周小虎， 張紅衛(wèi)， 萬云樂

(中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院肝膽外科， 廣東 廣州 510120)

1000-4718(2012)03-0528-06

2011-10-24

2011-12-07

北京市希思科臨床腫瘤學(xué)研究基金會基金資助項目 (No.Y-2009-017).

△通訊作者 Tel：020-34071170；E-mail：hongweizhang88@126.com

·短篇論著·

索拉菲尼對肝硬化大鼠部分肝切除術(shù)后肝臟再生的影響*

周小虎， 張紅衛(wèi)△， 萬云樂

(中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院肝膽外科， 廣東 廣州 510120)

目的在大鼠肝硬化模型的基礎(chǔ)上行肝臟部分切除(PH)，研究索拉菲尼(sorafenib)對大鼠肝臟再生的影響。方法使用二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)Wistar大鼠肝硬化，成功建立30只肝硬化大鼠PH模型后，隨機分2組，每組15只。術(shù)后第1 d開始，分別給予實驗組索拉菲尼(30 mg·kg-1·d-1)、對照組生理鹽水灌胃10 d后處死。留取PH后及實驗結(jié)束后的血液及肝臟標本，檢測2組肝臟再生率(LRR)，增殖細胞核抗原(PCNA)，生化指標： 丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)和血清白蛋白(ALB)、血清總膽紅素(TBIL)和血清直接膽紅素(DBIL)的變化，血管生成相關(guān)因子：血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)、血小板源性生長因子受體β(PDGFR-β)，以及肝臟微血管密度(MVD)的變化。結(jié)果(1)LRR在實驗組及對照組分別為45.43%±3.36%和44.21%±2.77%，無顯著差異(P>0.05)；(2)免疫組織化學(xué)(IHC)沒有檢測到PCNA；(3)2組的生化指標無顯著差異(P>0.05)；(4)實驗組VEGFR-2和PDGFR-β的表達受到抑制，MVD降低，并且實驗組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)。結(jié)論索拉菲尼雖然對肝硬化血管再生相關(guān)因子有抑制作用，但是對肝細胞再生和肝功能沒有明顯影響。

索拉菲尼； 肝硬化； 肝再生； 肝切除術(shù)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤中排第6位，在全球癌癥相關(guān)致死亡原因中排第3位[1]。肝細胞癌是少有的幾個有明確危險因素的癌癥之一，大約80%的HCC病例發(fā)生在肝硬化基礎(chǔ)上，因此肝硬化這一癌前病變是發(fā)生肝細胞癌的最強誘因[2]。手術(shù)是HCC的主要治療手段，早期HCC患者手術(shù)切除后5年生存率可達50%, 但是HCC的術(shù)后復(fù)發(fā)率很高，術(shù)后3年復(fù)發(fā)率為50%，5年復(fù)發(fā)率則高達70%[3]。

索拉非尼(sorafenib)是一種多激酶抑制劑，它對多種受體酪氨酸激酶[如血管內(nèi)皮生長因子受體 2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)、血小板源性生長因子受體(platelet derived growth factor receptor，PDGFR)、Fms樣酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3)、Ret、c-Kit和絲氨酸/蘇氨酸激酶(b-Raf, p38)]發(fā)揮抑制活性，通過抑制VEGFR-2和PDGFR的活性抑制新生血管的形成進而影響腫瘤血供，以及通過Raf激酶通路抑制腫瘤細胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡[4]。Ⅲ期隨機雙盲安慰劑對照臨床試驗證實，索拉非尼用于治療晚期HCC可使患者的生存時間延長3個月[5-7]。由于臨床上大部分肝癌病人合并肝硬化，其中部分肝癌病人的切除手術(shù)難以達到根治性切除，而目前已知索拉菲尼是唯一被證明有效的治療肝癌的系統(tǒng)性治療藥物。 所以，在非根治性肝癌切除術(shù)后早期應(yīng)用索拉菲尼能否抑制殘留癌細胞的生長從而提高生存率已成為臨床關(guān)注的熱點。然而，在肝硬化病人肝部分切除術(shù)后的早期，索拉菲尼是否會抑制肝硬化的肝細胞增殖，并導(dǎo)致肝功能不全，目前仍不清楚。因此，本研究通過建立肝硬化大鼠部分肝臟切除模型，研究索拉菲尼對肝硬化肝臟再生及肝功能的影響。

材 料 和 方 法

1動物及分組

雄性Wistar大鼠，體重170～200 g，喂養(yǎng)于SPF級環(huán)境。索拉菲尼溶解于聚氧乙烯蓖麻油/95% 乙醇 (50∶50，Sigma)，室溫避光保存。在大鼠形成明顯肝硬化后行30%肝部分切除術(shù)(partial hepatectomy , PH)后隨機分2組，每組15只。術(shù)后第1 d開始，實驗組給予索拉菲尼(30 mg·kg-1·d-1)，對照組給予生理鹽水，喂養(yǎng)10 d后處死。收集PH后以及實驗結(jié)束后的大鼠血液及肝臟標本。血液用于肝臟生化檢測，每份肝組織一部分置于多聚甲醛固定24 h后石蠟包埋用于免疫組化檢測，一部分置于液氮速凍后凍存用于Western blotting 分析。

2大鼠肝硬化肝臟部分切除模型的建立

參照華赟鵬等[8]誘導(dǎo)大鼠肝硬化方法，Wistar大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，每天自由飲用含0.095 g/L 二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)(Sigma)的純水60 d后形成明顯的肝硬化，蘇木素-伊紅(HE)染色: 肝內(nèi)假小葉明顯形成。2 d后按照Higgins等[9]方法進行30%部分肝(肝左葉)切除：所有大鼠術(shù)前均禁食24 h，不禁水。戊巴比妥鈉(3O mg/kg)腹腔注射全麻。取腹部正中切口進腹，暴露肝臟左葉，游離肝左葉并結(jié)扎其血管，進而切除肝左葉。模型大鼠術(shù)后分組如上述介紹。

3指標測定

3.1肝臟再生率(liver regeneration rate，LRR)的測定 參照Fan等[10]的實驗方法，預(yù)實驗中我們得到了切除肝重(resected liver weight，RLW)與總肝重(total liver weight)的比值，由此根據(jù)切除的肝重和實驗結(jié)束后殘余肝重(remnant liver weight)，我們得出肝臟再生比率LRR=(Mb-Ma)/Ma×100%。其中Ma為肝部分切除術(shù)后大鼠理論殘肝質(zhì)量，Mb為處死大鼠取標本時的殘余肝質(zhì)量。

3.2肝臟生化指標的測定 處死大鼠時，從下腔靜脈采集血液進行生化檢測：血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT),血清白蛋白(albumin，ALB),總膽紅素(total bilirubin，TBIL),直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)。用于評估肝臟功能。

3.3增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及肝臟血管再生相關(guān)因子VEGFR-2、PDGFR-β、CD31的免疫組化檢測 留取的肝臟組織經(jīng)多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋。連續(xù)切片，厚4 μm。切片常規(guī)脫蠟后蒸餾水沖洗5 min；用30 mL/L H2O2孵育30 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶，0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)抗原修復(fù)10 min，用10 mL/L正常小牛血清孵育20 min封閉；分別滴加Ⅰ抗[PCNA(Dako),PCI0 MAb 1∶50;VEGFR-2(ab39638 goat polyclonal,Abcam,1∶50);PDGFR-β(SC-339 goat polyclonal);CD-31(SC-1506 goat polyclonal；Santa Cruz Biotechnology,diluted 1∶100)]，4 ℃濕盒內(nèi)孵育過夜，PBS沖洗3次×5 min；加多聚體的Ⅱ抗(中杉金橋，PV-6001 PowerVisionTMTwo-Step Histostaining Reagent 二步法免疫組化檢測試劑)，室溫孵育30 min；PBS徹底沖洗；DAB顯色液(中杉金橋，ZLI-9017 DAB Kit) 染色2～5 min。蘇木素復(fù)染；系列乙醇脫水,二甲苯透明；樹膠封片觀察。 組織片置于顯微鏡下×400觀察，每張片隨機選取4個視野，并用數(shù)碼相機(Nikon ECLIPSE, Nis-elment)拍照獲取圖片數(shù)據(jù)。

3.4Western blotting 檢測VEGF、VEGFR-2和PDGFR-β的表達 肝臟組織液氮速凍后-80 ℃冰箱凍存。肝臟組織蛋白提取按照試劑盒說明書進行操作: 稱取100 mg肝組織液氮下研磨成粉狀加入細胞裂解液RAPA及蛋白酶抑制劑PUSF，冰上靜止30 min然后4°離心30 min提取總蛋白。蛋白樣品用樣品緩沖液進行稀釋并煮沸。30 μg蛋白樣品通過凝膠電泳進行分離，然后點轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%(W/V)脫脂奶粉封閉，孵育Ⅰ抗[(兔抗大鼠 VEGF(1∶2 000)，VEGFR-2(1∶2 000)，PDGFR-β(1∶2 000)]4 ℃過夜，洗膜, 孵育羊抗兔結(jié)合的過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶3 000)常溫1 h，洗膜30 min,然后蛋白條帶使用ECL發(fā)光及Western blotting(Amersham Life Science)檢測。Quantity One 軟件用于分析蛋白條帶。

4統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1LRR的比較

結(jié)果顯示,術(shù)后大鼠殘余肝細胞迅速增殖，肝臟體積增大，實驗組和對照組10 d的LRR差異無統(tǒng)計學(xué)意義(45.43% ± 3.36%vs44.22% ± 2.77%，P>0.05))。

2肝細胞PCNA的比較

大鼠肝部分切除術(shù)后10 d，沒有發(fā)現(xiàn)2組肝臟細胞核中陽性染色，2組PCNA表達無顯著差異(P>0.05)。

3肝臟生化指標

結(jié)果顯示,肝部分切除術(shù)后10 d，實驗組大鼠肝功能指標在服用索拉菲尼前后沒有顯著變化，并且實驗組與對照組肝功指標亦無顯著區(qū)別(P>0.05)，見圖1。

圖1Sorafenib組、對照組及肝部分切除術(shù)前肝硬化大鼠的肝功能指標

4肝臟血管再生相關(guān)因子及微血管的變化

4.1索拉菲尼對VEGFR-2表達的抑制作用 圖2顯示，大鼠肝臟部分切除術(shù)后10 d后， 對照組VEGFR-2較處理前增加了36.5%(P<0.01)。用索拉菲尼(30 mg·kg-1·d-1)10 d后，實驗組VEGFR-2的表達較對照組減少了36.7% (P<0.01)。圖3顯示，與處理前相比，對照組VEGFR-2表達增加，用索拉菲尼 10 d后顯著抑制VEGFR-2的表達。實驗組與對照組比有顯著差異(P<0.01)。

4.2索拉菲尼對PDGFR-β表達的抑制作用 結(jié)果顯示,與處理前相比，對照組PDGFR-β增加了24.2%，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗組與對照組相比減少49.8%(P<0.01)，見圖2、3。

4.3索拉菲尼對VEGF的影響 VEGF在對照組中并沒有伴隨VEFGR-2以及PDGFR-β的表達升高而升高，實驗組與對照組比無顯著差異(P>0.05)，見圖2。

4.4索拉菲尼對肝內(nèi)新生血管的影響 免疫組化結(jié)果顯示，與處理前相比，對照組的殘肝中CD31陽性血管增加了76.3%；與對照組相比，實驗組CD31陽性血管減少了73.2%。實驗組與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)，見圖3。

圖2免疫印跡分析Sorafenib組、對照組及肝部分切除的肝組織中VEGFR-2、PDGFR-β及VEGF的表達

圖3免疫組化分析Sorafenib組、對照組及肝部分切除的肝組織中VEGFR-2、PDGFR-β及CD31的表達

討 論

肝臟部分切除術(shù)后其再生的研究已在多個動物模型中開展[11,14-19]。我們在肝硬化模型的基礎(chǔ)上，研究多激酶抑制劑索拉菲尼對肝臟再生、肝臟功能及肝內(nèi)血管生成是否具有抑制作用。這種關(guān)注于肝硬化基礎(chǔ)上肝臟再生的研究，對于任何新藥的療效和潛在的臨床應(yīng)用性的轉(zhuǎn)化型研究來說都是必要的。

我們的研究表明，索拉菲尼對肝硬化大鼠部分肝臟切除后肝臟再生、肝臟生化、肝細胞增殖沒有顯著影響，而對肝內(nèi)血管再生等因子有明顯的抑制作用。我們的結(jié)果顯示，實驗組和對照組大鼠肝臟切除后觀察10 d，發(fā)現(xiàn)2組肝臟都迅速再生且很快恢復(fù)到正常肝臟功能，2組殘肝再生比率沒有顯著差異。實驗結(jié)束后殘肝標本中沒能檢測到PCNA，其可能原因是：肝臟再生后達到穩(wěn)定期，肝細胞分裂增殖停止，不再產(chǎn)生PCNA。肝臟能夠精確的調(diào)節(jié)肝的生長及體積，肝細胞減少能觸發(fā)肝細胞復(fù)制,增大的肝臟則誘導(dǎo)肝細胞凋亡以恢復(fù)到最佳肝體重比率、恢復(fù)肝臟正常功能及體積[20]。 并且有研究證明肝細胞在正常情況下很少分裂增殖，但在肝臟部分切除后24 h就有PCNA表達陽性，48 h達到最高點，隨后減少，術(shù)后10 d就可恢復(fù)到正常水平[11]。

VEGFR-2及PDGFR-β對多階段血管生成過程的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[21-22]。然而索拉菲尼對肝內(nèi)血管再生等因子的抑制作用比較明顯，觀察10 d證實索拉菲尼在實驗組中明顯抑制了VEGFR-2及PDGFR-β，這在索拉菲尼治療惡性腫瘤多項研究中得到體現(xiàn)[4, 23-24]。腫瘤與VEGFR-2和PDGFR-β密切相關(guān)，并且多項研究證明VEGFR-2和PDGFR-β可以促進血管再生促進腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移，本實驗也證實VEGFR-2和PDGFR-β在肝臟部分切除術(shù)后明顯升高，這可能是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的一個關(guān)鍵因素。闞和平等[25]研究表明索拉菲尼對于富含微血管的肝細胞癌肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)有良好的抑制作用。我們的結(jié)果證實實驗組的血管生成較對照組減少約73.2%。對照組血管生成的增加并沒有伴隨VEGF的的高表達，并且其在實驗組和對照組中的表達并沒有明顯變化，這可能是因為索拉菲尼不影響VEGF的表達。另有觀點認為：肝硬化早期增加的VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖和血管的形成，而晚期階段，新生血管的穩(wěn)定與成熟主要通過其它生長因子來調(diào)節(jié)[26-27]。無論如何，血管生成是一個多因素的極其復(fù)雜的過程，由多種因子在不同水平進行調(diào)節(jié)[22]。

總之，我們的研究為證明索拉菲尼對肝硬化部分肝臟切除術(shù)后肝臟再生及血管生成的影響提供了有力的體內(nèi)證據(jù)。索拉菲尼雖然可以抑制肝內(nèi)血管再生相關(guān)因子的表達，但是不影響肝細胞的增殖，不影響肝臟的再生及肝功能。

[1] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics, 2002[J]. CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2] Llovet JM, Burroughs A, Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet,2003,362(9399):1907-1917.

[3] Llovet JM, Schwartz M, Mazzaferro V. Resection and liver transplantation for hepatocellular carcinoma[J]. Semin Liver Dis,2005,25(2):181-200.

[4] Liu L, Cao Y, Chen C, et al. Sorafenib blocks the RAF/MEK/ERK pathway, inhibits tumor angiogenesis, and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5[J]. Cancer Res,2006,66(24):11851-11858.

[5] Llovet J, Ricci S, Mazzaferro V, et al. Sorafenib improves survival in advanced hepatocellular carcinoma (HCC): results of a phase III randomized placebo-controlled trial (SHARP trial).[J]. J Clin Oncol,2007,25(Suppl):962s(abstract LBA1).

[6] Cheng AL, Kang YK, Chen Z, et al. Efficacy and safety of sorafenib in patients in the Asia-Pacific region with advanced hepatocellular carcinoma: a phase III randomised, double-blind, placebo-controlled trial[J]. Lancet Oncol,2009,10(1):25-34.

[7] Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, et al. Sorafenib in advanced hepatocellular[J]. N Engl J Med,2008,359(4):378-390.

[8] 華赟鵬，李紹強，劉 杰，等. 肝硬化大鼠肝癌細胞原位種植瘤模型的建立[J]. 中國病理生理雜志,2009,25(10):2073-2077.

[9] Higgins GM, Anderson RM. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal[J]. Arch Pathol,1931,12:186-202.

[10]Fan YD, Praet M, van Huysse J, et al. Effects of portal vein arterialization on liver regeneration after partial hepatectomy in the rat[J]. Liver Transpl,2002,8(2):146-152.

[11]Kraizer Y, Mawasi N, Seagal J, et al. Vascular endothelial growth factor and angiopoietin in liver regeneration[J]. Biochem Biophys Res Commun,2001,287(1):209-215.

[12]Lee JS, Semela D, Iredale J, et al. Sinusoidal remodeling and angiogenesis: a new function for the liver-specific pericyte?[J]. Hepatology,2007,45(3):817-825.

[13]Mejias M, Garcia-Pras E, Tiani C, et al. Beneficial effects of sorafenib on splanchnic, intrahepatic, and portocollateral circulations in portal hypertensive and cirrhotic rats[J]. Hepatology,2009,49(4):1245-1256.

[14]Assy N, Spira G, Paizi M, et al. Effect of vascular endothelial growth factor on hepatic regenerative activity following partial hepatectomy in rats[J]. J Hepatol,1999,30(5):911-915.

[15]Makino H, Shimizu H, Ito H, et al. Changes in growth factor and cytokine expression in biliary obstructed rat liver and their relationship with delayed liver regeneration after partial hepatectomy[J]. World J Gastroenterol,2006,12(13):2053-2059.

[16]Harun N, Nikfarjam M, Muralidharan V, et al. Liver regeneration stimulates tumor metastases[J]. J Surg Res,2007,138(2):284-290.

[17]Deng M, Huang H, Jin H, et al. The anti-proliferative side effects of AEE788, a tyrosine kinase inhibitor blocking both EGF- and VEGF-receptor, are liver-size-dependent after partial hepatectomy in rats[J]. Invest New Drugs,2011,29(4):593-606.

[18]Bockhorn M, Fingas CD, Rauen U, et al. Erythropoietin treatment improves liver regeneration and survival in rat models of extended liver resection and living donor liver transplantation[J]. Transplantation,2008,86(11):1578-1585.

[19]Shimizu H, Miyazaki M, Wakabayashi Y, et al. Vascular endothelial growth factor secreted by replicating hepatocytes induces sinusoidal endothelial cell proliferation during regeneration after partial hepatectomy in rats[J]. J Hepatol,2001,34(5):683-689.

[20]Fausto N. Liver regeneration[J]. J Hepatol,2000,32(1 Suppl):19-31.

[21]Wilhelm SM, Carter C, Tang L, et al. BAY 43-9006 exhibits broad spectrum oral antitumor activity and targets the RAF/MEK/ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis[J]. Cancer Res,2004,64(19):7099-7109.

[22]Folkman J, D’Amore PA. Blood vessel formation: what is its molecular basis?[J]. Cell,1996,87(7):1153-1155.

[23]Chang YS, Adnane J, Trail PA, et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models[J]. Cancer Chemother Pharmacol,2007,59(5):561-574.

[24]Kim S, Yazici YD, Calzada G, et al. Sorafenib inhibits the angiogenesis and growth of orthotopic anaplastic thyroid carcinoma xenografts in nude mice[J]. Mol Cancer Ther,2007,6(6):1785-1792.

[25]闞和平，譚永法，周 杰. 索拉非尼治療肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的療效與腫瘤組織Ki-67表達及微血管密度的關(guān)系[J]. 中國病理生理雜志,2011,27(8):1549-1551.

[26]Medina J, Caveda L, Sanz-Cameno P, et al. Hepatocyte growth factor activates endothelial proangiogenic mechanisms relevant in chronic hepatitis C-associated neoangiogenesis[J]. J Hepatol,2003,38(5):660-667.

[27]Tanaka S, Mori M, Sakamoto Y, et al. Biologic significance of angiopoietin-2 expression in human hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Invest,1999,103(3):341-345.

Effectofsorafenibonliverregenerationafterpartialhepatoectomyinlivercirrhoticrats

ZHOU Xiao-hu, ZHANG Hong-wei, WANG Yun-le

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:hongweizhang88@126.com)

AIM: To study the effect of sorafenib on the liver regeneration after partial hepatectomy (PH) in cirrhotic rats.METHODSThirty Wistar rats with liver cirrhosis induced successfully with diethylnitrosamine (DEN) underwent 30% PH and then were randomly divided into 2 groups (n=15). The rats in experimental group were fed with sorafenib at dose of 30 mg·kg-1·d-1from the 1st day to the 10th day after PH, while those in control group were fed with vehicle by gavage. The blood and liver tissues of the rats were collected after PH and at the end of the experiment. Liver regeneration rate (LRR) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression were assessed for determining the hepatocyte proliferation. The content of alanine transaminase (ALT), albumin (ALB), total bilirubin (TBIL), direct bilirubin (DBIL), angiogenesis related factors including vascular endothelial growth factor (VEGF), vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2), platelet-derived growth factor receptor β (PDGFR-β) and micro-vessel density (MVD) were measured in both groups.RESULTSLRRs on day 10 after PH were 45.43%±3.36% and 44.21%±2.77% in experimental group and control group, respectively (P>0.05), and the expression of PCNA in hepatic tissues of the rats was not found by the method of immunohistochemistry in both groups. Liver function index had no significant difference between the 2 groups (P>0.05). However, other than VEGF, sorafenib resulted in inhibition of VEGFR-2 and PDGFR-β expression and reduction of MVD in experiment group, and significant difference between the 2 groups was observed (P<0.01).CONCLUSIONSorafenib does not influence live regeneration after PH in liver cirrhotic rats.

Sorafenib; Liver cirrhosis; Liver regeneration; Hepatectomy

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.025