朱 睿， 吳清明， 龍 輝， 程 靜， 李 歡

(1武漢科技大學，2武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院，湖北 武漢 430064)

1000-4718(2012)03-0550-04

2011-10-09

2011-12-05

湖北省自然科學基金資助項目(No.2010CDB03505)

△通訊作者 Tel:027-51164093;E-mail:wuhe9224@sina.com

食管癌放射抗拒與P-gp、HER-2及microRNA-296表達的相關性*

朱 睿1， 吳清明2△， 龍 輝2， 程 靜2， 李 歡2

(1武漢科技大學，2武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院，湖北 武漢 430064)

目的探討P-糖蛋白(P-gp)、人表皮生長因子受體2(HER-2)及microRNA-296的表達與食管癌放射抗拒的相關性。方法將人食管癌細胞Eca109分為對照組和處理組，處理組通過X射線反復照射(累計放射劑量60 Gy)，采用MTT法檢測2組細胞的增殖抑制率。免疫細胞化學法測定P-gp和HER-2的表達。Northern blotting法測定microRNA-296的表達。結(jié)果處理組細胞較對照組顯示出明顯的放射抗性，增殖抑制率明顯低于對照組細胞。免疫細胞化學測定P-gp和HER-2在處理組中較對照組表達顯著增加。2組細胞中microRNA-296表達無顯著差異。結(jié)論P-gp、HER-2可能與食管癌放射抗拒有關；暫不能說明microRNA-296與食管癌細胞Eca109放射抗拒具有相關性。

食管腫瘤; 放射抗拒; microRNA-296; 受體，人表皮生長因子

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)展迅速且預后較差[1]，全世界每年約有48萬新發(fā)病例，隨著人口的增加，其發(fā)病總數(shù)還在不斷增加。其生物學特點具有侵潤性、早期轉(zhuǎn)移和放、化療抵抗性[2]，對于其機制尚不明確。

P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由多藥耐藥基因1(multidrug resistance 1，MDR1)編碼的一種能量依賴跨膜糖蛋白，在多藥耐藥基因MDR1高表達的腫瘤細胞中，表達顯著增加[3]，兩者間呈高度相關性。P-gp可通過穩(wěn)定線粒體膜電位，上調(diào)腫瘤細胞線粒體膜通透性而抑制X射線的凋亡效應。

人表皮生長因子受體 2(human epidermal growth facotr receptor 2,HER-2)是人表皮生長因子受體家族中的重要成員之一，在很多惡性腫瘤中都表現(xiàn)為過表達或基因擴增。HER-2通過PI3k/Akt通路，調(diào)節(jié)NF-κB活性以及c-Myc，發(fā)揮放射抗拒效應。

微小RNA(microRNA)是一種廣泛存在于真核生物中、大小約21～25個核苷酸的內(nèi)源性單鏈小分子RNA[4]。這類小分子在惡性腫瘤內(nèi)異常表達，通過抑制mRNA的降解和翻譯[5]發(fā)揮作用。MicroRNA-296(miR-296)是長度為21 nt的微小RNA,具有胚胎干細胞特異性[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-296與食管癌化療耐藥性的發(fā)生有關[2]。到目前為止，尚沒有與食管癌放射抗拒的相關研究，本實驗采用對食管癌Eca109細胞進行反復照射，誘導細胞產(chǎn)生放射抗拒性，用以探討miR-296與食管癌放射抗拒是否相關。

材 料 和 方 法

1實驗儀器

CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(Heal Force),倒置顯微鏡(Olympus)，超凈工作臺(蘇州凈化)，酶聯(lián)免疫檢測儀(ELX800)，超速低溫離心機(Sigma)，37 ℃恒溫水浴箱(華普達公司)。

2細胞株及主要試劑

人食管癌細胞株Eca109(由太和醫(yī)院惠贈)；RPMI-1640培養(yǎng)粉(Gibco)，胰蛋白酶粉(Amresco)，新生胎牛血清(杭州四季青有限公司)，MTT、DMSO(Sigma)，P-gp單克隆抗體(鼠抗人)、HER-2單克隆抗體(兔抗人)均購自Santa Cruz，SP試劑盒(北京中杉生物技術有限公司)。

3主要方法

3.1細胞培養(yǎng) 人食管癌Eca109細胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及1×105U/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

3.2食管癌細胞株的處理 采用Varian 2300直線加速器6MV-X線照射，表面加1.5 cm標準等效填充物，放射源至標本距離100 cm，照射野10 cm×10 cm，吸收劑量率為1.5 Gy/min。取對數(shù)生長期的親本Eca109細胞X射線照射8 Gy，立即放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待照射后的細胞增長至接近長滿瓶底時，0.25%胰蛋白酶消化細胞，重新接種培養(yǎng)。細胞長至對數(shù)期后，再次X射線照射8 Gy。重復以上過程，累計照射劑量至60 Gy后進行檢測[7]。

3.3MTT實驗測定增殖抑制率 取對照組(未處理食管癌Eca109細胞)和處理組(X射線處理)同時給予0、2、4、6、8 Gy的劑量照射。照射完畢后，立即制成細胞懸液，按5 000 cells/well接種于96孔板，6個復孔，同時設空白組(無細胞的培養(yǎng)液)，5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。于72 h加入5 g/L MTT 20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸去孔內(nèi)上清液，加入DMSO 150 μL，置搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶體充分溶解，在酶標儀上選擇490 nm濾光片測定A值，并記錄結(jié)果。

3.4細胞免疫組化 取對數(shù)生長期的對照組和處理組細胞，按5×107cells/L的細胞密度接種于6孔板中已滅菌處理的蓋玻片上，每孔2 mL，孵育24 h后取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定，3%H2O2-甲醇去除內(nèi)源性過氧化酶活性，10%正常山羊血清封閉15 min，分別加入鼠抗人P-gpⅠ抗、兔抗人HER-2Ⅰ抗，4 ℃濕盒過夜，加入相應的Ⅱ抗，DAB顯色，置于顯微鏡下觀察，待顯色充分后，流水沖洗終止反應。蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，二甲苯透明，樹膠封片，鏡下觀察，照相。P-gp蛋白陽性產(chǎn)物主要位于細胞漿，HER-2蛋白陽性產(chǎn)物主要位于細胞膜，在顯微鏡下隨機計數(shù)5個高倍視野的細胞。免疫細胞化學結(jié)果判定按文獻介紹的染色強度指數(shù)計算法，綜合陽性細胞及染色強度所占百分比2個方面進行半定量分析。染色強度評分：0分：無或染色極淡(陰性-)；1分：淺棕黃色(弱陽性+)；2分：棕黃色(陽性++)；3分：棕褐色(強陽性+++)。陽性細胞百分比(A、B、C、D)分別是-、+、++、+++各種染色強度細胞的百分比。染色強度指數(shù)=A×0+B×1+C×2+D×3。

那么，什么是“危機意識”呢？ 在此，就必須與徐復觀先生所提出的“憂患意識”進行對比分析。 所謂“憂患意識”，首先，它不是來源于對人所無法解決的末日的恐怖與對神的拯救的祈求，而是通過現(xiàn)實的人的行為去尋求解決當前困境或即將發(fā)生的困境的思路，以一種預見或假設的方式為其規(guī)劃自己尚未實行的實際行為以求得對困境的解決。 正因為有著現(xiàn)實存在的社會憂患，身為當事者的人才會對此進行一種反應，并在不斷的預設中發(fā)現(xiàn)自身行為對結(jié)果所產(chǎn)生的影響。 從而產(chǎn)生出對自身行為及行為所能夠引發(fā)的結(jié)果的重視，即責任感。[5]85-89

3.5Northern blotting檢測 取對數(shù)生長期的對照組和處理組食管癌Eca109細胞，按Trizol操作手冊提取細胞總RNA后，用紫外分光光度計和瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性。準備12% 7 mol/L尿素變性膠，在0.5×TBE中350～400V預電泳1 h，每組樣品各15 μL總RNA上樣，電泳，當溴酚藍電泳至4/5處停止電泳；半干轉(zhuǎn)印至尼龍膜；1 200 mJ UV照射；膜于57℃預雜交30min；然后在雜交液中加入100 μg/L的miR-296探針(按照Roche的Dig Oligonucleotide 3’-End Labeling Kit的說明書進行地高辛標記)，雜交過夜。雜交結(jié)束后室溫下5%SDS，1×SSC洗10 min，57 ℃下同樣溶液洗3次，壓磷屏過夜，Typhoon同位素成像儀(GE)掃描同位素信號。

4統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

12組細胞增殖抑制率變化

2組細胞在放療72 h后，處理組的細胞增殖抑制率明顯低于對照組(P<0.05),見表1，說明處理組細胞比對照組放射敏感性低，具有一定的放射抗拒性。

表1 放療后的增殖抑制率

P-gp陽性染色主要位于胞膜和胞漿，HER-2陽性染色主要位于胞膜，2組細胞中P-gp和HER-2均有表達，見圖1、2。根據(jù)文獻查閱細胞免疫化學染色指數(shù)評定，P-gp在對照組染色強度指數(shù)為0.718±0.123，處理組染色強度指數(shù)為1.524±0.423；HER-2在對照組染色強度指數(shù)為0.402±0.089，處理組染色強度指數(shù)為1.196±0.230，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

Figure 1. The expression of HER-2 in esophageal squamous carcinoma cells Eca109(×200).A: control group; B: treatment group.

圖1HER-2在食管癌細胞Eca109中的表達

Figure 2. The expression of P-gp in esophageal squamous carcinoma cells Eca109(×200).A: control group; B: treatment group.

圖2P-gp在食管癌細胞Eca109中的表達

3Northernblotting檢測miR-296的表達

2組細胞中均有miR-296表達，見圖3，由于U6基因含量的穩(wěn)定性，選取U6作為非特異性基因條帶，與miR-296特異性基因條帶進行密度比值分析，對照組miR-29相對值為0.032500±0.001590，處理組的相對值為0.034127±0.003151，兩者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

Figure 3. The miR-296 expression detected by Northern blotting.1,3,5：control group; 2,4,6：treatment group.

圖3Northernblotting檢測miR-296的表達

討 論

目前我們對于食管癌的診治情況較前取得了很大的改善，但其5年生存率仍在20%左右。導致腫瘤治療失敗的原因是腫瘤細胞對治療的抵抗性以及腫瘤的局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移[6]。放射抗拒是一個多基因參與的過程，前期我們在食管癌的放射抗拒機制方面的研究中，推測食管癌的放射抗拒性與MDR1/P糖蛋白等有關。

本實驗通過分次照射、克隆培養(yǎng)，得到具有放射抗性的處理組細胞。MTT實驗檢測2組細胞的增殖抑制率，結(jié)果顯示處理組細胞株的增殖抑制率低，即放射敏感性低。免疫細胞化學法2組細胞中P-gp和HER-2均有表達，但處理組細胞中，兩者表達顯著增加(P<0.01)。進一步證實了處理組細胞的放射抗性。HER-2的過表達對乳腺癌放射抗拒性的產(chǎn)生已有證實，而對于HER-2的過表達與食管癌中的放射抗拒性尚無相關報道。通過本實驗，提示HER-2可能與食管癌放射抗拒有關。

Hristo等[6]采用Northern blotting分析胚胎干細胞中microRNA的表達，發(fā)現(xiàn)miR-296具有胚胎干細胞特異性。Hong等[2]在食管癌旁組織、食管原位癌及食管鱗狀細胞癌中測定miR-296有表達，且呈遞增型。說明miR-296可能與食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。并且指出，miR-296與食管癌的化療耐藥相關，其機制是因為MDR1 可能是miR-296的目標調(diào)節(jié)基因，下調(diào)miR-296，MDR1的表達隨之下調(diào)。對于miR-296與食管癌的放射抗拒是否相關，目前暫無報道。本實驗采用Northern blotting測定食管癌細胞和X射線誘導出有一定放射抗性的細胞中miR-296的表達情況，發(fā)現(xiàn)兩者間并無明顯差異(P>0.05)，暫不能說明miR-296與放射抗拒間具有相關性。

分析其原因，可能有以下幾種情況：其一，miR-296與食管癌放射抗拒確無相關性，不參與食管癌放射抗拒機制的產(chǎn)生。MiR-296調(diào)節(jié)MDR1，而MDR1與P-gp高度相關，但有文獻[8]指出，MDR1基因擴增并不總是能促進蛋白的過度表達，而蛋白的過度表達也不一定依賴基因擴增引起，兩者之間存在著其它未知的作用機制參與MDR1的轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)控。其二，miR-296與食管癌放射抗拒相關。但放射抗拒的產(chǎn)生是一個復雜的過程，有多種基因參與。射線照射后，會立即出現(xiàn)一系列快速反應蛋白，而在后期表達恢復。miR-296可能參與射線照射后的快速反應機制。其三，DNA也具有自我修復功能，對于紫外照射所形成的DNA堿基二聚體，例如T-T二聚體，細胞可通過光修復作用解聚或切除修復。另外，文獻顯示[9]人腦腫瘤的血管內(nèi)皮細胞相比正常腦血管內(nèi)皮細胞，miR-296的表達升高。在體內(nèi)異種移植miR-296抑制物，血管生成減少。此外，在NIH3T3細胞中，經(jīng)UVB照射后，miR-296表現(xiàn)為低表達。說明miR-296可能參與DNA的損傷修復[10]。

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ExpressionofP-gp,HER-2andmicroRNA-296isassociatedwithradiationresistanceinesophagealcarcinoma

ZHU Rui1, WU Qing-ming2, LONG Hui2, CHENG Jing2, LI huan2

(1WuhanUniversityofScienceandTechnology,2TianyouHospitalAffiliatedtoWuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430064,China.E-mail:wuhe9224@sina.com)

AIM: To investigate whether the expression of P-glycoprotein (P-gp),human epidermal growth factor receptor 2(HER-2)and microRNA-296 is associated with the radiation resistance in esophageal cancer.METHODSThe human esophageal squamous carcinoma cell line Eca109 was divided into control group and treatment group. The cells in treatment group were irradiated by X-ray repetitiously (cumulative radiation dose 60 Gy). The difference of the cell proliferation inhibition between the 2 groups was determined by MTT assay. The expression of P-gp and HER-2 in the cells was detected by immunocytochemical method. The differential expression of microRNA-296 in the cells of the 2 groups were identified by Northern blotting.RESULTSCompared with control group, a clear radiation resistance and lower growth inhibition were observed in treatment group. The expression of P-gp and HER-2 in treatment group increased significantly than that in control group. No significant difference of microRNA-296 expression between the 2 groups was observed.CONCLUSIONP-gp and HER-2 are relevant with radiation resistance in esophageal cancer. No significant association between microRNA-296 and radiation resistance in Eca109 cells is showed.

Esophageal neoplasms; Radiation resistance; microRNA-296; Receptors,human epidermal growth factor

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.030