盧艷芬，徐麗君，王 輝，王志明，顏克旭

(長沙市畜禽水產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，湖南 長沙 410013)

2012-05-11；

2012-08-24

長沙市科技局現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與健康科技重大專項(K1003024-21)資助

盧艷芬(1968～)，女(漢族)，副研究員，從事動物源性產(chǎn)品質(zhì)量安全管理和檢測。E-mail:Lubabana@126.com

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飼料中的7種β2-興奮劑

盧艷芬，徐麗君，王 輝，王志明，顏克旭

(長沙市畜禽水產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，湖南 長沙 410013)

為了準確測定飼料中7種β2-興奮劑，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)酸性有機混合溶劑提取、固相萃取凈化濃縮后，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下,用帶電噴霧離子源(ESI)的串聯(lián)質(zhì)譜儀對樣品進行定性和定量分析。該方法下各化合物定量檢出限為50 μg/kg。在50、100、200 μg/kg的添加濃度下，回收率在71%～103%之間，相對標準偏差在5.7%～9.8%之間。本方法快速、準確、靈敏度高，適合飼料中福莫特羅、苯乙醇胺A、克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布它林、西馬特羅的同時快速檢測。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；β2-興奮劑；飼料；殘留

β2-興奮劑(β2-agonist)屬于苯乙胺類藥物，俗稱瘦肉精，既不是獸藥，也不是飼料添加劑，藥理效應(yīng)上屬于擬腎上腺素藥物。這些違禁藥物高劑量添加在飼料中，可以選擇性地作用于腎上腺素，導致動物體內(nèi)的脂肪分解代謝增強，增加蛋白質(zhì)的合成，顯著提高胴體瘦肉率[1-3]。在經(jīng)濟利益驅(qū)動下，不法分子違禁在飼料中添加此類藥物的情況時有發(fā)生。農(nóng)業(yè)部早在2002年2月發(fā)布的193號公告《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》中就將其列為違禁藥物。這幾年來，農(nóng)業(yè)部一直將β2-興奮劑類藥物列入重點監(jiān)測項目之一。由于多年來對克侖特羅的嚴厲監(jiān)管，犯罪分子轉(zhuǎn)而添加同類替代藥物，比如：萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A等，導致中毒事件的屢屢發(fā)生。β2-興奮劑的濫用嚴重威脅著人們的身體健康[3-4]，農(nóng)業(yè)部于2010年12月再次發(fā)文(農(nóng)業(yè)部公告第1519號)，禁止在飼料和動物飲水中使用苯乙醇胺A、福莫特羅等物質(zhì)。因此，設(shè)計多組分的同時測定方法，在實際監(jiān)督和執(zhí)法工作中對飼料進行實時監(jiān)測勢在必行，以期從源頭進行監(jiān)控。

有關(guān)β2-興奮劑的分析測定方法涉及(氣相、液相)色譜法、(氣相、液相)色譜-質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫測定法等[5-19]。實際工作中，多采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行確證，因為此法可以同時滿足高靈敏度、高選擇性的定性定量要求。由于現(xiàn)有國家標準或農(nóng)業(yè)部公告中還沒有關(guān)于飼料中苯乙醇胺A、福莫特羅、克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布它林、西馬特羅同時測定的方法，而在實際監(jiān)督執(zhí)法工作中又迫切需要相關(guān)的分析技術(shù)予以支撐。為此，本工作進行相關(guān)的研究，建立同時測定飼料中的7種β2-興奮劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。

1 實驗方法

1.1主要儀器和設(shè)備

UPLC-MS/MS：美國Waters公司產(chǎn)品；離心機(湘儀H-1650)；固相萃取裝置(Alltech)；pH計(雷磁PHSJ-4A)；渦旋混勻器：德國IKA公司產(chǎn)品；振蕩器(蘇州威爾SHA-C)；超聲儀(昆山KQ-500DE)；沙浴氮氣吹干儀(美國N-EVAPTM112)。

1.2試劑及耗材

苯乙醇胺A標準品(純度大于98.0%)：多倫多化學研究公司產(chǎn)品；萊克多巴胺、克侖特羅、西馬特羅、特布他林、沙丁胺醇、福莫特羅標準品(純度均大于98.0%)：Dr. Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品；甲醇和甲酸：均為色譜純；氨水、鹽酸和氫氧化鈉：均為分析純；固相萃取小柱(MCX、HLB：60 mg/3 mL)：美國Waters公司產(chǎn)品。

1.3實驗條件

1.3.1液相色譜條件 色譜柱：BEH C18(50 m×2.1 mm×1.7 μm)；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇溶液；梯度洗脫：0～3.4 min，維持95%A；3.4～3.6 min，95%A變化至72%A；3.6～5.5 min，維持72%A；5.5～5.7 min，72%A變化至30%A；5.7～6.7 min，維持30%A；6.7～8 min, 30%A變化至95%A。流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：4 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)檢測模式；電離電壓：3.0 kV；源溫：120 ℃；霧化溫度：350 ℃；錐孔氣流速：50 L/h；霧化氣流速：580 L/h。7種化合物的保留時間、定性定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

1.4樣品前處理

1.4.1提取 準確稱取2 g試樣于50 mL離心管中，加入10 mL提取液(V(0.1 mol/L鹽酸)∶V(甲醇)=8∶2)，充分振蕩后超聲10 min, 以5 000 r/min離心5 min，上清液全部轉(zhuǎn)移到另一離心管中，殘渣用上述方法重復(fù)提取1次。合并上清液，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 4，待用。

1.4.2凈化 依次用3 mL甲醇、3 mL水活化固相萃取小柱，準確移取5 mL上清液上柱。再依次用3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、3 mL甲醇淋洗，抽干，3 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液于5 mL離心管中，45 ℃下用氮氣吹干。用1.0 mL流動相溶解，渦旋混勻后過有機微孔濾膜，上機測定。

表1 7種β2-受體激動劑最優(yōu)化的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1凈化條件的優(yōu)化

由于飼料中添加了很多物質(zhì)，成分復(fù)雜，使得提取后的樣品本底復(fù)雜，容易對各目標化合物的測定造成基質(zhì)抑制。為了提高靈敏度、降低檢出限，樣品提取后需進一步進行前處理凈化富集。通常的凈化方式有液-液萃取法和固相萃取法(SPE)。液-液萃取法雖然對去除基質(zhì)有較好的效果，但對于不同結(jié)構(gòu)的藥物類型，其回收率差別較大，同時液-液萃取會消耗大量的有機溶劑，對環(huán)境造成不利影響。因此，本工作采用SPE法。

由于本實驗中的7個化合物既有苯酚型又有苯胺型，因此設(shè)計的凈化方案需要適合全部目標化合物。研究了各種凈化條件對重現(xiàn)性、回收率的影響以及色譜、質(zhì)譜中各目標峰和雜質(zhì)的分離情況。

選取了Oasis MCX和HLB兩種小柱進行比對。研究了上樣溶液的pH值對回收率的影響情況，結(jié)果示于圖1、圖2。從圖中可以看出，對于MCX小柱，當上樣溶液的pH值在4時，7種化合物的回收率均較好；對于HLB小柱，當上樣溶液pH值為7時，7種化合物的回收率相對較高。實驗顯示，HLB小柱的凈化能力不如MCX小柱，即在樣品加標實驗時，雜質(zhì)峰多，不能滿足高靈敏度的檢測要求。故本實驗最終采用MCX小柱進行固相萃取凈化處理。

圖1 上樣溶液pH值和回收率的關(guān)系圖(MCX柱)Fig.1 Relation schema of solution’s pH and recovery(MCX)

圖2 上樣溶液pH值和回收率的關(guān)系圖(HLB柱) Fig.2 Relation schema of solution’s pH and recovery(HLB)

2.2方法的線性關(guān)系和測定限

2.2.1方法的線性關(guān)系 用流動相配制成濃度分別為0.5、1、5、10、20、50 μg/L的系列混合標準工作溶液，在確定的實驗條件下進樣分析。以濃度為橫坐標、峰面積響應(yīng)值為縱坐標，繪制標準工作曲線。如表2所示，各相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法的線性范圍寬，線性關(guān)系良好。

2.2.2方法的靈敏度 測定了不同飼料樣品的最低檢測限，確定本方法的定量限。在本方法中，各種受體激動劑的方法最低定量限(LOQ)為50 μg/kg。該濃度下飼料中各目標化合物的提取離子質(zhì)譜圖示于圖3。從圖中可以看出，在此定量限下，各目標化合物分離良好，信噪比S/N>10。

表2 7種β2受體激動劑的標準工作曲線

圖3 50 μg/kg加標飼料中7種β2-興奮劑的提取離子色譜圖 Fig.3 Extracted ion chromatogram of 7 β2-agonists for a spiked feed sample(50 μg/kg)

2.3方法的精密度和準確度

對本方法的準確度和精密度進行了考察。以空白飼料樣品進行3個濃度的添加回收實驗，每個濃度進行6次以上的平行測定。福莫特羅、苯乙醇胺A、西馬特羅、特布他林、沙丁胺醇、萊克多巴胺、克侖特羅的添加濃度為50、100和200 μg/kg時，測得各目標化合物的回收率和變異系數(shù)列于表3。各化合物的回收率在71%～103%之間，相對標準偏差在5.7%～9.8%之間。

表3 精密度和準確度實驗結(jié)果

3 結(jié)論

本工作建立的飼料中7種β2-興奮劑的多殘留UPLC-MS/MS檢測方法，簡單、快速、有機溶劑消耗少，方法精密度和準確度高，實用性強，為相關(guān)的監(jiān)督執(zhí)法工作提供了快速準確的技術(shù)支持，可為養(yǎng)殖業(yè)健康有序發(fā)展提供技術(shù)保障。

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SimultaneousDeterminationof7Kindsofβ2-agonistinFeedbyUPLC-MS/MS

LU Yan-fen, XU Li-jun,WANG Hui, WANG Zhi-ming, YAN Ke-xu

(ChangshaQualityTestingCenterofLivestockPoultryandAquaticProducts,Changsha410013,China)

A method of ultra performance liquid chromatograghy-electrospray tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was studied for determination ofβ2-agonist in feed. The sample was extracted by 0.1 mol/L hydrochloric acid-methanol mixed solvent, purified and enriched with cationic solid phase extraction column， and which was separated by liquid chromatography on C18column with mobile phase of 0.1% formic acid in methanol(gradient elution), then analyzed in UPLC-MS/MS with electrospray ion source(ESI) under multi-reaction monitor mode(MRM). The quantification was performed with external standard method. The method has a lower limit of quantitation 50 μg/kg. Spike recoveries of three concentration addition levels(50, 100, 200 μg/kg) ranged in 71%—103% with relative standard deviations in 5.7%—9.8%. The method is fast, accurate and sensitive. It is suitable for rapid qualitative and quantitative detection ofβ2-agonist in animal feed.

ultra performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);β2-agonist; feed; residue determination

O 657.63

A

1004-2997(2012)05-0280-06