.ˉx±s.n=9.*P＜0.05 vs non－treatment.圖5 ROCK抑制劑Y27632對(duì)SLE患者T細(xì)胞遷移的影響

討 論

SLE是一種可出現(xiàn)多臟器損害的慢性炎癥性疾病，在受損的組織和臟器中出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中T細(xì)胞是主要的浸潤(rùn)細(xì)胞。浸潤(rùn)的T細(xì)胞直接或間接地參與局部的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致SLE的臟器功能障礙。局部浸潤(rùn)的T細(xì)胞主要來(lái)源于外周循環(huán)系統(tǒng)，外周血中的T細(xì)胞遷徙至局部組織要經(jīng)過(guò)一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，除了與血管內(nèi)皮功能改變有關(guān)外，T細(xì)胞本身功能如黏附、遷移能力改變也起著關(guān)鍵作用。已有報(bào)道SLE患者T細(xì)胞黏附能力較正常人明顯升高［5－6］。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者外周血T細(xì)胞體外黏附和遷移能力顯著高于RA患者和正常對(duì)照組，提示SLE出現(xiàn)臟器炎癥損害與其T細(xì)胞的黏附和遷移能力異常有關(guān)，如能抑制T細(xì)胞的異常黏附和遷移可能有利于控制狼瘡的臟器損害。

Rho家族蛋白是小分子GTP酶，具有廣泛的生物學(xué)功能，特別在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面具有重要作用。作為RhoA下游的關(guān)鍵信號(hào)蛋白，ROCK在轉(zhuǎn)導(dǎo)Rho通路活化信息方面起到舉足輕重的作用［7］。

近年研究發(fā)現(xiàn)，ROCK在介導(dǎo)外周血白細(xì)胞的黏附和遷徙方面起著重要作用。單核細(xì)胞中RhoA的過(guò)度活化可使其黏附和跨內(nèi)皮遷移能力明顯增強(qiáng)，而Y27632能顯著抑制這種能力［8］。相似地，Y27632也抑制單核細(xì)胞趨化因子－1(MCP－1)誘導(dǎo)的白細(xì)胞遷移［9］。利用轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)，敲除ROCK1基因小鼠的白細(xì)胞黏附和遷移能力顯著下降，血管壁中浸潤(rùn)的白細(xì)胞明顯減少［10］。上述研究提示，抑制ROCK活化可能對(duì)調(diào)控外周血白細(xì)胞參與的局部組織炎癥具有重要作用。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SLE患者新鮮分離的外周血T細(xì)胞ROCK活性顯著高于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和正常對(duì)照組，提示ROCK可能參與SLE的發(fā)病機(jī)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ROCK特異性抑制劑Y27632對(duì)SLE患者T細(xì)胞的體外黏附和遷移均有顯著抑制作用，提示SLE患者T細(xì)胞中異常活化的ROCK可能是其T細(xì)胞發(fā)生異常黏附和遷移的關(guān)鍵調(diào)控因素之一。如上所述，T細(xì)胞在SLE的發(fā)病和臟器損害中具有舉足輕重的作用，外周血中T細(xì)胞黏附和遷徙能力的強(qiáng)弱對(duì)T細(xì)胞能否遷徙到臟器并在局部大量浸潤(rùn)從而引起炎癥反應(yīng)起到關(guān)鍵作用，通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞遷移的關(guān)節(jié)靶點(diǎn)有利于抑制局部臟器的炎癥損害，因此，本文的研究結(jié)果有可能為防治SLE提供新的思路。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血T細(xì)胞中ROCK處于異常活化狀態(tài)，通過(guò)抑制ROCK活化能抑制T細(xì)胞的黏附和遷移，ROCK通路很可能是調(diào)節(jié)SLE T細(xì)胞局部臟器浸潤(rùn)的新靶點(diǎn)，抑制該通路活性可能有利于SLE的治療。但ROCK調(diào)控SLE T細(xì)胞黏附和遷移的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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