鄧必高， 但 伶， 曹慧靈

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院麻醉科，重慶 400010)

1000-4718(2012)04-0746-05

2011-07-12

2011-10-24

△通訊作者 Tel: 023-63693472; E-mail: danling1@sohu.com

異丙酚對大鼠內(nèi)毒素腦損傷AIF表達和細胞凋亡的影響

鄧必高， 但 伶△， 曹慧靈

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院麻醉科，重慶 400010)

目的研究凋亡誘導因子(AIF)和細胞凋亡在大鼠內(nèi)毒素(LPS)腦損傷中的變化情況，探討異丙酚在腦損傷中的保護作用及其機制。方法SD大鼠72只，雌雄不限，體重220～250 g，隨機分為3組(n=24)：內(nèi)毒素組(LPS組)和內(nèi)毒素+異丙酚組(LPS+propofol組)經(jīng)左頸內(nèi)動脈注射LPS(1 mg/kg)建立大鼠內(nèi)毒素腦損傷模型，對照組(control組)經(jīng)頸內(nèi)動脈注射等量生理鹽水，LPS+propofol組頸內(nèi)動脈注射LPS后即予異丙酚100 mg/kg劑量腹腔注射。3組分別于6、12、24和48 h隨機處死6只大鼠，取額葉皮質(zhì)，檢測腦組織含水量，Annexin V-PI法檢測神經(jīng)細胞凋亡,免疫組織化學檢測AIF、NF-κB和caspase-3表達水平的變化，Western blotting測AIF表達的變化。結(jié)果與對照組相比，LPS組和LPS+propofol組各時點腦組織含水量增高，凋亡細胞增多，AIF、NF-κB和caspase-3表達增加(P<0.05,P<0.01)；與 LPS組比較, LPS+propofol組各時點腦含水量、凋亡細胞、AIF、NF-κB和caspase-3表達明顯減少 (P<0.05,P<0.01)。結(jié)論異丙酚減輕大鼠內(nèi)毒素性腦損傷的機制與抑制腦組織AIF表達水平及減輕神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。

異丙酚； 感染性腦損傷； 脂多糖類； 凋亡誘導因子； 細胞凋亡

內(nèi)毒素引起的腦損傷與多種炎癥因子大量釋放有關(guān)[1]，導致神經(jīng)細胞的損傷和凋亡，引起彌漫性腦功能障礙，嚴重可發(fā)展為膿毒性腦病及多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfanction syndrome，MODS)[2],是臨床重癥治療中的難點。大量研究表明，靜脈麻醉藥異丙酚(propofol)可影響多種細胞因子和炎癥反應通路，具有抗自由基、抗脂質(zhì)過氧化反應的功能[3]，以及減輕炎癥反應的作用[4]，有良好的免疫調(diào)節(jié)功能和潛在的神經(jīng)保護作用，但其對腦損傷時AIF是否產(chǎn)生影響尚未見相關(guān)報道，本研究采取建立大鼠內(nèi)毒素腦損傷模型，觀察異丙酚對內(nèi)毒素腦損傷后凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor,AIF)、NF-κB和caspase-3蛋白的表達及細胞凋亡的影響，進一步探討異丙酚腦保護作用的機制。

材 料 和 方 法

1藥物和試劑

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，批號為E.coli055∶B5，Sigma；異丙酚(批號為0912211 XLH 09，四川國瑞藥業(yè)有限責任公司)；AIF批號為BS2407)、NF-κB p65(批號為BS4135)和caspase-3(批號為BS1518)多克隆抗體(Bioworld)；SABC免疫組化染色試劑盒(批號為SA1020，武漢博士德生物工程有限公司)；RIPA裂解液(批號為P0013B，碧云天生物技術(shù)研究所)；HRP-羊抗兔IgG(批號為GAR-HRP，Pierce)；牛血清白蛋白 (批號為23209,Pierce)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(批號為KGA106，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

2動物模型及分組

健康清潔級SD大鼠72只，雌雄不限，220～250 g，重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供。隨機分為3組：10%水合氯醛(350 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，行頸正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、左頸內(nèi)動脈和左頸外動脈，結(jié)扎左頸外動脈，用微動脈鉗夾閉左頸總動脈近心端，行左頸總動脈遠心端穿刺，LPS組、LPS+propofol組經(jīng)左頸內(nèi)動脈于15 s注射LPS 1 mg/kg(生理鹽水稀釋至0.2 mL)，對照組給予等容量生理鹽水，LPS+propofol組于頸內(nèi)動脈注射LPS后即予異丙酚100 mg/kg劑量腹腔注射，術(shù)畢止血縫合傷口。3組分別于6、12、24和48 h處死6只大鼠。

3標本采集及處理

用10%的水合氯醛(350 mg·kg-1)對大鼠進行麻醉后，快速斷頭取腦、冰上分離取出腦組織，經(jīng)視交叉垂直于額葉皮質(zhì)冠狀切取約3 mm厚腦組織塊置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片后用于HE染色、免疫組化檢測；同時迅速取額葉皮質(zhì)組織置于-80 ℃冰箱低溫保存，用于Western blotting檢測；其余腦組織用于含水量檢測及細胞凋亡檢測。

4腦組織含水量的測定

取新鮮腦組織，用濾紙蘸干表面血跡，電子天平稱濕重，置105 ℃烘箱中烘烤24 h后取出稱干重，按照Elliotl公式計算腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

5免疫組化染色觀察腦組織AIF、NF-κB和caspase-3的表達

取石蠟切片脫蠟、水化，嚴格按說明書步驟操作，鏡下觀察陽性表達為細胞漿或細胞核染色呈棕黃色。陰性對照以PBS代替Ⅰ抗。各組隨機取6張免疫組化染色切片，在顯微鏡下隨機采集5個高倍鏡(400倍)視野進行照相，圖像資料使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定每個視野陽性染色區(qū)域的吸光度值，求取每張切片的平均吸光度值進行統(tǒng)計分析。

6Westernblotting檢測腦組織AIF的表達

從-80 ℃冰箱中取出腦組織，加入RIPA裂解液(強)，冰上裂解勻漿30 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，置于-80 ℃冰箱備用。BSA法測定總蛋白量。取蛋白樣量20 μg，加入SDS上樣緩沖液煮沸5 min，行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)3 h，室溫搖床封閉1 h，加AIF多克隆抗體(1∶500)4 ℃搖床上封閉過夜，TBST洗膜5 min×3次，Ⅱ抗室溫封閉1 h，ECL化學發(fā)光、X光片記錄結(jié)果。內(nèi)參照為β-actin。膠片掃描、成像，用Quantity One 4.6.2軟件進行蛋白條帶灰度分析。

7AnnexinV-PI染色法檢測細胞凋亡

取新鮮腦組織，于200目細胞篩輕輕研碎,PBS液沖洗，收集其單細胞懸液，嚴格按說明書操作，行流式細胞儀檢測，用CellQuest Pro軟件進行結(jié)果分析。

8統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1光鏡結(jié)果

腦組織HE染色可見對照組無明顯變化，LPS組和LPS+propofol組血管周圍間隙增寬，炎性細胞浸潤，部分神經(jīng)細胞出現(xiàn)變形和空泡變性，可見核固縮及尼氏小體明顯縮小，且神經(jīng)元數(shù)量有所減少；LPS+propofol組損傷改變相對LPS組較輕，見圖1。

Figure 1. The results of HE staining (×400). A: control group; B: LPS group; C: LPS+propofol group.

圖1HE染色結(jié)果

2腦組織含水量

與對照組比較,LPS組和LPS+propofol組在各時點腦水腫程度明顯增高 (P<0.05)，其水腫在6 h達高峰,12 h仍維持在較高水平；與 LPS組比較, LPS+propofol組腦組織含水量明顯減少(P<0.05，P<0.01),見表1。

表1 各組腦組織含水量比較

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLPS.

3免疫組化檢測AIF、NF-κB和caspase-3的表達

AIF、NF-κB和caspase-3陽性細胞在對照組幾無表達，LPS組在6 h開始有少量表達，陽性細胞呈棕黃色著色，主要位于胞漿，12 h表達逐漸增強，著色加深，24 h達高峰，胞漿、胞核中均見著色，48 h則呈下降趨勢；LPS+propofol組各時點較LPS組陽性細胞表達明顯減少，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，見圖2、3、4及表2。

Figure 2. AIF positive cells in cortex shown by immunohistochemical assay(×400).A:control group; B: LPS group; C: LPS+propofol group.

圖2免疫組化檢測AIF陽性細胞的表達

Figure 3. NF-κB positive cells in cortex shown by immunohistochemical assay(×400).A:control group; B: LPS group; C: LPS+propofol group.

圖3免疫組化檢測NF-κB陽性細胞的表達

Figure 4. Caspase-3 positive cells in cortex shown by immunohistochemical assay(×400).A: control group; B: LPS group; C: LPS+propofol group.

圖4免疫組化檢測caspase-3陽性細胞的表達

表2 各組AIF、NF-κB和Caspase-3平均吸光度值比較

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLPS.

4Westernblotting檢測AIF的表達

AIF在對照組僅少量表達，LPS組從6 h開始蛋白表達帶逐漸增強，24 h達高峰，48 h仍處于較高水平，其趨勢與免疫組化一致；LPS+propofol組各時點較LPS組蛋白表達帶明顯減少，吸光度的分析比較顯示其具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. AIF protein expression in cortex detected by Western blotting.Lane 1: control group(6 h); Lane 2: LPS group(6 h);Lane 3: LPS+propofol group(6 h); Lane 4: LPS group(12 h);Lane 5: LPS+propofol group(12 h); Lane 6: LPS group(24 h);Lane 7: LPS+propofol group(24 h);Lane 8: LPS group(48 h); Lane 9: LPS+propofol group(48 h).*P<0.05vscontrol;##P<0.01vsLPS.

圖5腦皮層不同時點AIF蛋白表達

5AnnexinV-PI染色法檢測細胞凋亡

對照組細胞凋亡率較低，LPS組凋亡細胞從6 h開始增多，24 h達高峰，48 h仍處于較高水平；LPS+propofol組各時點較LPS組細胞凋亡率明顯減低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6、表3。

討 論

參照王懷立等[5]的方法，本研究經(jīng)大鼠頸內(nèi)動脈注射LPS建立內(nèi)毒素腦損傷模型，結(jié)果表明，LPS組大鼠腦組織含水量較對照組各時點明顯增高，結(jié)合光鏡下觀察HE染色結(jié)果，提示腦細胞水腫和血腦屏障破壞，模型制備成功。

LPS是內(nèi)毒素的主要成分, 可促使CD14、腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體(TRAIL)、Toll樣受體4(TLR4)、NF-κB、Fas等凋亡相關(guān)受體表達的增加，誘發(fā)全身炎癥反應，引起細胞凋亡，導致多臟器損傷[6-7]。研究表明，細胞凋亡在腦損傷中有明確表現(xiàn)，并且其腦損傷程度和細胞凋亡有著直接的聯(lián)系[8]。研究表明，細胞凋亡存在著線粒體途徑(內(nèi)源性途徑)和細胞死亡受體途徑(外源性途徑)兩種相互關(guān)聯(lián)的途徑[9]，AIF在線粒體途徑起主導作用，而caspase-3和NF-κB等則在細胞表面死亡受體途徑中發(fā)揮重要作用。AIF介導的細胞凋亡是不依賴caspase 通路的細胞凋亡途徑, 并且AIF的促凋亡活性不受caspase抑制劑的抑制。Joza等[10]敲除小鼠胚胎干細胞的AIF基因后，發(fā)現(xiàn)其比野生鼠具有更強的凋亡耐受能力。Culm see等[11]研究發(fā)現(xiàn),AIF的下調(diào)可明顯減少神經(jīng)細胞凋亡。同樣，減少caspase-3和NF-κB在損傷腦組織中的表達，也能起到抑制神經(jīng)細胞凋亡和減輕腦損傷的作用[12-13]。

本實驗結(jié)果顯示，大鼠內(nèi)毒素腦損傷后能夠使AIF激活，LPS組AIF、caspase-3和NF-κB的表達明顯增加，于6 h開始逐漸增高，24 h達到高峰，與凋亡細胞的動態(tài)變化一致，提示內(nèi)源性和外源性凋亡途徑均參與了內(nèi)毒素腦損傷后神經(jīng)元的凋亡過程。異丙酚是目前廣泛用于臨床的靜脈麻醉藥，研究表明異丙酚能夠有效地減輕細胞凋亡，具有保護作用。Yeh等[14]研究發(fā)現(xiàn),異丙酚能夠減輕LPS所導致的肺上皮細胞凋亡，Cattano等[15]研究發(fā)現(xiàn)使用低劑量的異丙酚能夠減輕幼鼠神經(jīng)元凋亡和損傷。本實驗結(jié)果顯示，異丙酚處理后明顯減輕大鼠腦水腫和細胞凋亡，各時點AIF、NF-κB和caspase-3的表達水平也明顯下降，提示異丙酚可能同時通過阻斷內(nèi)源性和外源性兩條細胞凋亡途徑，減少AIF和caspase-3表達，在一定程度上減少神經(jīng)細胞凋亡而發(fā)揮腦保護作用。

綜上所述，推測異丙酚減輕大鼠內(nèi)毒素腦損傷的機制可能與其抑制腦組織AIF表達水平，同時下調(diào)NF-κB和caspase-3的表達有關(guān)。對于異丙酚抗細胞凋亡機制進行深入研究,可能會對異丙酚的臨床應用提供新的理論依據(jù)。

Figure 6. Apoptotic cells in cortex shown by Annexin V-PI staiming.

圖6AnnexinV-PI染色法檢測皮質(zhì)凋亡細胞

表3 各組腦組織細胞凋亡率的比較

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

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EffectsofpropofolonexpressionofAIFandcellapoptosisinbraintissuesoftheratswithLPS-inducedbraininjury

DENG Bi-gao, DAN Ling, CAO Hui-ling

(DepartmentofAnesthesiology,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:danling1@sohu.com)

AIM: To investigate the effects of propofol on the expression of apoptosis-inducing factor (AIF) and cell apoptosis in brain tissues of rats with lipopolysaccharide(LPS)-induced brain injury.METHODSSeventy-two male and female SD rats weighing 220～250 g were randomly divided into 3 groups (n=24 each). Cerebral edema was induced by injection of LPS at 1 mg/kg via left internal carotid artery in LPS group and LPS+propofol group. In control group, equal volume of normal saline was administered instead of LPS. The rats in LPS+propofol group

intraperitoneal injection of propofol at 100 mg/kg immediately after LPS administration. Six rats in each group were decapitated 6 h, 12 h, 24 h or 48 h after operation and the frontal lobe cortex were immediately removed for determination of the water content. The apoptotic neurons were detected by Annexin V-PI staining. The protein levels of AIF, NF-κB and caspase-3 were measured by immunohistochemistry. The protein expression of AIF was detected by Western blotting analysis.RESULTSCompared with control group, the brain water content, the number of neuronal apoptosis and the protein expression levels of AIF, NF-κB and caspase-3 were significantly increased in LPS group and LPS+propofol group. Compared with LPS group, the results mentioned above were markedly reduced in LPS+propofol group.CONCLUSIONPropofol attenuates LPS-induced brain injury by decreasing AIF protein expression and inhibiting apoptosis.

Propofol; Infectious brain injury; Lipopolysaccharides; Apoptosis-inducing factor; Apoptosis

R641

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.031