王能里， 南 燕， 柳艷麗， 林 素， 葉 偉， 唐震海， 林 錦， 林振浪

(溫州醫(yī)學院附屬育英兒童醫(yī)院新生兒科，浙江 溫州 325027)

1000-4718(2012)04-0760-06

2011-10-05

2011-12-27

浙江省自然科學基金資助項目(No.Y2101067)；浙江省科技廳錢江人才計劃項目(No.2009R10054)；溫州市科技局對外科技合作交流項目(No.H2008055)

△通訊作者 Tel: 0577-88816211; E-mail: linzhenlang@hotmail.com

·實驗技術·

近足月胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型的建立*

王能里， 南 燕， 柳艷麗， 林 素， 葉 偉， 唐震海， 林 錦， 林振浪△

(溫州醫(yī)學院附屬育英兒童醫(yī)院新生兒科，浙江 溫州 325027)

目的建立近足月(29 d胎齡)胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型，為深入研究新生兒缺氧缺血性腦損傷發(fā)病機制和治療提供合適模型。方法選擇孕29 d健康新西蘭白兔24只，聯(lián)合全身麻醉和腰麻對孕兔進行麻醉，從左側股動脈插入4F Fogarty動脈取栓導管，實驗組向導管球囊內(nèi)注入生理鹽水0.3 mL阻斷孕兔子宮血供，阻斷時間分別為20 min、25 min、28 min、30 min和40 min，每組4只；對照組插管后不注入生理鹽水，共4只。24 h后行剖宮產(chǎn)，記錄新生兔一般情況，評估新生兔神經(jīng)行為學和腦組織病理學改變。結果麻醉過程中孕兔生命體征穩(wěn)定，未發(fā)生低氧血癥，對麻醉耐受性良好。實驗組向導管球囊內(nèi)注入生理鹽水0.3 mL后孕兔右側股動脈搏動消失，血壓測不出；而對照組血壓無明顯波動(P>0.05)。持續(xù)阻斷子宮血供導致胎兔和新生兔死亡，存活新生兔神經(jīng)行為學異常,腦細胞發(fā)生凋亡。阻斷子宮血供20 min時，未發(fā)現(xiàn)死胎，新生兔行為學和腦組織病理學改變不明顯；阻斷子宮血供25 min和28 min時，死胎率分別為12.9%和40.6%，存活新生兔出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)行為異常，腦組織切片發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細胞腫脹，小膠質細胞活化，腦細胞凋亡；而阻斷子宮血供超過30 min時，死胎率高達80.0%。結論持續(xù)阻斷孕兔子宮血供導致胎兔死亡、新生兔神經(jīng)行為學異常及腦組織病理學改變，且不同阻斷時間引起不同程度的腦損傷；持續(xù)阻斷子宮血供25～28 min，可為缺氧缺血性腦損傷的相關研究提供合適的胎兒期全身性缺氧缺血性腦損傷胎兔模型。

缺氧缺血，腦; 模型，動物; 兔

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是圍生期窒息引起腦組織缺氧缺血性損害，是導致新生兒傷殘的重要原因之一[1-2]，嚴重威脅新生兒的生命健康[3]。深入研究HIBD的發(fā)病機制和尋找有效的防治策略是國內(nèi)外圍生醫(yī)學領域的重要課題[4]，因此模擬新生兒HIBD的臨床過程，建立胎兒期全身性HIBD動物模型具有十分重要的意義，胎兔宮內(nèi)HIBD模型正是這樣一種模型。本研究模擬急性胎盤功能不全的臨床過程，建立近足月(29 d胎齡)胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型，為深入研究新生兒缺氧缺血性腦損傷發(fā)病機制和防治措施提供合適動物模型。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物及分組 孕29 d健康新西蘭白兔24只，體重為3.3～3.8 kg，由上海實驗動物中心提供。24只孕兔隨機分為實驗組20只和對照組4只。實驗組按阻斷子宮血供時間隨機分為20 min組、25 min組、28 min組、30 min組和40 min組(各4只)，分別記為E20、E25、E28、E30和E40組。

1.2主要儀器設備和試劑 血氣/電解質分析儀(Instrumentation Laboratory)；BeneView T5生命體征監(jiān)測儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；WZS-50F微量輸液泵(浙江大學醫(yī)學器械廠)；YP-90新生兒培養(yǎng)箱(寧波戴維器械有限公司)；Fogarty動脈取栓導管(4F, Edwards Lifesciences)；Griffoniasimplicifoliaisolectin B4(IB4)(Vector Labs)；TUNEL試劑盒(InSituCell Death Detection Kit, POD; Roche)。

2方法

2.1HIBD模型的建立

2.1.1麻醉及補液 聯(lián)合全身麻醉和腰麻對孕兔進行麻醉。全身麻醉分為誘導麻醉和維持麻醉2個階段，左側耳緣靜脈內(nèi)持續(xù)泵入給藥。誘導麻醉給予芬太尼(0.075 mg·kg-1·h-1)和氟哌利多(3.75 mg·kg-1·h-1)，泵入5～10 min；維持麻醉給予芬太尼(0.025～0.05 mg·kg-1·h-1)和氟哌利多(1.25～2.5 mg·kg-1·h-1)，泵入至實驗結束。腰麻以L4～L5椎間隙為進針點，向蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)注入0.75%布比卡因0.3～0.5 mL。葡萄糖生理鹽水溶液按10～15 mL·kg-1·h-1耳緣靜脈內(nèi)持續(xù)泵入。

2.1.2阻斷孕兔子宮血供 沿左側腹股溝中點切開皮膚，游離左側股動脈并做一縱向切口，插入4F Fogarty動脈取栓導管，約10 cm，此時球囊位于腎動脈開口下端，子宮動脈開口上端[5]。實驗組向球囊內(nèi)注入生理鹽水0.3 mL擴張球囊，對照組不注入生理鹽水，分別保留20、25、28、30、40 min后拔出導管，縫合血管、皮膚。

2.1.3術中監(jiān)測 孕兔左側耳中動脈置入靜脈留置針(20G)，連接有創(chuàng)血壓監(jiān)測儀，監(jiān)測外周動脈血壓；右側耳緣連接經(jīng)皮氧飽和度監(jiān)測儀；人工計數(shù)呼吸頻率，根據(jù)監(jiān)測結果及時調(diào)整麻醉藥物給藥劑量。在全身麻醉前、誘導麻醉完成后10 min、股動脈插管前10 min、拔管后10 min、拔管后4～5 h從孕兔左側耳中動脈采血，30 min內(nèi)送檢血氣分析，記錄呼吸頻率、心率、血氧飽和度(SpO2)和血氣分析結果。同時監(jiān)測孕兔右側股動脈搏動及血壓。

2.2新生兔的評估

2.2.1阻斷孕兔子宮血供24 h后行剖宮產(chǎn)，新生兔置入預熱的新生兒培養(yǎng)箱中保暖(箱溫為35 ℃)，記錄單窩產(chǎn)崽數(shù)、死胎率、出生體重等。

2.2.2活產(chǎn)新生兔立即進行神經(jīng)行為學評分：主要評估項目包括姿勢、翻正反射、肌張力、運動能力、吮吸和吞咽協(xié)調(diào)能力、對刺激的反應[6-7]。但如果活產(chǎn)新生兔在神經(jīng)行為學評估前或評估過程中發(fā)生死亡，其評分結果視為無效評分，不被納入統(tǒng)計范疇。

2.3病理學觀察

2.3.1HE染色 待行為學評估完成后，立即腹腔內(nèi)注射5%水合氯醛(250 mg/kg)，4%多聚甲醛心臟灌注，斷頭取腦組織，制作石蠟標本，切片，行HE染色。

2.3.2標記小膠質細胞 石蠟切片常規(guī)脫蠟、逐級水化，用3%H2O250 μL孵育20 min，加入50 μL生物素標記的IB4(2.5 mg/L)孵育30 min，滴加HRP標記的鏈霉卵蛋白50 μL孵育30 min。

2.3.3標記凋亡的腦細胞 按TUNEL試劑盒設計的程序進行：加蛋白酶K(20 mg/L)50 μL孵育5 min，滴加TUNEL反應液(Enzyme solution 5 μL，Label solution 45 μL)50 μL孵育1 h；加POD轉化液50 μL孵育30 min。

2.3.4以上各步均用0.01 mol/LPBS 充分沖洗。DAB顯色；蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察，對存活新生兔腦組織海馬CA1區(qū)、紋狀體、大腦矢狀旁區(qū)皮質每高倍視野內(nèi)陽性細胞進行計數(shù)。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1孕兔一般情況

對照組和各實驗組孕兔體重、單窩產(chǎn)崽數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。任意監(jiān)測時點，各組孕兔呼吸頻率、心率、PaO2、PaCO2、SpO2和外周動脈血壓比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。心率、SpO2和外周動脈血壓在整個實驗過程中無明顯波動，但誘導麻醉導致孕兔呼吸頻率和PaO2明顯降低，PaCO2增高(P<0.05)，進入維持麻醉階段后孕兔呼吸頻率、血PO2和PCO2逐漸趨向穩(wěn)定。實驗組向導管球囊注入生理鹽水0.3 mL，孕兔右側股動脈搏動消失，血壓測不出，但置管前和拔管后血壓比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；拔管后實驗組孕兔動脈血乳酸水平高于對照組，分別為(2.13±0.82)mmol/L和(1.34±0.39) mmol/L(P<0.05)。在整個實驗過程中，對照組右側股動脈均可觸及明顯波動，血壓波動不明顯。孕兔一般情況見表1，這些數(shù)據(jù)對在國內(nèi)建立胎兔宮內(nèi)HIBD模型有重要意義。

2胎兔及新生兔存活情況

對照組產(chǎn)崽共31只；實驗組E20、E25、E28、E30和E40分別產(chǎn)崽32只、31只、32只、25只和31只。對照組所有胎兔存活，實驗組阻斷子宮血供造成部分胎兔死亡，且阻斷時間越長，活產(chǎn)新生兔的數(shù)量越少，死胎率越高(P<0.05)，見表2。E20組和對照組活產(chǎn)新生兔活力較好，無新生兔死亡；而E25組、E28組和E30組部分活產(chǎn)新生兔活力較差，生后不久即發(fā)生死亡，其中E30組所有活產(chǎn)新生兔生后不久均死亡，其原因可能是發(fā)生嚴重缺氧缺血性腦損傷的新生兔沒有ICU監(jiān)護較難存活[6]。

表1 孕兔一般情況

PaO2:arterial oxygen partial pressure;SpO2:pulse oxygen saturation;PaCO2:arterial carbon dioxide partial pressure.*P<0.05vsbefore anesthesia.

表2 胎兔及新生兔存活情況

3新生兔行為學評估

本研究各組有效的神經(jīng)行為學評分例數(shù)分別為：對照組31例、E20組32例、E25組25例、E28組14例，而E30組活產(chǎn)新生兔生后不久均發(fā)生死亡，沒有有效的神經(jīng)行為學評分結果。比較神經(jīng)行為學評分結果發(fā)現(xiàn)，實驗組新生兔的姿勢、翻正次數(shù)、翻正得分、運動能力、吮吸和吞咽協(xié)調(diào)能力及嗅覺刺激等項目評分均低于對照組，且宮內(nèi)缺氧缺血時間越長，神經(jīng)行為學評分越低(P<0.05)，見表3；E20組新生兔神經(jīng)行為學評分較對照組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。另外，所有存活新生兔均未出現(xiàn)肌張力增高，同樣證實肌張力增高僅見于早產(chǎn)胎兔缺氧缺血性腦損傷模型[6]，這可能與不成熟腦白質對缺氧缺血敏感有關[8-9]，原因可能是不成熟腦白質中的前體少突膠質細胞對缺氧缺血產(chǎn)生的氧自由基極度敏感[10-11]。

4大體標本及免疫組織化學

實驗組新生兔顱縫較對照組增寬，E30組增寬最為明顯，順產(chǎn)極可能增加死胎率[6]。存活新生兔腦組織標本經(jīng)HE染色，見圖1，對照組大腦矢狀旁區(qū)腦細胞排列整齊，細胞形態(tài)規(guī)整，細胞間隙清晰；實驗組腦細胞腫脹，排列紊亂，胞質、胞核染色不均，細胞間隙不清。腦組織切片經(jīng)IB4染色后，對照組和實驗組均可見呈棕色的陽性細胞，但對照組陽性細胞形態(tài)學上呈樹枝狀，為靜息態(tài)小膠質細胞；實驗組陽性細胞呈橢圓形或阿米巴樣，為活化的小膠質細胞[7]，見圖2。

表3 存活新生兔神經(jīng)行為學評分

★P<0.05vscontrol;◆P<0.05vsE20;●P<0.05vsE25.

Figure 1. The morphological changes of brain cells in sagittal brain areas of newborn rabbits (HE staining,×200). A: control group, most brain cells with regular shape and uniform staining; B, C, D: E20, E25 and E28 groups, respectively, with swelling brain cells and unclear cell gaps.

圖1HE染色顯示大腦矢狀旁區(qū)腦細胞形態(tài)學改變

Figure 2. The morphological changes of microglia in hippocampus CA1 of newborn rabbits(IB4 staining,×400). A: control group, the microglial cells were highly ramified (arrows). B, C, D: E20, E25 and E28 groups, respectively, the microglial cells showed amoeboid morphology (arrows).

圖2IB4染色后海馬CA1區(qū)小膠質細胞的形態(tài)學變化

實驗組存活新生兔腦組織切片中可見較多TUNEL陽性細胞(呈棕色)，對照組未發(fā)現(xiàn)或僅有極少量TUNEL陽性細胞，見圖3；其中海馬、紋狀體、大腦矢狀旁區(qū)皮質等部位凋亡現(xiàn)象較為突出，每高倍視野內(nèi)陽性細胞數(shù)較對照組明顯增多(數(shù)據(jù)未給出)，且隨阻斷子宮血供時間的延長逐漸增加(P<0.05)。

Figure 3. The apoptosis of brain cells in striaturn in newborn rabbits (TUNEL,×400). A: control group, no apoptotic brain cells; B, C, D: E20, E25 and E28 groups, respectively,the positive cells were apoptotic brain cells (arrows).

圖3TUNEL染色后紋狀體內(nèi)腦細胞凋亡情況

討 論

建立缺氧缺血性腦損傷(HIBD)動物模型的方法較多，最為經(jīng)典的是Rice法[12]，但由于是通過結扎新生鼠一側頸動脈建立的局部單側缺氧缺血性腦損傷模型，不能模擬宮內(nèi)窒息所致的胎兒全身性缺氧缺血的臨床過程。Matthew等[7]利用孕兔，模擬胎盤功能不全的臨床過程，通過暫時性阻斷孕兔子宮血供造成胎兔宮內(nèi)缺氧缺血，建立起胎兒期全身性胎兔HIBD模型。而兔腦發(fā)育與人類極為相似，被認為是人腦發(fā)育的縮略圖[6]，且胎兔模型具有較典型的神經(jīng)行為學損害[6-7]，胎兔宮內(nèi)HIBD模型被認為是深入研究新生兒HIBD發(fā)病機制和防治措施的合適的模型[13]。Sidhartha等[6]已成功建立了早產(chǎn)胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型和近足月胎兔間歇宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型，而對近足月胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型阻斷孕兔子宮血供的時間沒有明確定義；持續(xù)阻斷孕29 d孕兔子宮血供50 min，可造成胎兔腦細胞損傷和壞死[14]，但由于可造成100%的死胎率，無法進行缺氧缺血后神經(jīng)行為學及干預療效相關研究，故持續(xù)阻斷孕29 d孕兔子宮血供50 min，不能建立理想的近足月胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型。本研究擬建立近足月(29 d胎齡，約92.1%孕齡)胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型。

建立胎兔宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型的技術關鍵主要有兩個，其一是避免孕兔發(fā)生低氧血癥和死亡。文獻報道對孕兔進行麻醉時，需要使用呼吸機或者復蘇囊-面罩加壓通氣維持通氣[6-7,14]，這不利于胎兔宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型的推廣。本研究誘導麻醉采用耳緣靜脈泵入，誘導劑量完成后加用大劑量維持，5 min后改用小劑量維持到實驗結束。我們實時監(jiān)測孕兔的呼吸、心率、經(jīng)皮SPO2、外周動脈血壓、動脈血氣分析等，及時評估孕兔的麻醉深度，并根據(jù)監(jiān)測結果及時調(diào)整麻醉給藥劑量。在無任何輔助通氣的情況下，本研究所有孕兔均未出現(xiàn)嚴重呼吸抑制，無低氧血癥、高碳酸血癥發(fā)生，有效避免因麻醉過度發(fā)生死亡。

實現(xiàn)子宮血供中斷造成適度的宮內(nèi)缺氧缺血，是建立胎兔HIBD模型的另一個技術關鍵。文獻報道向球囊內(nèi)注入0.4 mL或0.3 mL生理鹽水[13,15]，均可實現(xiàn)子宮血供的中斷。我們的前期研究表明，向球囊內(nèi)注入0.4 mL生理鹽水，部分孕兔出現(xiàn)腹主動脈破裂，迅速死亡；而注入0.3 mL生理鹽水未出現(xiàn)此現(xiàn)象。本研究向球囊內(nèi)注入0.3 mL生理鹽水，導管充盈后，孕兔右側股動脈脈搏消失、血壓測不出，與Sidhartha等[6]報道一致；拔除導管后，孕兔循環(huán)中的乳酸水平明顯增高，這與球囊以下血供(包括子宮)被阻斷發(fā)生無氧代謝有關，提示實現(xiàn)孕兔子宮血供中斷。但由于乳酸等酸性物質有可能加重胎兔腦損傷[16-17]，本研究給予適當補液，維持穩(wěn)定的外周動脈灌注壓，增加孕兔腎血流量，促進酸性物質排出[18]，減少非實驗因素對實驗結果的影響。拔除導管4～5 h后，孕兔動脈血乳酸水平恢復至術前水平。

由于陰道產(chǎn)可增加死胎率，且存在食崽現(xiàn)象[6]，本研究采用剖宮產(chǎn)希望得出更為準確的死胎率。與文獻報道[9]不同，本研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)阻斷子宮血供40 min，死胎率為100%；降低阻斷時間至30 min時，死胎率仍高達80.0%；當降至28 min時，死胎率為40.6%，過高的死胎率不利于科學研究，故本研究認為阻斷子宮血供的時間不宜超過28 min。當阻斷子宮血供時間為25～28 min時，死胎率分別為12.9%和40.6%，存活新生兔出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)行為學異常，病理切片可見明顯腫脹的腦細胞、活化的小膠質細胞及發(fā)生凋亡的腦細胞，腦損傷較為典型[7]，提示阻斷子宮血供25～28 min是建立29d胎齡胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型的合理時間。繼續(xù)降低阻斷時間至20 min，存活新生兔的神經(jīng)行為學評估結果與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，腦組織病理切片僅可見活化的小膠質細胞，凋亡現(xiàn)象不明顯，提示阻斷子宮血供20 min可引起小膠質細胞大量活化[19]，未造成或僅造成輕微的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，因此持續(xù)阻斷子宮血供20 min或小于20 min不是建模的合理時間。

綜上所述，本研究有效避免呼吸機的應用及孕兔死亡，進一步減少非實驗因素對研究結果的影響。持續(xù)阻斷孕兔子宮血供導致胎兔死亡、新生兔神經(jīng)行為學異常及腦組織病理學改變，且不同阻斷時間引起不同程度的腦損傷；持續(xù)阻斷子宮血供25～28 min，可為缺氧缺血性腦損傷的相關研究提供合適的胎兒期全身性缺氧缺血性腦損傷胎兔模型。

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Establishmentofintrauterinehypoxic-ischemicbraindamagemodelinneartermfetalrabbits

WANG Neng-li, NAN Yan, LIU Yan-li, LIN Su, YE Wei, TANG Zhen-hai, LIN Jin, LIN Zhen-lang

(DepartmentofNeonatology,TheYuyingChildren’sHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325027,China.E-mail:linzhenlang@hotmail.com)

AIM: To establish intrauterine hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) model in near term fetal rabbits at 29 d gestation age for the investigation of the pathogenesis and treatment of newborn HIBD.METHODSTwenty-four pregnant New Zealand white rabbits at 29th gestational day were chosen for this project. Under combined general anesthesia and spinal anesthesia, a 4F Fogarty arterial embolectomy catheter was introduced into the left femoral artery. The blood supply of uterus in experiment group was blocked by inflating the catheter balloon with 0.3 mL saline for 20 min, 25 min, 28 min, 30 min and 40 min (n=4 for each experimental time group). The catheter balloon was not inflated in control group (n=4). All pregnant rabbits were subject to cesarean section 24 h after the experimental procedure to induce hypoxia-ischemia to the fetus. The general conditions of the newborn rabbits were recorded, and the neurobehavioral damage and histology of the brain tissue were assessed.RESULTSDuring the entire procedure, the pregnant rabbits had stable vital signs, no hypoxia happened,and had a good tolerance to the anesthesia program. When the balloon was inflated, the pulses of right femoral artery disappeared and the right leg blood pressure became non-detectable in experimental groups. In contrast, no fluctuation of the right leg blood pressure in control group (P>0.05) was observed. Intrauterine hypoxia-ischemia caused neonatal and fetal rabbit death, neurobehavioral damage and brain cell death. When the balloon was inflated for 20 min, all fetal rabbits were alive and had no obvious neurologic damage. For 25～28 min, the stillbirth rates were 12.9% and 40.6%, respectively, while the live neonatal rabbits manifested neurobehavioral damage, edema neural cells, activated microglia cells and apoptotic brain cells. When blocking time beyond 30 min, above 80% fetal rabbits died.CONCLUSIONContinuous blockage of uterine blood supply in pregnant rabbits causes neonatal rabbit death, neurobehavioral damage and brain cell death. Different blocking time arouses different levels of brain damage. Continuous blockage of uterine blood supply for 25-28 min can establish fetal generalize hypoxic-ischemic brain damage rabbit model, which is a good animal model for the investigation of newborn HIBD.

Hypoxia-ischemia, brain; Models,animal; Rabbits

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.034