冼 盈， 朱 翔， 張永標， 溫景蕓， 王艷紅，焦培榮， 張桂紅， 廖 明， 辛朝安， 張扣興△

(中山大學附屬第三醫(yī)院 1感染科ICU，2急診科，3腫瘤科，廣東 廣州 510630;4華南農(nóng)業(yè)大學禽病教研室，廣東 廣州 510642)

1000-4718(2012)04-0708-06

2011-08-16

2012-01-09

廣東省自然科學基金資助項目(No.06034508);廣東省科技計劃資助項目(No.2008B030301302)

△通訊作者 Tel:020-85179179;E-mail:kxz6210@tom.com

不同H5N1亞型高致病性禽流感病毒誘導IFN-α/β和MxA mRNA表達*

冼 盈1， 朱 翔1， 張永標2， 溫景蕓3， 王艷紅1，焦培榮4， 張桂紅4， 廖 明4， 辛朝安4， 張扣興1△

(中山大學附屬第三醫(yī)院1感染科ICU，2急診科，3腫瘤科，廣東 廣州 510630;4華南農(nóng)業(yè)大學禽病教研室，廣東 廣州 510642)

目的用兩株鵝源H5N1禽流感病毒(AIV)接種A549細胞，比較兩毒株在細胞中的增殖情況，以及病毒誘導細胞干擾素(INF)-α/β和黏病毒抗性蛋白A(MxA) mRNA表達的情況。方法將兩組病毒懸液接種A549細胞，按Reed-Muench法計算兩毒株的組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)，PCR擴增檢測細胞中病毒的HA和M1片段。Real-time PCR方法檢測細胞中IFN-α/β和MxA mRNA表達。結(jié)果兩株病毒均能感染A549細胞， AIV128誘導細胞的IFN-α/β和MxA mRNA表達均較AIV75高。結(jié)論H5N1亞型AIV75和AIV128毒株能在人肺泡癌上皮細胞A549中復制，細胞IFN-α/β和MxA mRNA的表達誘導依賴于病毒的復制。

禽流感病毒; A549細胞; 干擾素; 黏病毒抗性蛋白類

禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)是禽類中分離出來的A型流行性感冒病毒各種亞型的總稱。目前，在世界各地分離的16個H亞型和9個N亞型禽流感病毒中，高致病性禽流感均由高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)H5或H7亞型病毒引起。1997年香港H5N1禽流感傳人事件的發(fā)生，改變了人們傳統(tǒng)上認為禽流感不能直接傳人的概念。截止2010年8月31日，全世界已先后有505例人感染H5N1，導致300人死亡。AIV的致病性取決于病毒與宿主之間的相互作用，Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)在宿主抗病毒感染中發(fā)揮著極其重要的作用，它先于機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，是機體第一道病毒防御體系，也是影響流感病毒感染細胞的關(guān)鍵因素[1]。黏病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A,MxA)基因?qū)儆诟蓴_素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs),在防御流感病毒機制中起到重要作用[2]。同時，流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白1(non-structural protein 1,NS1)能拮抗干擾素的產(chǎn)生,逃避干擾素的抗病毒作用[3]。目前，AIV致病機制還不清楚，可能是多基因共同作用的結(jié)果，研究機體對病毒的免疫反應(yīng)及AIV的NS1蛋白，有望進一步揭示NS1蛋白的功能及其調(diào)節(jié)AIV致病性的機制。因此，我們設(shè)計本課題旨在建立人呼吸道上皮細胞模型，更好地觀察禽流感病毒H5N1不同毒株對細胞的致病性，并在細胞水平研究對禽流感病毒誘導產(chǎn)生的機體固有免疫反應(yīng)情況，從NS1基因方面尋找影響禽流感病毒致病力差異的原因，從而為研究NS1蛋白參與AIV致病的機制奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1病毒 A/Duck/Guangdong/75/2004(H5N1)(記為AIV75)， A/Duck/Guangdong/128/2004(H5N1)(記為AIV128)，由華南農(nóng)業(yè)大學禽病研究室分離、鑒定和保存。

1.2細胞 DF-1細胞(雞胚成纖維細胞)由華南農(nóng)業(yè)大學禽病研究室惠贈、保存。人肺泡癌上皮A549細胞(CCL185,ATCC)為肺腺癌患者肺組織分離建立的、有肺泡上皮特征的細胞，為中山大學北校區(qū)實驗動物中心細胞庫保存。

1.3Real-time PCR試劑盒及引物設(shè)計 SYBR Premix Ex Taq為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，根據(jù)GenBank中的已知人β-actin、IFN-α/β和MxA全基因序列，及針對已知的AIV75、128兩毒株血凝素(hemagglutinin,HA)和M1序列，用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，見表1。

2方法

2.1AIV75和AIV128接種 A549細胞 將2組病毒懸液用細胞維持液稀釋,用感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=2的感染劑量，接種于A549細胞已長成單層的6孔板中，每個病毒每個時點接種3個復孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄病毒液，用PBS洗板2次，最后1次控干加入1 mL維持液，同時設(shè)正常細胞對照組，倒置顯微鏡下每8 h觀察細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)。分別在感染接種后8 h、16 h、24 h和48 h收集細胞及細胞上清液。

表1 實時定量PCR引物設(shè)計

2.2DF-1細胞內(nèi)檢測A549細胞中AIV的復制滴度 觀察實驗結(jié)果后，將上述各孔A549細胞反復凍融3次，使細胞裂解，病毒釋放，5 000 r/min離心15 min，收集上清液.將收集到的上清液用細胞維持液做10倍稀釋為10-1～10-11，共10個稀釋度，加入DF-1細胞已長成單層的96孔板中，每個稀釋度接種4孔，每孔100 μL,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h,再添加維持液100 μL,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐天觀察，記錄CPE情況，72 h取上清液測定病毒血凝效價，并按Reed-Muench法[4]計算TCID50。RT-PCR 方法檢測A549細胞中病毒片段。

2.3熒光定量PCR檢測感染AIV后A549細胞中IFN-α/β和MxA mRNA的表達 分別收集AIV75、128感染后0 h、8 h、16 h、24 h和48 h的A549細胞，及收集不同濃度IFN-α2a作用后的A549細胞，提取細胞總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用熒光定量PCR擴增IFN-α、IFN-β和MxA片段，計算表達量。RT-PCR反應(yīng)組分，在7500 Fast Real-time PCR儀(ABI)中執(zhí)行以下程序：預變性95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s, 60 ℃15 s, 延伸72 ℃ 34 s, 共40個循環(huán)，最后72 ℃ 34 s。擴增完后，進行熔解曲線分析，獲得熔解曲線。所用樣品檢測均設(shè)置陰性對照(無模板)以排除假陽性。每個樣本做3個復孔，獨立重復實驗3次，同時擴增人β-actin作為內(nèi)參照。反應(yīng)結(jié)束后，讀取各產(chǎn)物Ct值，并在溶解曲線上得到的特異性峰來判斷PCR擴增的單一性。PCR產(chǎn)物取2 μL在1.0%的瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L EB)進行電泳檢測以判斷擴增產(chǎn)物是否為目的片段。采用相對定量法分別分析各基因相對相對mRNA表達水平，其計算公式為：相對mRNA表達量=2-ΔΔCt×100%，其中ΔCt=Ct(IFN-α/IFN-β/MxA)-Ct(β-actin)，ΔΔCt=ΔCt-ΔCt(對照)，其中病毒感染0 h和無IFN-α2a作用的A549細胞為對照組。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1感染A549細胞后不同時點AIV75和AIV128的復制情況

正常A549細胞對照組細胞培養(yǎng)液清亮，細胞梭形，排列整齊致密，呈上皮形，胞漿清楚，見圖1A。A549細胞在接種兩株病毒72 h后均未出現(xiàn)CPE，見圖1B、C。加大病毒的感染劑量，仍無CPE。以上結(jié)果提示， AIV75、128兩毒株在A549細胞中不引起細胞病變。

AIV128感染A549細胞各時點的病毒上清液均引起DF-1細胞發(fā)生CPE,見圖2B;48 h時TCID50最高，與血凝效價基本一致，見表2。而 AIV75感染A549細胞各時點的病毒上清液均未能引起DF-1細胞發(fā)生CPE。

病毒RT-PCR檢測，在AIV75、128感染的A549細胞中，各時點均能檢出病毒HA和M1片段。AIV128株各時點PCR擴增的病毒HA和M1片段，電泳條帶亮度均較AIV75強，見圖3、4。

表2AIV128在A549細胞中不同時點的增殖結(jié)果

Table 2. The replication of AIV128 in A549 cells at different time points

Time(h)Virustiter(TCID50/mL)Hemagglutinationefficiency0008102.831∶1616103.771∶6424104.001∶6448104.671∶64

Figure 1. The growth of A549 cells infected by different AIV(×100).A：normal cultured A549 cells (adherent growth)；B：A549 cells infected by AIV75；C：A549 cells infected by AIV128.

圖1不同禽流感病毒感染后A549細胞的生長情況

Figure 2. The growth of DF-1 cells infected by different AIV(×100).A:normal DF-1 cells (adherent growth);B: the supernatant with AIV128 was inoculated with DF-1 cells (cells floating in the culture medium, swollen and round).

圖2不同禽流感病毒感染后DF-1細胞的生長情況

Figure 3. The detection of HA and M1 gene fragments in A549 cells by RT-PCR after infected by AIV128 at diffe-rent time points.M: 2 000 bp ladder (molecular weight marker); 1: HA gene expression of mock-infected control cells; 2～5: HA gene of AIV128 which infected A549 cells 8 h,16 h,24 h and 48 h after infection; 6: M1 gene expression of mock-infected control cells; 5～10: M1 gene of AIV128 which infected A549 cells 8 h,16 h,24 h and 48 h after infection.

圖3RT-PCR檢測A549細胞中不同時點AIV128的HA和M1基因片段

Figure 4. The detection of HA and M1 gene fragments in A549 cells by RT-PCR after infected by AIV75 at different time points.M: 2 000 bp ladder (molecular weight marker); 1: HA gene expression of mock-infected control cells; 2～5:HA gene of AIV75 which infected A549 cells 8 h,16 h,24 h and 48 h after infection; 6: M1 gene expression of mock-infected control cells; 5～10: M1 gene of AIV75 which infected A549 cells 8 h，16 h，24 h and 48 h after infection.

圖4RT-PCR檢測A549細胞中不同時點AIV75的HA和M1基因片段

2病毒感染A549細胞后IFN-α和IFN-βmRNA的表達

在AIV75和AIV128感染的A549細胞，感染后8 h能檢測到IFN-α/β mRNA，表達量隨感染時間延長而增加，在24 h達到高峰。在每個檢測時點，AIV128誘導細胞產(chǎn)生的IFN-β mRNA表達量均較AIV75高，見表3。

表3兩毒株各時點誘導A549細胞IFN-α、IFN-β和MxAmRNA的表達量

GroupIFN-βIFN-αMxAAIV75-8h2.67±0.350.37±0.0738.30±1.67AIV75-16h4.51±0.580.45±0.0339.75±1.85AIV75-24h31.12±2.354.50±0.2298.24±6.44AIV75-48h9.59±0.512.58±0.17114.07±6.67AIV128-8h5.97±0.31**0.56±0.05*103.65±12.94*AIV128-16h23.49±2.76☆☆2.24±0.14☆☆135.01±6.70☆☆AIV128-24h32.46±0.79##2.60±0.11##216.23±10.13##AIV128-48h29.79±0.84△△1.47±0.43△△401.36±42.91△△

*P<0.05,**P<0.01vsAIV75-8 h group；☆☆P<0.01vsAIV75-16 h group；##P<0.01vsAIV75-24 h group；△△P<0.01vsAIV75-48 h group.

3病毒感染A549細胞后MxAmRNA的表達

在AIV75和AIV128感染A549細胞后8 h能檢測到MxA mRNA表達，表達量隨感染時間延長而增加，每個時點的MxA mRNA表達量比IFN-α/β mRNA表達量高。在感染后24 h IFN-α/β mRNA表達達到高峰時，MxA mRNA表達量仍有增加，而在無病毒感染的細胞中沒有檢測到MxA mRNA表達。在每個檢測時點，AIV128誘導細胞產(chǎn)生的MxA mRNA表達量均較AIV75高，見表3。

4不同濃度IFN-α2a誘導下A549細胞MxAmRNA的相對表達量

在沒有IFN-α2a處理的情況下，細胞不表達MxA mRNA， MxA mRNA表達水平隨著IFN-α2a作用濃度的增加而增加，見表4。

表4IFN-α2a對A549細胞MxAmRNA表達的誘導作用

IFN-α2a(103U/L)MxAmRNAexpression00108.5334±0.3800**1009.7884±0.7900**50023.0929±0.7200**

**P<0.01vsIFN-α2a 0 U/L.

討 論

A549細胞有著Ⅱ型肺泡上皮細胞的特征性形態(tài)，有研究證實A549細胞可以作為研究Ⅱ型肺泡上皮細胞的標準細胞模型[5]。A549細胞源于人類肺泡上皮細胞，相對于其它傳代細胞，其分子結(jié)構(gòu)以及感染后細胞因子的分泌更接近活體感染試驗，因而檢測A549細胞感染H5N1亞型禽流感病毒，對于禽流感病毒跨種屬傳播的機制，以及感染人體后免疫系統(tǒng)的變化都將有很大的意義。本研究選取兩株H5N1亞型的禽流感病毒接種于A549細胞，運用一系列病毒血清學試驗方法及分子生物學方法，檢測病毒在細胞中的增殖能力。實驗結(jié)果顯示， AIV128能感染A549細胞，隨著感染時間的增加，病毒復制增加。AIV75能感染A549細胞，但復制效率低下，未能引起DF-1細胞病變。說明AIV128在A549細胞中的增殖能力要強于 AIV75。

病毒的致病性很大程度上就是取決于宿主與病毒之間的相互作用。固有免疫反應(yīng)是病毒進入宿主細胞遇到的第一道防線，被病毒感染的細胞可產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，Ⅰ型干擾素能誘導細胞進入一種抗病毒狀態(tài)。它與細胞表面的IFN-α/β受體結(jié)合后可激活JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導通路，激活一系列抗病毒蛋白基因的轉(zhuǎn)錄從而抑制病毒的復制和擴散[1, 6]。IFN通過信號通路誘導許多抗病毒蛋白的表達從而發(fā)揮其抗病毒作用，目前研究最多的主要有3個抗病毒通道：PKR(雙鏈RNA依賴蛋白激酶)、2’,5’-OAS(2’,5’-寡腺苷酸合成酶)、Mx蛋白通路。雖然PKR以及 2’,5’-OAS需要雙鏈RNA (double-strand RNA，dsRNA)才能發(fā)揮功能，但是它們處于干擾素介導的抗病毒反應(yīng)的下游，并不參與干擾素本身基因表達的調(diào)控過程。研究發(fā)現(xiàn)：Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR) 和 RIG-I/MDA5 細胞信號轉(zhuǎn)導通路在識別 dsRNA、誘導Ⅰ型干擾素大量表達的過程中發(fā)揮了舉足輕重的作用。TLR 是定位于細胞內(nèi)涵體膜上的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)，表達于免疫細胞，可識別進入細胞囊泡的病毒dsRNA，誘導Ⅰ型 IFN的大量表達，RIG-Ⅰ/MDA5是定位于細胞質(zhì)內(nèi)的 PRR，可識別細胞質(zhì)內(nèi)病毒復制產(chǎn)生的dsRNA，通過不依賴TLR 的方式誘導IFN合成。通常來說，疾病的嚴重程度和細胞因子水平強相關(guān)。1997年香港H5N1暴發(fā)的病人中發(fā)現(xiàn)高水平的血清IL-6、TNF-α、IFN-γ和sIL-2R[7]。在體外實驗中，也表明了與H3N2和H1N1病毒比較，H5N1感染能大量地誘導前炎癥細胞因子，特別是TNF-α和IFN-β[8]。TLR 信號通路和 RIG-Ⅰ信號通路的過度激活會導致Ⅰ型 IFN 的過量表達，大量Ⅰ型 IFN 對機體將造成嚴重的免疫損傷，因此，宿主細胞必然具有對 TLR 和 RIG-Ⅰ信號通路進行下調(diào)的分子系統(tǒng)，并且許多病毒都編碼特異的蛋白質(zhì)分子，抑制 TLR 和 RIG-Ⅰ介導的 IFN 的表達，逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除。病毒蛋白調(diào)控也是在多個水平進行的。研究發(fā)現(xiàn)，A型流感病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1 可與細胞內(nèi)的 PRR 競爭結(jié)合病毒產(chǎn)生的dsRNA，從而抑制人干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3) 的激活，缺失 NS1 表達的A型流感病毒可大量誘導 IFN 產(chǎn)生[9]。AIV75、 AIV128均能誘導A549細胞產(chǎn)生IFN-α/β mRNA，而正常對照組無IFN-α/β mRNA表達，提示誘導細胞IFN-α/β mRNA表達依賴于病毒復制。AIV128誘導IFN-α/β mRNA表達量較AIV75高，提示不同毒株誘導IFN的作用是不一樣的，具有病毒株特異性。在一定感染劑量下，AIV128毒株隨著感染細胞時間延長，病毒復制增加，在細胞中復制即能誘導IFN產(chǎn)生，又能逃脫IFN的抗病毒作用，在細胞中有效增殖。不同流感病毒誘導和抑制Ⅰ型干擾素的能力是不同的[10]。與AIV75比較，AIV128在A549細胞中的復制水平高且誘導產(chǎn)生的IFN mRNA水平也增高，可能原因是：(1) 不同毒株對IFN的敏感性不同。AIV128在誘導細胞產(chǎn)生較高水平Ⅰ型干擾素時，仍能在細胞內(nèi)有效增殖，與AIV75比較，干擾素對AIV128的抗病毒作用較弱。(2) 病毒NS1蛋白有表達缺陷，不能有效拮抗IFN的產(chǎn)生。(3) 除了NS1蛋白以外，病毒的其它基因也可能影響IFN的產(chǎn)生水平。有研究表明，含有A/Sydney/5/97HA和NA基因的流感重組病毒能在上皮細胞誘導TNF-α的生成[11]， 因此，這些病毒基因片段很可能通過同一方式影響IFN的產(chǎn)生。

在小鼠實驗中，已經(jīng)用基因重組的方法認識了Mx蛋白能保護病毒感染。實驗證明，MxA蛋白與RNP中的NP緊密結(jié)合后，MxA的構(gòu)型發(fā)生改變并被活化，活化的MxA發(fā)揮對病毒核衣殼的水解作用以阻止病毒對細胞的吸附與穿入，從而阻止病毒基因組在核內(nèi)的復制。與上述兩種抗病毒蛋白不同，MxA蛋白在沒有病毒感染的情況下是沒有持續(xù)、低水平表達的，低濃度的Ⅰ型干擾素即能誘導MxA基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生較高濃度的MxA蛋白。MxA蛋白在體外又具有廣譜抗病毒效應(yīng)，特別對RNA病毒作用顯著，而且比IFN抗病毒作用更為直接。但是關(guān)于Mx蛋白在其它動物和人體中作用的研究很少。H5N1禽流感病毒能夠誘導細胞產(chǎn)生大量IFN,并且逃脫IFN的抗病毒作用[12]，盡管病毒阻斷了多個IFN誘導通路，但是并不完全，仍有IFN的分泌。I型或III型IFN信號通路能誘導MxA蛋白表達。人MxA基因的調(diào)節(jié)是受Ⅰ型干擾素嚴格控制的。我們實驗結(jié)果顯示：感染后8 h能檢測到MxA mRNA表達，感染后48 h仍有持續(xù)升高，表達量隨感染時間延長而增加。MxA mRNA與IFN-α/β-mRNA表達水平相平行，而表達量更高，表達半衰期更長，預先用IFN-α2a處理，可劑量依賴性地誘導MxA mRNA表達，在缺乏IFN-α2a刺激的情況下，細胞不表達MxA mRNA(正常對照)，與文獻報道的實驗結(jié)果一致[13]，提示MxA mRNA表達是受干擾素調(diào)控的，有較長的半衰期，少量的IFN-α/β即可刺激產(chǎn)生大量的MxA mRNA表達，是評價Ⅰ型干擾素活性的可靠標志，因此MxA抗病毒蛋白具有開發(fā)利用的潛能。

H5N1亞型AIV75和AIV128毒株能在人肺泡癌上皮細胞A549中復制，不同的毒株隨著感染時間的延長，病毒復制效率有所不同。兩毒株誘導細胞IFN-α/β和MxA mRNA表達依賴于病毒的復制。

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ThemRNAexpressionofIFN-α/βandMxAinducedbydifferentstrainsofH5N1highlypathogenicavianinfluenzaviruses

XIAN Ying1, ZHU Xiang1, ZHANG Yong-biao2, WEN Jing-yun3, WANG Yan-hong1, JIAO Pei-rong4, ZHANG Gui-hong4, LIAO Ming4, XIN Chao-an4, ZHANG Kou-xing1

(1IntensiveCareUnit,DepartmentofInfectiousDisease,2DepartmentofEmergency,3DepartmentofOncology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;4DepartmentofPoultryDiseases,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China.E-mail:kxz6210@tom.com)

AIM: To compare the proliferative efficiency of two strains of H5N1 avian influenza viruses(AIV), AIV75 and AIV128, in A549 cells and the mRNA expression of interferon(IFN)-α/β and myxovirus resistance protein A (MxA) induced by the two strains of H5N1 AIV.METHODSA549 cells were infected with appropriate dilution of virus stock. The titers of avian influenza viruses were expressed as 50% tissue culture infectious dose (TCID50) by Reed-Muench method. Viral HA and M1 cDNA fragments were amplified by PCR. Real-time PCR were performed to detect the mRNA expression of IFN-α/β and MxA.RESULTSBoth AIV75 and AIV128 were able to infect A549 cells. The mRNA expression levels of IFN-α/β and MxA induced by AIV128 were dramatically higher than those induced by AIV75.CONCLUSIONA suitable epithelial cell line A549 can support the growth of AIV. The mRNA expression of IFN-α/β and MxA depends on the replication of the viruses.

Avian influenza virus; A549 cells; Interferon; Myxovirus resistance proteins

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.022