過華蕾， 廖麗貞， 陳燕玲， 吳偉康

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東廣州510080)

衰老是一種正常的生物學(xué)現(xiàn)象，衰老的過程伴隨著氧化損傷的增強(qiáng)，增殖阻滯，端粒酶縮短等。因而隨著衰老的發(fā)生，各種年齡相關(guān)疾病的發(fā)病率大大增加，特別是心血管疾病。細(xì)胞是組成生物體的基本單位，細(xì)胞衰老引起組織器官的功能喪失，最終引致生物的衰老［1－2］。心肌細(xì)胞的衰老伴隨著心肌收縮力下降，心輸出量減少，最終導(dǎo)致心功能障礙，心血管疾病發(fā)生。建立細(xì)胞水平的衰老模型對(duì)于我們研究衰老以及尋找對(duì)抗衰老的方法都具有重要意義。目前，細(xì)胞水平的衰老模型有體外傳代法、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)法、過氧化物誘導(dǎo)法、D－半乳糖誘導(dǎo)法等［3］。

細(xì)胞外高D－半乳糖環(huán)境可以使細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度升高，D－半乳糖在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇，這種物質(zhì)不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、代謝紊亂、功能喪失，最終引起衰老。此外，D－半乳糖代謝過程中產(chǎn)生的自由基也可以促進(jìn)衰老的發(fā)生。D－半乳糖作為促老劑已在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，王琳等［3－4］研究發(fā)現(xiàn)D－半乳糖對(duì)體外原代心肌細(xì)胞擬衰老作用，為本實(shí)驗(yàn)造模提供了理論依據(jù)。Dimri等［5］首次提出β－半乳糖苷酶可作為一種鑒定衰老的生物學(xué)指標(biāo)。近年來，衰老相關(guān)的β－半乳糖苷酶染色已成為一個(gè)公認(rèn)指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于衰老的檢測。

白藜蘆醇(resveratrol)是一種廣泛存在于葡萄皮、花生、虎杖、藜蘆、決明等植物中的多酚類化合物。它具有許多生物學(xué)作用，包括抗癌、保護(hù)心血管系統(tǒng)、保護(hù)缺血后的腦損傷、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗衰老等［6］。然而，白藜蘆醇對(duì)衰老的原代心肌細(xì)胞的效應(yīng)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用D－半乳糖建立體外心肌細(xì)胞衰老模型，通過衰老、自由基和自噬相關(guān)指標(biāo)的檢測，探討白藜蘆醇對(duì)衰老心肌細(xì)胞影響及其可能的機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

SD乳鼠(出生3 d以內(nèi)，雌雄不限)，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 主要試劑

DMEM(低糖)培養(yǎng)基和M199培養(yǎng)基為杭州吉諾生物公司產(chǎn)品，胎牛血清和馬血清為HyClone產(chǎn)品，Ⅱ型膠原酶為Gibco產(chǎn)品。D－半乳糖、熒光素二(β－D－吡喃半乳糖苷)［fluorescein di(β－D－galactopyranoside)，F(xiàn)DG］、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和單克隆小鼠β－actin抗體均購自Sigma。β－半乳糖苷酶染色試劑盒和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule－related protein 1 light chain 3，LC3)抗體購自CST。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒和細(xì)胞丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。抗鼠及抗兔的連接辣根過氧化物酶的IgG(H+L)購自Vector，超敏發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)為普利萊基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品，顯影液和定影液為中科愛比西科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

3 方法

3.1 原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 出生3 d以內(nèi)的SD大鼠，70%乙醇消毒處死后，用小彎鑷取心尖組織，DHanks液洗3次，用彎鑷去除心包膜，剪碎，Ⅱ型膠原酶消化數(shù)次，每次15 min。收集細(xì)胞懸液入皿中，37℃恒溫培養(yǎng)箱差速貼壁1.5 h以清除非心肌細(xì)胞。收集細(xì)胞懸液稀釋到3×105，加入10－4mol/L濃度5’－溴脫氧尿嘧啶以抑制成纖維細(xì)胞生長，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h以貼壁。顯微鏡下可見心肌細(xì)胞貼壁融合生長，跳動(dòng)頻率約 90 ～120 min－1［7－8］。

3.2 MTT比色法測細(xì)胞活力 將心肌細(xì)胞按3×105密度接種到96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組加入藥物處理。48 h后每孔避光加入5 g/L MTT 20 μL，混合均勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，吸走上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜 DMSO以溶解結(jié)晶，搖床振蕩10 min，使充分混勻。采用酶標(biāo)儀測定各孔A(492 nm)值，評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。

3.3 β－半乳糖苷酶染色法 將心肌細(xì)胞按3×105密度接種到6孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后按對(duì)照組和衰老組(10 g/L D－半乳糖處理48 h)處理。48 h后吸走培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次，室溫下用2%甲醛與0.2%戊二醛混合液固定10～15 min。吸走固定液，PBS沖洗2遍。加入含20 g/L X－Gal(X－Gal溶于DMF)的染色液(染色液按照試劑盒說明配成)，無CO2、37℃恒溫培養(yǎng)孵育24 h，研究級(jí)倒置光學(xué)顯微鏡下可見衰老細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)藍(lán)色，為染色陽性細(xì)胞。于倒置顯微鏡(×200)下拍照，并對(duì)視野內(nèi)染色陽性的細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔3個(gè)隨機(jī)視野，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

3.4 FDG法檢測β－半乳糖苷酶含量 FDG是一種β－半乳糖苷酶特異性熒光底物，F(xiàn)DG 5 mg溶于38 μL雙蒸水與 DMSO混合液中(1∶1)制成200 mmol/L母液(－20℃可保存數(shù)月)。將心肌細(xì)胞按3×105密度接種到96孔板，每組5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后加入藥物處理。48 h后吸走培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次，室溫下用2%甲醛與0.2%戊二醛混合液固定10～15 min。吸走固定液，PBS沖洗2遍。避光每孔加入 100 μL反應(yīng)液(37 mmol/L檸檬酸，126 mmol/L磷酸氫二鈉，5 mmol/L鐵氰化鉀，5 mmol/L亞鐵氰化鉀，150 mmol/L氯化鈉，2 mmol/L氯化鎂)與10 μL 2 mmol/L FDG無CO2、37℃恒溫培養(yǎng)孵育24 h，吸取反應(yīng)液100 μL入96孔黑板，多功能酶標(biāo)儀讀取熒光強(qiáng)度(預(yù)讀，波段485～535 nm)。此法可半定量地檢測β－半乳糖苷酶的含量，作為衰老程度鑒定的指標(biāo)［9－10］。

3.5 心肌細(xì)胞SOD和MDA水平檢測 細(xì)胞外液SOD和細(xì)胞中MDA的水平使用南京建成SOD測定試劑盒(WST－1法)和細(xì)胞MDA測定試劑盒進(jìn)行檢測［11］。

3.6 Western blotting檢測 將每組蛋白按照總量80 μg計(jì)算出上樣體積，加入蛋白上樣緩沖液，沸水煮5 min后，2 000 r/min離心1 min，然后上樣，并加5 μL蛋白marker作為分子量指示。電泳:恒壓80 V 30 min，100 V 1 h。電泳完畢后，按“夾心三明治”方式將膠與PVDF膜(使用前在甲醇中浸泡5 s左右)夾在一起，冰浴中恒壓100 V 1 h電轉(zhuǎn)。用5%TBST脫脂牛奶溶液將電轉(zhuǎn)后的PVDF膜室溫封閉1 h，將含目的條帶的PVDF膜浸沒在LC3Ⅰ抗滴度均為1∶1 000的5%TBST脫脂牛奶溶液中，4℃搖床孵育過夜。β－actin抗體(1∶10 000)作為內(nèi)參判斷各組間的上樣量是否一致。Ⅰ抗孵育完畢后，室溫下TBST洗膜5次，每次8 min。加入Ⅱ抗室溫孵育1 h。Ⅱ抗滴度均為1∶2 000。Ⅱ抗孵育結(jié)束后用TBST洗膜3次，每次10 min。于暗室加上ECL發(fā)光液用X膠片曝光，于顯影液、定影液中獲得顯影膠片。X膠片上的目的條帶經(jīng)過掃描儀掃描后，使用ImageJ軟件進(jìn)行條帶灰度的半定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心肌細(xì)胞衰老模型的建立

D－半乳糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老，分別用0.1 g/L、1 g/L、10 g/L和100 g/L濃度處理48 h，用 MTT法測定細(xì)胞活力，F(xiàn)DG法檢測β－半乳糖苷酶的含量，作為衰老程度鑒定的指標(biāo)。在10 g/L濃度時(shí)，細(xì)胞活力沒有受到影響，β－半乳糖苷酶含量增加，見表1。再用10 g/L D－半乳糖分別處理12 h、24 h、48和72 h，MTT法檢測細(xì)胞活力，F(xiàn)DG法檢測β－半乳糖苷酶的含量，見表2。在10 g/L D－半乳糖處理48 h這一條件下，心肌細(xì)胞活力良好，與對(duì)照組比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但β－半乳糖苷酶的含量明顯增加，因此選擇10 g/L D－半乳糖處理48 h作為心肌細(xì)胞衰老造模條件。后面的實(shí)驗(yàn)衰老模型組均采用這一條件。

表1 不同濃度D－半乳糖誘導(dǎo)組β－半乳糖苷酶含量及細(xì)胞活力的比較Table 1.β－galactosidase level and cell viability in different concentrations of D－galactose treatment groups(ˉx±s.n=5)

表2 D－半乳糖誘導(dǎo)不同時(shí)間組β－半乳糖苷酶含量及細(xì)胞活力的比較Table 2.β－galactosidase level and cell viability in different time of D－galactose treatment groups(ˉx±s.n=5)

2 衰老的鑒定

在光學(xué)顯微鏡下對(duì)造模成功的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查，可以觀察到衰老的心肌細(xì)胞形狀扁平，胞體變大，呈卷簾樣變化，跳動(dòng)頻率減慢。β－半乳糖苷酶染色可見對(duì)照組僅少量細(xì)胞染色陽性(藍(lán)色)，而衰老模型組染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，見圖1。

3 白藜蘆醇對(duì)衰老心肌細(xì)胞的影響

將細(xì)胞分為對(duì)照組、衰老組(10 g/L D－半乳糖處理48 h)和白藜蘆醇(RESV)處理組(分別以2 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L 和 250 μmol/L 濃度白藜蘆醇預(yù)處理30 min后加入D－半乳糖，以及白藜蘆醇與D－半乳糖同時(shí)孵育)，加入FDG，熒光酶標(biāo)法檢測白藜蘆醇對(duì)衰老心肌細(xì)胞的影響，見圖2。與衰老組相比，白藜蘆醇10 μmol/L及50 μmol/L處理組的β－半乳糖苷酶含量明顯減少。預(yù)處理組與同時(shí)孵育組相比，預(yù)處理組沒有表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗衰老效應(yīng)。

Figure 1.Identification of D－galactose(10 g/L for 48 h)－induced senescence in cardiomyocytes.A:β－galactosidase staining of cardiomyocytes(×200);B:β－galactosidase－positive cardiomyocyte count;C:beating rate of cardiomyocytes.ˉx±s.n=5.*P ＜0.05 vs control group.圖1 D－半乳糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老的鑒定

Figure 2.The anti－aging effect of resveratrol(RESV).Senescence－associated β －galactosidase was measured by fluorescence intensity.Cardiomyocytes were pretreated with RESV for 30 min and then subject to D－galactose for 48 h.On the other hand，cardiomyocytes were coincubate with RESV and D －galactose for 48 h.In control and D －galactose groups，cardiomyocytes were treated with vehicle and D －galactose for 48 h，respectively.ˉx±s.n=5.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs D －galactose group.圖2 白藜蘆醇抗衰老效應(yīng)圖

4 白藜蘆醇對(duì)衰老心肌細(xì)胞SOD和MDA水平的影響

將細(xì)胞分為對(duì)照組、衰老組和白藜蘆醇處理組(取對(duì)衰老原代心肌細(xì)胞有保護(hù)作用的10 μmol/L和50 μmol/L的濃度，與D－半乳糖同時(shí)加入)，檢測細(xì)胞外液SOD和細(xì)胞中MDA的水平。根據(jù)SOD測定試劑盒MDA測定試劑盒操作說明進(jìn)行檢測，可見衰老組SOD水平比對(duì)照組降低，而白藜蘆醇處理組比衰老組SOD水平顯著升高;衰老組MDA水平比對(duì)照組升高，而白藜蘆醇處理組比衰老組MDA水平顯著降低，見表3。

表3 白藜蘆醇對(duì)衰老心肌細(xì)胞SOD活性和MDA含量的影響Table 3.Activity of SOD and MDA level in aging and resveratrol treatment groups(ˉx±s.n=5)

5 白藜蘆醇對(duì)衰老心肌細(xì)胞自噬水平的影響

將細(xì)胞分為對(duì)照組、衰老組、白藜蘆醇處理組(取對(duì)衰老原代心肌細(xì)胞有保護(hù)作用的10 μmol/L和50 μmol/L的濃度，與D－半乳糖同時(shí)加入)和白藜蘆醇空白對(duì)照組。刮下細(xì)胞，充分裂解后，Western blotting技術(shù)檢測各組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平，可見衰老組細(xì)胞自噬水平下調(diào)，而白藜蘆醇處理組自噬水平上調(diào)，見圖3。

Figure 3.Protein level of LC3Ⅱ/LC3Ⅰin aging and resveratrol treatment groups.ˉx±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs D － galactose group.圖3 白藜蘆醇對(duì)衰老心肌細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平的影響

討 論

本實(shí)驗(yàn)用D－半乳糖誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞衰老，確定了在10 g/L D－半乳糖培養(yǎng)48 h這一條件下，心肌細(xì)胞活力沒有受到影響，β－半乳糖苷酶含量明顯增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在 10 μmol/L和 50 μmol/L的濃度下減少了D－半乳糖誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞β－半乳糖苷酶含量增加的程度。此結(jié)果表明在白藜蘆醇的作用下，D－半乳糖誘導(dǎo)的發(fā)生衰老心肌細(xì)胞數(shù)明顯減少，白藜蘆醇對(duì)衰老心肌細(xì)胞具有保護(hù)效應(yīng)。

SOD能清除細(xì)胞中過多的氧自由基，其活力高低可間接反映細(xì)胞清除氧自由基的能力;MDA是自由基損傷不飽和脂肪酸生成的中間產(chǎn)物，其含量能間接證明細(xì)胞內(nèi)自由基的水平。細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生增多，而清除自由基的相關(guān)酶活性下降，是衰老發(fā)生的重要機(jī)制［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明D－半乳糖作用可使細(xì)胞抗氧化能力降低，細(xì)胞內(nèi)自由基含量升高。白藜蘆醇具有酚羥基結(jié)構(gòu)，與自由基清除劑維生素E活性結(jié)構(gòu)相似，但其活性明顯強(qiáng)于維生素E，具有很強(qiáng)的自由基清除能力和抗脂質(zhì)過氧化效應(yīng)。白藜蘆醇可以對(duì)抗D－半乳糖處理產(chǎn)生的效應(yīng)，提高SOD水平，降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量。由此可以證明，D－半乳糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老與氧化應(yīng)激損傷和自由基毒性相關(guān)。白藜蘆醇對(duì)抗衰老的效應(yīng)部分是因?yàn)槠淞己玫目寡趸饔酶纳屏思?xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高細(xì)胞的抗氧化能力所致［13］。

細(xì)胞內(nèi)損傷物質(zhì)的積累是所有衰老的普遍特征，導(dǎo)致生命有機(jī)體生存能力降低。在衰老過程中，自噬選擇性地清除某些細(xì)胞成分，如受損或多余的過氧化物酶體和細(xì)胞器，維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)，而一些細(xì)胞器經(jīng)包裹分解后又可以再利用。盡管自噬曾被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞的一種自我消亡方式［14］。但越來越多的研究結(jié)果表明，自噬起的是一種保護(hù)細(xì)胞的作用，在營養(yǎng)缺乏、缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、異常蛋白堆積和DNA損傷的情況下，保存細(xì)胞能量，循環(huán)利用蛋白和細(xì)胞器，增強(qiáng)線粒體功能，防止細(xì)胞走向凋亡和壞死。衰老的過程伴隨著細(xì)胞自噬活動(dòng)的下調(diào)。自噬活動(dòng)不足促進(jìn)衰老的發(fā)生。自噬活動(dòng)增強(qiáng)具有抗衰老的作用［15－16］。白藜蘆醇作為SIRT1的激活劑，近年來因?yàn)槠淇顾ダ系男в枚@得廣泛關(guān)注。白藜蘆醇能通過激活SIRT1信號(hào)通路來抑制mTOR，上調(diào)自噬水平，從而發(fā)揮抗衰老作用［17－18］。

衰老是一個(gè)正常的生理過程，但各種年齡相關(guān)疾病的高發(fā)病率使得研究者從未減少對(duì)衰老的關(guān)注。建立體外心肌細(xì)胞衰老模型對(duì)觀察衰老心肌細(xì)胞對(duì)外界刺激因素的反應(yīng)，篩選具備抗衰老效應(yīng)的藥物都具有重大意義。本研究結(jié)果為白藜蘆醇通過抗氧化應(yīng)激及上調(diào)自噬來對(duì)抗衰老提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Sheydina A，Riordon DR，Boheler KR.Molecular mechanisms of cardiomyocyte aging［J］.Clin Sci(Lond)，2011，121(8):315 －329.

［2］ 譚敦勇，李楚杰.衰老分子機(jī)制研究的某些進(jìn)展［J］.中國病理生理雜志，2000，16(1):79－83.

［3］ 王 琳，丁秀云，劉饃焓，等.D－半乳糖對(duì)幼鼠心肌細(xì)胞擬衰老作用的實(shí)驗(yàn)［J］.中國臨床康復(fù)，2005，9(39):25－27.

［4］ 丁秀云，劉饃焓，王 琳，等.D－半乳糖對(duì)幼鼠心臟成纖維細(xì)胞擬衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國病理生理雜志，2004，20(8):1505 －1506，1526.

［5］ Dimri GP，Lee XH，Basile G，et al.A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92(20):9363－9367.

［6］ Baur JA，Sinclair DA.Therapeutic potential of resveratrol:the in vivo evidence［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5(6):493－506.

［7］ Harary I，F(xiàn)arley B.In vitro studies of single isolated beating heart cells［J］.Science，1960，131(3414):1674 －1675.

［8］ Fu J，Gao J，Pi R，et al.An optimized protocol for culture of cardiomyocyte from neonatal rat［J］.Cytotechnology，2006，49(2 －3):109 －116.

［9］ Noppe G，Dekker P，de Koning－Treurniet C，et al.Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated β － galactosidase activity in human fibroblasts［J］.Cytometry A，2009，75A(11):910 －916.

［10］ Yang NC，Hu ML.A fluorimetric method using fluorescein di－β－D－galactopyranoside for quantifying the senescence－ associated β － galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells［J］.Anal Biochem，2004，325(2):337－343.

［11］ 王秋林，王浩毅，王淑人.氧化應(yīng)激狀態(tài)的評(píng)價(jià)［J］.中國病理生理雜志，2005，21(10):2069－2074.

［12］ 李 亞，秦海強(qiáng)，陳啟盛.淀粉樣蛋白對(duì)D－半乳糖致衰大鼠行為及海馬SOD活性和MDA含量的影響［J］.中國病理生理雜志，2001，17(1):16－18.

［13］ Finkel T，Holbrook NJ.Oxidants，oxidative stress and the biology of ageing［J］.Nature，2000，408(6809):239 －247.

［14］ 陳 艾，童 煜，毛 萌.小自噬的研究進(jìn)展［J］.中國病理生理雜志，2012，28(5):955－960.

［15］ Rubinsztein DC，Marino G，Kroemer G.Autophagy and aging［J］.Cell，2011，146(5):682 －695.

［16］ Morselli E，Galluzzi L，Kepp O，et al.Autophagy mediates pharmacological lifespan extension by spermidine and resveratrol［J］.Aging(Albany NY)，2009，1(12):p961－p970.

［17］ Morselli E，Maiuri MC，Markaki M，et al.Caloric restriction and resveratrol promote longevity through the Sirtuin－1 －dependent induction of autophagy［J］.Cell Death Dis，2010，1:e10.

［18］ Wood JG，Rogina B，Lavu S，et al.Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans［J］.Nature，2004，430(7000):686－689.