王莉麗，劉連利，張 杰，王 洋

（(渤海大學(xué) 科技實驗中心，遼寧 錦州 121013)

分析測試

飼料中三聚氰胺的HPLC檢測方法研究

王莉麗，劉連利，張 杰，王 洋

（(渤海大學(xué) 科技實驗中心，遼寧 錦州 121013)

飼料樣品前處理時分別考察了提取液用量、沉淀劑用量、提取時間等因素對檢測結(jié)果的影響，得到最佳前處理條件：提取液為乙腈+水+5%的三氯乙酸(8 mL+14 mL+20 mL)，沉淀劑為2 mL，超聲提取時間25 min。采用HPLC法測試，外標(biāo)法定量，方法的檢出限為0.2 μg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.44%，回收率在88.3%～94.3%之間，20 min內(nèi)可以完成一個樣品的分析測定，建立了一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的測定方法。

高效液相色譜法；飼料；三聚氰胺

三聚氰胺(Melamine)是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，氮含量很高，生產(chǎn)成本很低，在飼料工業(yè)中是一種粘合劑，在飼料中添加三聚氰胺可提高產(chǎn)品中總氮的含量，從而提高蛋白含量測定值。一些不法企業(yè)在飼料中添加三聚氰胺，不僅對養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生不利影響, 對人類健康也存在著嚴(yán)重威脅。自從美國發(fā)現(xiàn)動物的尿液結(jié)晶和腎臟細(xì)胞中有三聚氰胺[1]，食品中三聚氰胺進(jìn)入食物供應(yīng)鏈的問題[2]引起了高度關(guān)注。目前，我國明令禁止在任何飼料中使用三聚氰胺。三聚氰胺傳統(tǒng)的檢測方法有重量法、升華法、離子交換色譜法[3]、高效液相色譜質(zhì)譜法[4-7]和氣質(zhì)聯(lián)用法[8]，但這些方法檢出限較高 (5 mg/kg或更高)或僅能檢測簡單的基質(zhì)，或存在檢測成本較高的問題，或回收率較低，不能完全滿足飼料中三聚氰胺的檢測需要。本文采用的高效液相色譜法[9-11]具有高效、高靈敏度等優(yōu)點，利用二極管陣列檢測器定性，外標(biāo)法定量，檢測成本低于質(zhì)譜法，測量結(jié)果準(zhǔn)確度也較高，通過對前處理條件的考察，建立了一套準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高的飼料中三聚氰胺的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

高效液相色譜儀（美國Agilent 1100）；萬能粉碎機(jī)（鄄城威瑞科教儀器有限公司 DGF-100）；渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司QL-901型）；高功率數(shù)控超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司KH-200KDB型）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司 DGG-9053AD型）；高速臺式冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)有限公司 TGL-20M型）；氮吹儀(北京萬誠博達(dá)科貿(mào)有限公司 HGC-12A型)

1.2 實驗試劑

甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；水（18.2 M Ω）；氨水（分析純）；混合型陽離子交換固相萃取柱（60 mg，3 mL）；三氯乙酸（色譜純）；乙酸鉛（分析純）；濾膜（0.22 μm）；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，Sigma公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取100 mg（精確到0.1 mg）的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶液溶解并定容至100 mL，制備濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋制成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 色譜條件

Eclipse XDB-C8柱，4.6 mm×300 mm，5 μm；流動相：庚烷磺酸鈉-已腈(92+8)；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL/次；進(jìn)樣方式：手動進(jìn)樣。檢測波長：240 nm。

1.5 試樣制備

用萬能粉碎機(jī)將飼料樣品粉碎，然后過160目篩子。稱取過篩后的飼料樣品5.00 g于50 mL具塞塑料管中，加入2.0 mL 5%的乙酸鉛溶液，20 mL三氯乙酸溶液，8 mL乙腈，用水定容至50 mL。渦旋混勻，超聲提取25 min，然后在5 000 r/min離心機(jī)上離心10 min，取上清液備用。分別用3 mL甲醇，3 mL水活化混合型陽離子交換固相萃取柱，準(zhǔn)確移取 10 mL上清液分次上柱，控制過柱速度在 1 mL/min以內(nèi)。再用3 mL水，3 mL甲醇洗滌混合型陽離子交換固相萃取柱，抽近干后用3 mL氨水甲醇溶液洗脫。洗脫液 50 ℃氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入甲醇溶液1 mL，渦旋震蕩1 min，過0.45 μm濾膜，上機(jī)測定。每個樣品平行處理3份。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的選擇

2.1.1 提取液的選擇

對于食品和飼料樣品, 一般采用乙腈- 水溶劑體系進(jìn)行提取, 以減少共萃取組分。本實驗采用 20 mL三氯乙酸和乙腈混合溶液提取，分別考察了不同比例 5%三氯乙酸與乙腈的提取液用量對實驗回收率的影響，加10 mL、15 mL三氯乙酸時，回收率低，三聚氰胺提取不完全，加入三氯乙酸過多時，從液相色譜圖上可以看出三氯乙酸提取了過多的飼料中的雜質(zhì)，導(dǎo)致回收率降低。由此可知5%三氯乙酸20 mL，乙腈加入量為8 mL，加入的水約為14 mL為比較好的提取液比例，此時實驗回收率達(dá)91.0%。

表1 三氯乙酸與乙腈用量對回收率的影響Table 1 Effect of the acetocaustin and acetonitrile dosage on

2.1.2 沉淀劑及用量的選擇此

飼料成分復(fù)雜，有些飼料用離心機(jī)離心時分離不好，加入沉淀劑可以增強(qiáng)離心效果。用乙酸鉛作為沉淀劑，分別加入0.5、1、2、3 mL乙酸鉛，通過實驗，用量達(dá)2 mL時，沉淀效果就很好。

2.1.3 提取時間的選擇

三聚氰胺是強(qiáng)極性化合物，溶解性很弱，提取時間對回收率影響很大，因此分別比較了超聲5、10、15、20、25、30 min的提取效率，實驗結(jié)果如表 2所示。超聲25 min以上可以得到較好的回收率。超聲25 min時回收率可達(dá)90.3%。

表2 超聲提取時間對回收率的影響Table 2 Effect of ultrasound extraction time on the recoveries

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

測得1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、80.0、150.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液所得的峰面積與所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行直線回歸分析，峰面積(Y)與三聚氰胺濃度(X) 呈良好的線性關(guān)系，直線回歸方程為Y=74.033X+58.633，相關(guān)系數(shù)R=0.9993。

2.3 最小檢出限的測定

采用50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，估算2倍噪音峰高時隨對應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度，以5倍估算濃度值為起點進(jìn)樣，用乙腈逐漸稀釋三軍氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定2倍噪音峰高時所對應(yīng)的三聚氰胺濃度，即三聚氰胺的最小檢出限，測得最小檢出限為 0.2 μg/mL。最小定量限為最小檢出限的 5倍，最小定量限為1 μg/mL。

2.4 精密度和回收率實驗

連續(xù)進(jìn)6次三聚氰胺5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，三聚氰胺測得峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%，精密度高，保證了方法的有效性。添加回收率實驗的樣品處理同上述2.5試樣制備步驟。三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在飼料樣品中的添加量為25、50、100 μg/g。每個添加濃度平行測定 3次，回收率測得值在88.3%~94.3%之間，平均值為91.04%，回收率較高。精密度和回收率數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 精密度和回收率實驗數(shù)據(jù)表Table 3 Datas of the precision and the recoveries

2.5 樣品待測組分的測定

圖1和圖2分別為三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖和加標(biāo)的飼料樣品色譜圖。圖1中三聚氰胺的出峰位置為15.007 min，由加標(biāo)的飼料樣品色譜圖可見，由于樣品前處理采用提取液為乙腈-水-5%的三氯乙酸（8 mL+14 mL+20 mL），提取的雜質(zhì)少，因此色譜峰比較少，三聚氰胺的出峰位置為14.908 min，三聚氰胺色譜峰與其他峰完全分開，峰形良好，不受其他提取物的干擾。

圖1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatograghy of the melamine standard solution

圖2 加標(biāo)飼料樣品的色譜圖Fig.2 Chromatography of the feed sample added the standard substance

3 結(jié) 論

本文采用高效液相色譜法測定飼料中三聚氰胺含量。樣品的預(yù)處理簡單，操作簡便快速，精密度、準(zhǔn)確度較好，回收率完全符合分析要求。飼料樣品前處理采用提取液為乙腈+水+5%的三氯乙酸(8 mL+14 mL+20 mL)，乙酸鉛沉淀劑2 mL，超聲提取時間25 min，提取雜質(zhì)少，色譜峰干擾小, 適合飼料中三聚氰胺的檢測。

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Study of the Melamine Determination in feed By HPLC

WANG Li-li, LIU Lian-li, ZHANG Jie, WANG Yang
（Center for science& Experiment technology，Bohai university，Liaoning Province Jinzhou 121013，China）

In the pre-treatment step of feed samples, the factors were studied to affect on detect consult such as the amount of extraction agent, the amount of precipitant and extraction time. The optimal pre-treatment method was obtained: the extraction agent is acetonitrile-water-5% acetocaustin (8mL+14mL+20mL), the amount of precipitant is 2ml and ultrasound extraction time is 25min. HPLC and ESTD was adopted to determine the content of the melamine in feed. The determination limit was 0.2μg·mL-1; the relative standard deviation was 2.44% and the mean recoveries were from 88.3% to 94.3%. The determination of one sample is within 20 minutes. A simple, quick and accurate analysis method were established.

HPLC；Feed；Melamine

O 657

A

1671-0460（2012）05-0547-03

2012-03-24

王莉麗（1980-），女，遼寧遼陽人，實驗師，碩士，2005年畢業(yè)于東北大學(xué)冶金物理化學(xué)專業(yè)，主要從事化學(xué)分析方法及化學(xué)分析儀器的功能開發(fā)研究。E-mail：wanglili1980@163.com。