姬文婕， 胡道川， 陳雪芬， 馬永強(qiáng)， 盧芮伊， 周 欣， 魏路清

(中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院 1附屬醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科, 2武警部隊心血管病研究所，天津 300162)

1000-4718(2012)12-2261-05

2012-06-28

2012-09-29

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81102088)；天津市自然科學(xué)基金一般項目(No. 12JCYBJC16600)；武警醫(yī)學(xué)院科研項目(No.WYB201108)

△通訊作者 Tel: 022-24716466; E-mail: wenjieji@gmail.com

干擾鹽皮質(zhì)激素受體基因?qū)AW 264.7細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

姬文婕1△， 胡道川1， 陳雪芬1， 馬永強(qiáng)1， 盧芮伊2， 周 欣2， 魏路清1

(中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院1附屬醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科,2武警部隊心血管病研究所，天津 300162)

目的應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞鹽皮質(zhì)激素受體(MR)基因，建立穩(wěn)定干擾細(xì)胞株，并觀察其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法針對MR基因設(shè)計合成重組MRshRNA質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至RAW 264.7細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。細(xì)胞分為3組：野生型(WT)組、陰性對照(NC)組和干擾(shMR)組。熒光顯微鏡下觀察確定細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；實(shí)時定量PCR法檢測細(xì)胞中MR mRNA的表達(dá)；CCK-8方法檢測細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布和凋亡情況。結(jié)果(1)MRshRNA能明顯抑制RAW 264.7細(xì)胞的MR基因表達(dá)，抑制率70%以上。(2) 從第3 d開始，shMR組細(xì)胞的生長速度明顯低于NC和WT組 (P<0.05)，說明MRshRNA能明顯抑制細(xì)胞增殖。(3) WT、NC和shMR組的增殖指數(shù)分別為(37.2±0.5)%、(37.5±1.6)%和(31.0±1.3)%，shMR組的細(xì)胞周期出現(xiàn)改變，S期和G2/M期比例明顯下降，增殖指數(shù)下降(P<0.05)。(4) WT、NC和shMR組的細(xì)胞凋亡率分別為(2.18±0.36)%、(6.65±0.81)%和(7.70±1.34)%，shMR組略高于NC組，但二者的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定干擾MR基因表達(dá)的RAW 264.7細(xì)胞株，MRshRNA能夠明顯抑制RAW 264.7細(xì)胞增殖，但對其凋亡無明顯影響。

受體,鹽皮質(zhì)激素； RNA干擾； RAW 264.7細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

巨噬細(xì)胞是具有多功能的異質(zhì)性細(xì)胞群體，在體內(nèi)具有抵抗微生物侵犯，參與免疫應(yīng)答以及其它炎癥疾病的作用。不同的環(huán)境中，巨噬細(xì)胞可以具有不同的活化類型，發(fā)揮不同的功能，繼而影響相關(guān)病理生理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)參與了巨噬細(xì)胞的活化表型調(diào)節(jié)[1]，而且MR受體拮抗劑亦可改善自發(fā)高血壓大鼠的心肌纖維化程度以及減輕實(shí)驗(yàn)性肺纖維化等[2-3]。因此本研究采用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定干擾MR基因的小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞，觀察對其增殖和凋亡等生物學(xué)特性的影響，從而為進(jìn)一步探討MR在巨噬細(xì)胞相關(guān)的病理生理學(xué)過程的調(diào)控機(jī)制提供有力的分子生物學(xué)工具。

材 料 和 方 法

1材料

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7由南開大學(xué)生命科學(xué)院韓際宏教授惠贈；shRNA干擾表達(dá)載體系統(tǒng)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；高糖DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購自HyClone；G-418購自Amesco；OPTI MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000和TRIzol購自Invitrogen；CCK-8試劑盒購自Dojindo；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和dNTPs購自Promega；SYBR Green實(shí)時定量PCR試劑盒購自Roche；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自Sigma；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自Biolegend。

2主要方法

2.1shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計合成4對針對小鼠MR基因序列(Gene ID：110784)的shRNA序列，以與目的基因shRNA序列和任何小鼠基因序列無同源性的序列為陰性對照。所有序列經(jīng)BLAST分析與已知的小鼠基因序列無同源性。將有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列，克隆到空載體pGPU6/GFP/Neo，構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒。shRNA質(zhì)粒靶位點(diǎn)及序列見表1。

表1 MR shRNA重組質(zhì)粒靶位點(diǎn)及靶序列

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和干擾位點(diǎn)的篩選 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7用高糖DMEM培養(yǎng)基(含12%胎牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將重組質(zhì)粒按照LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞，主要步驟如下：取對數(shù)生長期RAW 264.7細(xì)胞計數(shù)后接種于6孔板，每孔4×105個，使轉(zhuǎn)染時達(dá)到80%～90%的融合；將4個不同干擾位點(diǎn)質(zhì)粒(表1)和陰性質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染RAW 264.7，空白對照組以完全培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染復(fù)合物；轉(zhuǎn)染24 h后用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞的熒光比例，確定轉(zhuǎn)染效率。TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，實(shí)時定量PCR法檢測MR mRNA的表達(dá)量，篩選出干擾效率最高的重組質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3穩(wěn)定細(xì)胞株的建立 細(xì)胞培養(yǎng)、接種及轉(zhuǎn)染步驟同2.2，用2.2篩選出的靶位點(diǎn)作為有效干擾位點(diǎn)。細(xì)胞分為3組：野生型(wild type，WT)組、陰性對照(negative control，NC)組和干擾(RNA interference byMRshRNA，shMR)組。轉(zhuǎn)染36 h后，用G418(500 mg/L)篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，傳代3次后，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光有無丟失，RT-PCR法檢測MR基因干擾效果，若細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，則表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系RAW 264.7-shMR和RAW 264.7-NC構(gòu)建成功。

2.4實(shí)時定量PCR法檢測細(xì)胞中MR mRNA的表達(dá)水平 按照TRIzol說明書提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測，同一樣本設(shè)2個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。MR上游引物5’-GGCTACCACAGTCTCCCTGA-3’，下游引物5’-AGAACGCTCCAAGGTCTGAG-3’；內(nèi)參照β-actin上游引物5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’，下游引物5’-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3’。以上引物均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，(95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min)40個循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線分析。用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量，其中ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因)-對照組(Ct的基因-Ct內(nèi)參照基因)。

2.5CCK-8法測定細(xì)胞增殖活性 分別將對數(shù)生長期的shMR、NC和WT組細(xì)胞計數(shù)后，接種于96孔板，每孔1×103個，每組設(shè)6個復(fù)孔，分別于培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d和5 d后，每孔加入CCK-8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，測定450 nm波長處吸光度值(A)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計算平均值。根據(jù)各組細(xì)胞每天的A值繪制細(xì)胞生長曲線，并計算生長抑制率(inhibitory rate，IR)公式如下：

2.6細(xì)胞周期的測定 取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，用70%乙醇固定，PBS洗滌，加入PI染液(含50 mg/L PI、0.05%Triton X-100和100 mg/L RNase)，37 ℃孵育40 min，尼龍濾網(wǎng)過濾后，用Beckman Coulter FC500流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞DNA含量，并用FlowJo軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計算平均值。增殖指數(shù)(proliferation index，PI)公式如下：

2.7細(xì)胞凋亡的檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染色法，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。收集各組對數(shù)生長期細(xì)胞，Binding Buffer重懸細(xì)胞；加入10 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。重復(fù)測定3次，計算各組細(xì)胞的平均凋亡率。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1MRshRNA干擾穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞均轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染效率約為75%左右,見圖1。Real-time PCR結(jié)果顯示(圖2)，與NC組相比，不同干擾位點(diǎn)的shRNA組的MR mRNA水平的表達(dá)均降低(P<0.05)，其中MR-mus-2373的干擾效果最明顯，抑制率為70%左右。因此，選用重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-MR-2373構(gòu)建穩(wěn)定干擾細(xì)胞株。將上述質(zhì)粒及陰性質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞，連續(xù)傳3代后，經(jīng)real-time PCR檢測，RAW 264.7-shMR細(xì)胞的MR mRNA的抑制率仍在70%以上，說明成功構(gòu)建了穩(wěn)定干擾細(xì)胞株。

Figure 1. Fluorescent images of RAW 264.7 cells after transfection with recombinant plasmid pGPU6/GFP/Neo (×400).A: blank control; B: shRNA transfection.

圖1熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率

圖2shRNA轉(zhuǎn)染后RAW264.7細(xì)胞中MRmRNA的表達(dá)

2MRshRNA對RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

從各組細(xì)胞的生長曲線可以看出，從第3 d開始，shMR組細(xì)胞的生長速度明顯低于NC和WT組 (P<0.05)，而后者之間無顯著差異,見圖3，說明MRshRNA能明顯抑制細(xì)胞增殖。與NC相比，shMR組細(xì)胞的第3 d生長抑制率為25.92%，第4 d為37.58%，第5 d為42.09%。

圖3MRshRNA對RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

3MRshRNA對RAW264.7細(xì)胞周期的影響

WT、NC和shMR組的增殖指數(shù)分別為(37.2±0.5)%、(37.5±1.6)%和(31.0±1.3)%，見圖4。與WT和NC組相比，shMR組的細(xì)胞周期出現(xiàn)改變，S期和G2/M期比例明顯下降，增殖指數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而NC與WT組的細(xì)胞周期分布無明顯差異。

Figure 4. Cell cycle of RAW 264.7 cells assayed by flow cytometry.

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測MRshRNA對RAW264.7細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

4MRshRNA對RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響

WT、NC和shMR組的細(xì)胞凋亡率分別為(2.18±0.36)%、(6.65±0.81)%和(7.70±1.34)%，NC較WT組的細(xì)胞凋亡率有明顯上升(P<0.05)，shMR組略高于NC組，但二者的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖5。

圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測MRshRNA對RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響

討 論

巨噬細(xì)胞是具有吞噬、抗原遞呈和免疫調(diào)節(jié)等功能的免疫細(xì)胞，在各種不同的刺激下，巨噬細(xì)胞會表現(xiàn)出不同的功能：促進(jìn)炎癥與抑制炎癥、免疫應(yīng)答與免疫耐受、組織損傷與組織修復(fù)等。在不同環(huán)境中，巨噬細(xì)胞可以發(fā)生不同性質(zhì)的活化，成為具有不同分子表型和功能特征的亞群，從而決定了其在各種環(huán)境和不同疾病中發(fā)揮的作用[4]。目前認(rèn)為巨噬細(xì)胞至少存在2種活化狀態(tài)，即經(jīng)典活化(classical activation, M1)和替代活化(alternative activation, M2)[5]。M1巨噬細(xì)胞通常認(rèn)為是經(jīng)干擾素γ激活，主要表現(xiàn)為促進(jìn)炎癥(分泌TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子)和氧化應(yīng)激反應(yīng)(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)上調(diào))、增強(qiáng)的吞噬活性；M2巨噬細(xì)胞主要經(jīng)IL-4和IL-13激活，主要表現(xiàn)為抑制炎癥反應(yīng)，并與組織的修復(fù)和纖維化過程有關(guān)(分泌多種生長因子)。2種狀態(tài)的平衡對于機(jī)體維持正常免疫功能是必須的，任何一種活化失衡狀態(tài)都可能對組織炎癥的恢復(fù)產(chǎn)生不良影響。

鹽皮質(zhì)激素受體是一種典型的胞核甾體類激素受體，它的經(jīng)典配體為醛固酮，與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等病理生理過程有密切聯(lián)系[6-8]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為MR主要存在于心血管系統(tǒng)和腎臟相應(yīng)的靶細(xì)胞，但是新近研究發(fā)現(xiàn)單核-巨噬細(xì)胞也存在這類受體，并且參與了對巨噬細(xì)胞表型的調(diào)控，即鹽皮質(zhì)激素受體活化(如與醛固酮結(jié)合)可使巨噬細(xì)胞向M1分化，而鹽皮質(zhì)激素受體被拮抗(如與螺內(nèi)酯結(jié)合)則可使巨噬細(xì)胞向M2分化[1]。選擇性敲除巨噬細(xì)胞MR基因后，鹽皮質(zhì)激素依賴性心臟纖維化、炎癥以及高血壓等明顯減輕[9-10]。肺巨噬細(xì)胞數(shù)量和功能的動態(tài)演變在時間和空間上均與肺纖維化病程和病情密切相關(guān)，增殖和凋亡是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞數(shù)量的重要機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性肺纖維化模型中，急性炎癥期呈現(xiàn)肺泡巨噬細(xì)胞增殖明顯，數(shù)量增多，而在纖維化期，則出現(xiàn)巨噬細(xì)胞凋亡增加，數(shù)量減少[11]。因此，通過對MR的調(diào)控，改變巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞數(shù)量功能，有可能達(dá)到有效的抗炎效果，從而改變疾病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。

本研究中采用基于質(zhì)粒載體的shRNA系統(tǒng)，用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-MRshRNA轉(zhuǎn)染至RAW 264.7細(xì)胞，經(jīng)過G418抗性篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MRshRNA有效地抑制了RAW 264.7 細(xì)胞中MR mRNA的表達(dá)，明顯地抑制了RAW 264.7細(xì)胞的生長，S期和G2/M期比例明顯下降，而對細(xì)胞的凋亡基本沒有影響。但是目前尚未闡明MR對巨噬細(xì)胞表型調(diào)控的機(jī)制與其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的相互關(guān)系，以及在一些疾病發(fā)生發(fā)展過程中的意義等。因此，本實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建的穩(wěn)定干擾細(xì)胞株將為進(jìn)一步探討巨噬細(xì)胞MR的病理生理學(xué)機(jī)制提供有力的研究工具和奠定初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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EffectofmineralocorticoidreceptorgenesilencingbyRNAinterferenceonproliferationandapoptosisofmurinemacrophagecelllineRAW264.7

JI Wen-jie1, HU Dao-chuan1, CHEN Xue-fen1, MA Yong-qiang1, LU Rui-yi2, ZHOU Xin2, WEI LU-qing1

(1DepartmentofRespirologyandCriticalCareMedicine,AffiliatedHospital,2ArmedPoliceForcesInstituteforCardiovascularDiseases,LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China.E-mail:wenjieji@gmail.com)

AIM: To establish stable knockdown of mineralocorticoid receptor (MR) expression through short hairpin RNA (shRNA)-mediated silencing in murine RAW 264.7 macrophages.METHODSStableMRsilencing in RAW 264.7 cells was achieved by recombinant shRNA plasmid targeting murineMRgene via liposome-mediated transfection, followed by G418 selection. The efficacies of plasmid transfection andMRsilencing in G418-resistant cells were verified by immunofluorescent microcopy and real-time PCR, respectively. Proliferative activity ofMR-silencing cell line was analyzed by CCK-8 assay. Cell cycle and apoptosis were evaluated by flow cytometry.RESULTSMRgene expression was down-regulated by 70% compared with the negative control (NC) plasmid transfection. In addition,MR-silencing cells exhibited lower proliferative activity compared with NC and wide type RAW 264.7 cells (P<0.05), along with reduced proliferation index of 31.0%±1.3% (P<0.05), compared with the wide type cells (37.2%±0.5%) and the NC cells (37.5%±1.6%). In resting state, the apoptotic rate in wide type, NC andMR-silencing cells were 2.18%±0.36%, 6.65%±0.81% and 7.70%±1.34%, respectively, and no statistical difference was observed between NC andMR-silencing cells (P>0.05).CONCLUSIONMRgene silencing inhibits the proliferation of RAW 264.7 macrophages, but has no obvious effect on the apoptosis of the resting state cells.

Receptors,mineralocorticoid; RNA interference; RAW 264.7 cells; Cell proliferation; Apoptosis

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.12.027