劉淑珍， 尤 鑫， 熊小栓， 劉興德

(貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內科，貴州 貴陽 550000)

1000-4718(2012)03-0453-06

2011-07-21

2012-01-06

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長資金項目(2005)306號

△通訊作者 Tel: 0851-6908608;E-mail:lxd@gmc.edu.cn

#現工作單位：鄭州大學第二附屬醫(yī)院急診科

心肌再灌注對抑郁大鼠心肌細胞凋亡以及bcl-2、bax和caspase-3表達的影響*

劉淑珍#， 尤 鑫， 熊小栓， 劉興德△

(貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內科，貴州 貴陽 550000)

目的探討心肌缺血再灌注(I/R)對抑郁大鼠心肌細胞凋亡及凋亡基因bcl-2、bax和caspase-3的影響。方法Wistar大鼠32只，隨機分為4組，每組各8只。A組：非抑郁大鼠假手術組；B組：抑郁大鼠假手術組；C組：非抑郁大鼠心肌I/R組；D組：抑郁大鼠心肌I/R組。采用慢性輕度不可預知性應激結合孤養(yǎng)制備抑郁模型，用敞箱實驗和液體消耗實驗觀察大鼠行為改變；運用結扎左冠狀動脈前降支的方法復制心肌I/R模型。運用TUNEL法檢測心肌凋亡細胞；運用免疫組化法和逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT- PCR)方法檢測bcl-2、bax和caspase-3的表達。結果(1)與A、B組比較，C、D組心肌細胞凋亡數量顯著增加(P<0.01)，A、B兩組間比較無顯著差異；與C組比較，D組心肌細胞凋亡數量顯著增加(P<0.05)。(2)與A、B組比較，C、D組Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白和mRNA表達顯著增加(P<0.01)，A、B兩組間比較無顯著差異；與C組比較，D組Bcl-2蛋白和mRNA表達顯著減少(P<0.05)，而Bax和caspase-3蛋白和mRNA表達顯著增加(P<0.05)。結論心肌缺血再灌注可加重抑郁大鼠缺血心肌細胞凋亡，其機制可能與上調bax和caspase-3基因表達、下調bcl-2基因表達有關。

心肌再灌注； 抑郁； 大鼠； 細胞凋亡； 基因表達

冠心病(coronary heart disease,CHD)是臨床常見疾病，急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是CHD的嚴重類型，治療AMI的最有效措施就是盡快進行血運重建，使缺血心肌恢復再灌注，然而，血運重建后常常出現心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。有學者報道[1]，伴抑郁癥的心血管疾病患者的死亡率明顯增加，且抑郁癥在冠心病患者中常常同時存在。那么，伴有心理障礙的冠心病患者一旦發(fā)生AMI而行經皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention,PCI)治療，是否因為合并的抑郁障礙加重再灌注損傷尚不清楚。業(yè)已證實，I/R損傷包括再灌注心律失常、心肌頓抑和心肌細胞壞死、凋亡等[2]。本研究擬探討心肌再灌注對抑郁大鼠缺血心肌細胞凋亡的影響及凋亡相關調控基因bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)、bax(B-cell lymphoma/leukemia-2-associated X gene)和caspase-3表達的影響。為臨床合并抑郁癥的冠心病患者有效防治心肌再灌注損傷提供基礎研究資料。

材 料 和 方 法

1動物

Wistar大鼠，雌雄各半，體重200～250 g，貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供。

2主要試劑

TUNEL細胞凋亡試劑盒、免疫組化試劑盒、Bax Ⅰ抗(兔抗IgG)、Bcl-2 Ⅰ抗(兔抗IgG)、caspase-3 Ⅰ抗及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司；RNAprep pure Tissue Kit、TIANScript RT Kit、DNA marker和2×Taq Plus PCR MasterMix均購自天根生化公司；瓊脂糖(西班牙)。所用引物用Primer Pre-mier 5.0軟件設計，由上海生工生物工程有限公司合成，見表1。

表1 引物序列

3主要方法

3.1抑郁模型的制備 大鼠熟悉飼養(yǎng)環(huán)境1周進行抑郁模型復制。根據文獻[3]，進行敞箱實驗水平運動和垂直運動，總得分低于30分和高于120分的動物予以剔除(本研究大鼠抑郁模型復制前為80～120分)。每日隨機選擇以下一種慢性溫和的不可預知性應激刺激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)：冷水游泳(4 ℃，5 min)，傾斜鼠籠24 h，潮濕墊料24 h，晝夜環(huán)境顛倒，熱環(huán)境 (40 ℃，5 min)，2 h行為限制，夾尾 (1 min)，搖晃(持續(xù)15 min)、懸尾，連續(xù)21 d并孤養(yǎng)。第22 d行敞箱實驗和液體消耗實驗確定抑郁模型是否復制成功。

敞箱實驗(open-field test)行為測評：敞箱分析箱(80 cm×80 cm×60 cm)周壁為黑色，底面為面積相等的25塊方格，將大鼠放入中央格，觀察5 min活動情況。主要觀察指標為中央格停留時間、穿越格子數、站立次數等。以大鼠穿越底面方格為水平活動得分 (3爪以上跨入記為 1分 )，以直立次數為垂直活動得分(兩前肢離地 1 cm以上記為 1分 )。測定5 min內水平及垂直活動得分，總和為總評分。模型復制后均在30分以下，最少達10分。表現為大鼠自發(fā)性探究行為明顯減弱，運動能力降低，表示抑郁模型復制造模成功。

液體消耗實驗(fluid comsumption test)，實驗前48 h，訓練大鼠適應飲含糖水，給動物雙瓶飲水，一瓶為1%的蔗糖溶液，另一瓶為普通自來水。24 h的禁水禁食后，同時給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水：一瓶1%蔗糖水，一瓶普通自來水，雙瓶重量一致，飲水24 h，然后通過稱取飲水瓶的重量計算動物的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗，最后計算大鼠的糖水偏愛(%)=糖水攝入/總液體消耗×100%。模型復制后大鼠天生偏好糖水的興趣下降，表示抑郁模型造模成功。

3.2大鼠心肌I/R模型的制備[4]動物麻醉后，行氣管切開及氣管插管后，采用左胸正中旁切口開胸，暴露心臟，于左心耳與肺動脈圓錐之間找到左冠狀動脈，在動脈起始點下方2～3 mm處用6/0號絲線穿線結扎左冠狀動脈前降支45 min后松開結扎線使心肌再灌注。記錄肢導聯心電圖，缺血時S-T段弓背抬高，再灌注后S-T段回落超過50%為模型復制成功(非抑郁大鼠心肌I/R模型操作同抑郁大鼠)。抑郁假手術組只在其左前降支穿線不結扎(非抑郁大鼠假手術操作同抑郁假手術大鼠)。術后予以肌內注射青霉素鈉1×105U預防感染。

3.3實驗分組 Wistar大鼠(32只)隨機分為4組，每組8只。A組：非抑郁大鼠假手術組；B組：抑郁大鼠假手術組；C組：非抑郁大鼠心肌I/R組；D組：抑郁大鼠心肌I/R組。術后7 d處死，取左室缺血區(qū)心肌3份，其中1份置于4%多聚甲醛中，2份置于液氮中冷凍保存?zhèn)錂z。

3.4大鼠心肌細胞凋亡的檢測 用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，嚴格按照試劑盒說明書進行。

3.5大鼠缺血心肌細胞Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達的檢測 用SABC免疫組織化學方法，嚴格按照試劑盒的說明書操作，其中caspase-3檢測的是活化的caspase-3。應用Image-Pro Plus圖像分析系統進行計算機圖像分析，測定平均吸光度值(A/area)作半定量分析。

3.6RT-PCR (1)采用RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒在無菌無酶的條件下操作提取總RNA；(2)采用TIANScript RT Kit進行RNA逆轉錄成cDNA；(3)采用2×Taq Plus PCR MasterMix試劑盒進行PCR擴增反應。然后，5 μL DNA marker點樣，取RT-PCR產物5 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，mRNA的相對含量=同一泳道目的片段積分吸光度值/內參β-actin積分吸光度值。

4統計學處理

結 果

1心肌再灌注對抑郁大鼠心肌細胞凋亡的影響

由圖1、表2可見，與A、B組比較，C、D組心肌細胞凋亡數量顯著增加(P<0.01)，A、B兩組間比較無顯著差異；與C組比較，D組心肌細胞凋亡數量顯著增加(P<0.05)。

Figure 1. Apoptosis of rat myocardial cells in different groups (TUNEL, ×400). A: sham group; B: sham depression group; C: myocardial I/R group; D: myocardial I/R + depression group.

圖1各組大鼠心肌細胞的凋亡情況

表2大鼠心肌細胞凋亡結果

GroupApoptoticindexSham2.63±0.86Shamdepression2.92±0.94MyocardialI/R38.60±1.86▲▲MyocardialI/R+depres-sion41.00±1.66▲▲★

▲▲P<0.01vssham or sham depression；★P<0.05vsmyocardial I/R.

2心肌再灌注對抑郁大鼠心肌細胞Bcl-2、Bax和活化的caspase-3蛋白表達的影響

由圖2、表3可見，與A、B組比較，C、D組Bcl-2、Bax和活化的caspase-3蛋白表達顯著增加(P<0.01)，A、B兩組間比較無顯著差異；與C組比較，D組Bcl-2蛋白表達顯著減少(P<0.05)，而Bax和活化的caspase-3蛋白表達顯著增加(P<0.05)。

3心肌再灌注對抑郁大鼠心肌細胞bcl-2、bax和caspase-3mRNA表達的影響

由圖3、表4可見，與A、B組比較，C、D組bcl-2、bax和caspase-3 mRNA表達顯著增加(P<0.01)，A、B兩組間比較無顯著差異；與C組比較，D組bcl-2 mRNA表達顯著減少(P<0.05)，bax和caspase-3 mRNA表達顯著增加(P<0.05)。

討 論

1心肌再灌注對抑郁大鼠心肌細胞凋亡的影響

在正常情況下，心肌細胞屬于不可再生細胞，生物個體成熟后心肌細胞凋亡非常少見，但當心臟處于某種病理狀態(tài)下，如心臟負荷過重或心肌缺血時，心肌細胞凋亡大量發(fā)生[5]。

目前，PCI已成為臨床冠心病治療的重要方式，對冠心病的血運重建策略產生重大影響。但有研究顯示[6]，PCI后有的病例發(fā)生血壓驟降、心功能不全、心律失常甚至猝死等一系列病情反而惡化的現象，這與心肌再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)有關，MIRI是指組織缺血缺氧性損傷不但發(fā)生于缺血當時，更主要是發(fā)生于恢復血液灌注后，而細胞凋亡被認為是心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)之一，細胞凋亡數目的多少決定了MIRI的嚴重程度。近年來冠心病和抑郁癥的緊密聯系也越來越引起國內學者的重視。有研究表明[7]，冠心病合并抑郁癥患者心血管不良事件的發(fā)生率明顯升高，抑郁影響冠心病的發(fā)生、發(fā)展及其預后。但合并抑郁的冠心病患者罹患AMI后進行血運重建時對再灌注損傷影響如何？報道較少。

本研究顯示，合并抑郁的心肌梗死大鼠再灌注后，心肌細胞凋亡顯著增加，提示心肌缺血再灌注可能導致合并抑郁的大鼠更嚴重的再灌注損傷，提醒我們在臨床上應高度重視合并抑郁的高危冠心病心肌梗死患者科學防治。抑郁加重大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡的機制尚不清楚，可能與凋亡相關調控基因有關。

Figure 2. Expression of Bcl-2, Bax and activated caspase-3 proteins in rat myocardial cells from different groups (immunohistochemical staining, ×400). A: sham group; B: sham depression group; C: myocardial I/R group; D: myocardial I/R + depression group.

圖2各組大鼠心肌細胞Bcl-2、Bax和活化caspase-3蛋白的表達

表3大鼠心肌細胞Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達結果

GroupBcl-2BaxCaspase-3Sham0.062±0.0150.062±0.0170.153±0.016Shamdepression0.065±0.0130.070±0.0150.162±0.017MyocardialI/R0.171±0.019▲▲0.180±0.014▲▲0.305±0.014▲▲MyocardialI/R+depression0.153±0.014▲▲★0.204±0.027▲▲★0.324±0.017▲▲★

▲▲P<0.01vssham and sham depression；★P<0.05vsmyocardial I/R.

表4大鼠心肌細胞bcl-2、bax和caspase-3mRNA表達的影響

Groupbcl-2/β-actinbax/β-actincaspase-3/β-actinSham0.300±0.0220.320±0.0370.101±0.008Shamdepression0.288±0.0260.371±0.0380.116±0.006MyocardialI/R0.574±0.042▲▲0.629±0.066▲▲0.416±0.025▲▲MyocardialI/R+depression0.457±0.038▲▲★0.771±0.044▲▲★0.475±0.021▲▲★

▲▲P<0.01vssham and sham depression；★P<0.05vsmyocardial I/R.

Figure 3. Expression of bcl-2, bax and caspase-3 mRNA in rat myocardial cells from different groups. M: marker; A: sham group; B: sham depression group; C: myocardial I/R group; D: myocardial I/R + depression group.

圖3各組大鼠心肌細胞bcl-2、bax和caspase-3mRNA的表達

2心肌再灌注對抑郁大鼠凋亡基因bcl-2和bax表達的影響

細胞凋亡是一種受基因調控的主動性細胞死亡，表現為凋亡信號通路的啟動和相關基因的表達。已經明確凋亡存在著3種信號轉導途徑：死亡受體途徑、線粒體途徑和內質網信號途徑[8]。

bcl-2家族[9]是目前最主要的凋亡調控基因，通過線粒體途徑調控細胞凋亡。bcl-2基因家族包括兩大類：抑制凋亡的基因如bcl-2等和促凋亡基因如bax等。在哺乳動物類細胞中，凋亡抑制基因bcl-2和凋亡刺激基因bax與細胞的凋亡關系極為密切，Bax和Bcl-2分別可以以同源二聚體或異源二聚體形式存在，Bax-Bcl-2 異源二聚體較穩(wěn)定, 無誘導凋亡的作用,而當Bax較Bcl-2絕對或相對增高，Bax-Bax同源二聚體形成，便誘導凋亡。近年來越來越多的實驗顯示，抑郁因素與心肌細胞凋亡的相關性關系密切[10]，抑制心肌細胞凋亡可以減輕心肌IR損傷[11]。

本研究顯示，myocardial I/R組大鼠的Bcl-2和Bax顯著增高，其中Bax的增加較為明顯，提示這與心肌細胞缺血再灌注后出現明顯的細胞凋亡有關，與文獻報道相似。本研究還顯示，與myocardial I/R相比，myocardial I/R depression組Bax蛋白的表達顯著增高，而Bcl-2蛋白的表達顯著降低，推測抑郁因素可能通過下調bcl-2的表達和上調bax的表達，從而促進加重了大鼠I/R心肌細胞凋亡。然而細胞凋亡是一個受到高度調節(jié)的基因表達的結果 ,有許多基因參與其中，本文僅探討了抑郁因素對I/R損傷過程中凋亡相關基因bcl-2和bax表達的影響，而抑郁因素是如何引起凋亡相關基因bcl-2和bax表達的變化,其具體的分子機制或信號轉導途徑尚有待進一步深入研究。

3心肌再灌注對抑郁大鼠凋亡基因caspase-3表達的影響

細胞凋亡的最終途徑為激活caspases-3蛋白酶[12]。Caspase在細胞凋亡過程中是起著必不可少的作用，細胞凋亡的過程實際上是caspase酶系介導的保持細胞完整性裂解底物的過程。Caspase按功能分為啟動子caspase(caspase-2,8,9,10)和效應子caspase(caspase-3,6,7)，效應子被啟動子激活,執(zhí)行最終的凋亡效應。Caspase-3是caspase家族一種重要的蛋白酶，通常以無活性的酶原形式存在，被激活后引發(fā)“瀑布式”級聯反應，對特定底物進行切割核酸內切酶，降解 DNA 修復酶，從而破壞細胞骨架蛋白和核蛋白，使染色體斷裂成小片段，最終導致細胞死亡[13]。在體心臟實驗表明,再灌注損傷和心肌梗死均能誘發(fā)心肌細胞凋亡。大量臨床資料也表明，細胞凋亡參與人類心肌梗死的病理過程。當前，細胞凋亡是缺血性心臟病研究的較新課題，具有重要的理論意義和臨床應用價值。I/R時細胞凋亡的機制尚未完全清楚，而 caspase-3激活是 I/R損傷發(fā)生發(fā)展的重要因素，是凋亡發(fā)生的標志酶[14]。但心肌再灌注對冠心病合并抑郁癥患者缺血心肌組織凋亡基因caspase-3的影響目前研究報道尚少。

本研究顯示，心肌缺血再灌注增加抑郁大鼠caspase-3 mRNA的表達，提示抑郁可能通過上調caspase-3 mRNA的表達而促進抑郁大鼠I/R心肌細胞凋亡。

綜上所述，本研究采用CUMS合并單籠孤養(yǎng)，建立大鼠抑郁模型，從而促進加重了大鼠心肌缺血再灌注后缺血心肌的細胞凋亡，提示抑郁因素在缺血再灌注后心肌的恢復過程中可能起促進作用。然而細胞凋亡是一個受到高度調節(jié)的基因表達的結果，有許多基因參與其中,本文僅探討了抑郁因素對I/R損傷過程中凋亡相關基因bcl-2、bax和caspase-3表達的影響還遠不夠全面，對此尚需作進一步的研究。

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Effectofmyocardialreperfusiononcardiocyteapoptosisandexpressionofbcl-2,baxandcaspase-3inratswithdepression

LIU Shu-zhen, YOU Xin, XIONG Xiao-shuan, LIU Xing-de

(DepartmentofCardiology,TheAffiliatedHospital,GuiyangUniversity,Guiyang550000,China.E-mail:lxd@gmc.edu.cn)

AIM: To explore the effect of ischemia/reperfusion (I/R) on cardiac myocyte apoptosis and the expression ofbcl-2,baxandcaspase-3 in the rats with depression.METHODSThirty-two Wistar rats were randomly divided into 4 groups,including group A: sham operation group; group B: the rats with depression undergoing sham operation; group C: the rats with myocardial I/R operation; group D: the rats with depression undergoing myocardial I/R operation. The rat model of depression was produced by chronic mild unpredictable stress and separation. The behaviors of the rats were detected by open field test and fluid consumption test. The myocardial I/R model was made by ligating the left anterior descending branch of coronary artery in the rats. The apoptotic cardiomyocytes were detected byinsituTdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) method, and the expression ofbcl-2,baxandcaspase-3 was detemined by the methods of immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).RESULTSCompared with group A and group B, the numbers of apoptotic cardiomyocytes in group C and group D were significantly increased (P<0.01), and the expression ofbcl-2,baxandcaspase-3 in group C and group D was also significantly increased (P<0.01). No significant difference between group A and B was observed. Compared with group C, the number of apoptotic cardiomyocytes in group D was significantly increased (P<0. 05).The gene expression ofbcl-2 in group D was decreased significantly (P<0.05), while the gene expression ofbaxandcaspase-3 in group D was significantly increased (P<0.05).CONCLUSIONMyocardial reperfusion increases apoptosis in ischemic cardiomyocytes in the rats with depression. The mechanisms may be associated with up-regulating the gene expression ofbaxandcaspase-3 while down-regulatingbcl-2 expression.

Myocardial reperfusion; Depression;Rats; Apoptosis; Gene expression

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.012