劉麗華， 戚本玲， 吳欽欽， 李圓圓

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院老年病科，湖北 武漢 430022)

1000-4718(2012)04-0700-08

2011-10-22

2012-01-17

湖北省自然科學基金資助項目 (No.2008CDB217)

△通訊作者 Tel:027-85351540；E-mail:qibenlingok@163.com

c-Jun對硫氧還蛋白還原酶1啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用*

劉麗華， 戚本玲△， 吳欽欽， 李圓圓

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院老年病科，湖北 武漢 430022)

目的探討轉(zhuǎn)錄因子激活劑蛋白-1(activator protein-1，AP-1)家族成員c-Jun對硫氧還蛋白還原酶1(thioredoxin reductase 1，TrxR1)啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。方法利用生物信息學技術分析調(diào)控TrxR1啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子，構建TrxR1啟動子區(qū)域一系列截短的螢光素酶報告基因載體，將含c-Jun的真核表達載體pcDNA3.1(+)-c-Jun和含有TrxR1啟動子的螢光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293細胞和鼠心肌H9c2細胞，檢測轉(zhuǎn)染細胞中螢光素酶活性。應用定點突變技術針對TrxR1啟動子區(qū)域AP-1的可能結合位點進行突變，與c-Jun的真核表達載體共轉(zhuǎn)染上述2種細胞，檢測各組螢光素酶活性。利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)，分析c-Jun與TrxR1啟動子區(qū)域的AP-1結合位點結合情況。結果酶切及測序結果表明，獲得的3個不同長度的TrxR1啟動子克隆與GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫對比分析序列一致，且插入方向正確；此3種質(zhì)粒都有明顯的啟動子活性，在人胚腎HEK293和鼠心肌H9c2細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA 3. 1(+)-c-Jun可以上調(diào)TrxR1啟動子活性。突變AP-1結合位點，導致TrxR1啟動子活性明顯降低；ChIP結果顯示c-Jun結合在TrxR1啟動子區(qū)域的AP-1結合位點上。結論轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族成員c-Jun可能通過與TrxR1基因啟動子區(qū)域AP-1結合位點相結合，上調(diào)TrxR1基因的轉(zhuǎn)錄。

硫氧還蛋白還原酶1; c-Jun; 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)，是一種含硒酶，它與硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx) 還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(還原型輔酶Ⅱ，reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和硫氧還蛋白過氧化物酶 (thioredoxin peroxidase，TPx)三者共同組成硫氧還蛋白系統(tǒng)(Trx系統(tǒng))。其廣泛存在于原核、真核生物中。Trx系統(tǒng)是一個控制細胞還原/氧化狀態(tài)和細胞增殖/生存的廣泛表達的氧化還原系統(tǒng)，它控制機體氧化還原狀態(tài)的功能獨立于谷胱甘肽(glutathione，GSH)之外，是抗氧化應激的重要防御機制[1]。在清除活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、抵抗培養(yǎng)細胞中的過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)等調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的過程中起到重要作用[2]。Trx在TrxR的作用下可以從氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型，還原型的Trx可以催化許多含有二硫鍵蛋白質(zhì)的還原反應。TPx可以在還原型Trx的參與下將H2O2還原為H2O。氧化型Trx(Trx-S2)以NADPH依賴的方式被TrxR還原。除了通過發(fā)揮強大的氧化還原功能調(diào)節(jié)凋亡信號轉(zhuǎn)導通路以外，Trx還有直接抗凋亡的作用。

激活劑蛋白-1(activator protein-1，AP-1)是一類立早基因編碼的核轉(zhuǎn)錄因子，它與人金屬硫蛋白基因的順式調(diào)控元件結合。其組成成員包括c-Fos家族的c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2與c-Jun家族的c-Jun、JunB、JunD。這種轉(zhuǎn)錄因子主要由Jun、Fos、ATF及JDP亞家族組成，亞家族單體以同源或異源二聚體的形式結合DNA靶序列，調(diào)節(jié)靶基因，在細胞的正常生長和癌性轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用，特別是在心肌和神經(jīng)元的凋亡過程中，c-Jun均發(fā)揮著重要作用[3]。我們通過對人TrxR1基因進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)TrxR1基因5′側翼序列存在有多種轉(zhuǎn)錄因子的結合位點，其中AP-1可以與TrxR1啟動子區(qū)域的-1 612～-1 600結合。本研究通過構建TrxR1啟動子區(qū)域的螢光素酶報告基因載體，通過螢光素酶報告基因以及染色質(zhì)免疫共沉淀分析，探索AP-1家族成員c-Jun是否可以與TrxR1啟動子上預測的位點相結合。

材 料 和 方 法

1主要試劑及儀器

pGL3系列螢光素酶報告基因表達載體、Dual Luciferase 檢測試劑盒均購自Promega。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen。人c-Jun cDNA(GenBank: BC006175)購自武漢三鷹生物技術有限公司。c-Jun抗體(ab31419)購自Abcam。染色質(zhì)免疫共沉淀EZ-ChIPTM試劑盒購自Millipore。定點突變QuikChange? Site-Directed Mutagenesis試劑盒購自Stratagene。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR片段回收及純化試劑盒和外周血DNA提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司。限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自Fermentas。LA Taq DNA聚合酶和GC Buffer均購自TaKaRa。電泳中所用DNA marker購自東盛生物公司。PCR儀、凝膠成像分析系統(tǒng)Gel Doc 2000 購自Bio-Rad。超聲破碎儀Sonifier 450購自Branson，螢光素酶檢測儀Lumat LB 9507 購自Berthold。

2方法

2.1截短的TrxR1基因啟動子螢光素酶報告基因載體的構建

2.1.1TrxR1基因啟動子區(qū)域的擴增 采用 Primer Premier 5.0 軟件設計 3 對分別攜帶KpnⅠ/XhoⅠ限制性酶切位點的引物(序列見表1)，引物由上海生工公司合成。以正常人外周血基因組 DNA為模板，根據(jù)GenBank報道的TrxR1基因的啟動子區(qū)(Gene ID: 7296)，通過使用相應的引物組合，PCR 擴增TrxR1基因起始密碼子5′端上游約2 500 bp 區(qū)域的 3個依次截短的 PCR 片段,見圖1。

The underlined sequences are cleavage sites forKpnI orXhoI.

PCR 擴增反應體系：25 μL 2×GC Buffer、5 μL 2 mmol/L dNTPs、10 μmol/L 上、下游引物各 1 μL、300 ng 外周血基因組DNA、1 μL LA Taq酶(2.5×106U/L)，雙蒸水補足至 50 μL。擴增程序：94 ℃ 變性 10 min，然后用逐步程序 95 ℃ 50 s、60 ℃ 50 s、72 ℃ 2～4 min,35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。

Figure 1. Diagram of the location of cloned fragments of different lengths inTrxR1 gene promoter region.TSS:transcriptional start site.

圖1TrxR1基因啟動子區(qū)域不同長度的片段克隆位置示意圖

2.1.2螢光素酶報告基因載體的構建 用KpnⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶分別雙酶切擴增后純化回收的PCR產(chǎn)物和pGL3-Basic載體，瓊脂糖凝膠電泳分離雙酶切產(chǎn)物后切下目的片段，使用天根凝膠回收試劑盒進行回收。回收目的片段和pGL3-Basic用T4 DNA連接酶于16 ℃下連接16 h，按照常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α中。

2.1.3TrxR1基因啟動子螢光素酶報告基因載體的鑒定 將轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含氨芐的LB 平板，37 ℃培養(yǎng)16 h，隨機挑取白色菌落，在LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，提取質(zhì)粒后，使用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定呈陽性的質(zhì)粒送公司進行DNA測序分析(上海英駿生物技術有限公司)。

2.1.4c-Jun真核表達載體的構建 以人c-Jun cDNA質(zhì)粒為模板(cDNA clone MGC:13254;IMAGE:4053956)，設計針對c-Jun編碼區(qū)設計攜帶BamH I和XhoI酶切位點的引物(下劃線為酶切位點序列),上游引物5′-GCCGGATCCATGACTGCAAAGATGGAAACGACC-3′,下游引物5′- CGCCTCGAG-TCAAAATGTTTGCAACTGCTGCGT-3′，經(jīng)PCR擴增c-Jun基因編碼區(qū)全長序列。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 50 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min將其克隆到pcDNA3.1(+)載體，方法同前(見2.1.2和2.1.3)，將重組質(zhì)粒行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，挑取陽性克隆送測序。

2.1.5AP-1結合位點的定點突變 通過MatInspector軟件預測AP-1在TrxR1基因啟動子上的結合位點位于-1 600～-1 612，結合位點序列為ATTTGAGTCACCT。按照QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit說明書結合StrataGene公司的在線突變引物設計軟件(http://www.Stratagene.com/qcprimerdesign)進行設計。突變的上游引物5′ -CCTTGAGACCAGGGAATTTGCGTAACCTTGTAACCCTAAAC-3′，下游引物 5′- GTTTAGGGTTACAAGGTTACGCAAATTCCCTGGTCTCAAGG-3′； 突變反應：以包含AP-1結合位點的pGL3-1584質(zhì)粒為模板，采用PfuDNA聚合酶進行PCR突變反應。采用25 μL反應體系：2×GC Buffer 12.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，引物(10 mmol/L)各1 μL，模板1 μL，PfuDNA聚合酶0.5 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，68 ℃ 16 min，18個循環(huán)。PCR反應結束后，直接加入DpnI酶 1 μL 37 ℃消化1.5 h，以去除模板質(zhì)粒DNA。直接將DpnI消化后的PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，隨機挑取氨芐西林抗性平板上生長的單克隆送測序鑒定是否突變成功。

2.1.6細胞培養(yǎng) 人胚腎細胞株HEK293和大鼠心肌細胞株H9c2 培養(yǎng)于含有10%新生牛血清、青霉素(1×105U/L)、鏈霉素(100 mg/L)的DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.1.7脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 將人胚腎細胞株HEK293和大鼠心肌細胞株H9c2接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)至融合60%～80%時，轉(zhuǎn)染內(nèi)參照海腎螢光素酶質(zhì)粒pRL-TK、螢光素酶報告基因載體[pGL3-Basic(陰性對照)、pGL3-2210、pGL3-1584、pGL3-1151和pGL3-mut-2210]和pcDNA3.1(+)-c-Jun，比例為 10∶100∶400 (ng/well)。在相同條件下重復3次實驗。

2.1.8螢光素酶活性的檢測 按照Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega)試劑盒說明書，于轉(zhuǎn)染24 h后檢測轉(zhuǎn)染細胞螢光素酶活性。用100 μL 1×PLB/well 裂解液裂解細胞后，加20 μL LARⅡ試劑于20 μL細胞裂解液中，混勻10 s后測報告基因(pGL3系列質(zhì)粒)的螢火蟲螢光素酶的活性水平。隨后加入20 μL Stop & Glo，混勻10 s后測內(nèi)參質(zhì)粒(pRL-TK)海腎螢光素酶的活性水平。螢火蟲螢光素酶的活性與海腎螢光素酶的活性的比值來反映這些重組質(zhì)粒在HEK293和H9c2細胞中的啟動活性。

2.1.9染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP) 在HEK293細胞中轉(zhuǎn)染c-Jun表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h后，1%甲醛固定細胞后，裂解細胞并超聲剪切DNA 至200～1 000 bp，用anti-c-Jun抗體沉淀DNA片段并純化DNA。具體操作按ChIP試劑盒(EZ-ChIPTMassay kit)說明書進行。以沉淀DNA為PCR模板進行PCR擴增。擴增包含AP-1結合位點的TrxR1啟動子-1 718～-1 474區(qū)域，上游引物 5′-CCACAAACCCAAATGAAA-3′,下游引物5′- CCACATTGCGGCACATCA- 3′。擴增TrxR1啟動子不含AP-1結合位點的- 1 115～- 881區(qū)域作為陰性對照， 其引物為: 上游引物5′-TACATGGGCAGGGTGTCG-3′,下游引物5′- CTGGGATTACAGGCGTCA- 3′。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1TrxR1基因啟動子區(qū)域的擴增

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示，在約2.2 kb、1.5 kb和1.1 kb處均有一明顯擴增條帶，與預期大小一致，見圖2 。

Figure 2. Different lengths of PCR products ofTrxR1 gene promoter amplified from human blood shown by agarose gel electrophoresis. A:PCR product ofTrxR1 gene promoter from-2 283～-74; B:PCR product ofTrxR1 gene promoter from-1 657～-74; C:PCR product ofTrxR1 gene promoter from-1 224～-74.M: 1 kb DNA marker.

圖2人血DNA擴增不同長度的TrxR1基因啟動子PCR產(chǎn)物

2TrxR1基因啟動子截短質(zhì)粒的酶切鑒定

隨機挑取的3個重組質(zhì)粒pGL3-2210(1、2、3)、pGL3-1584(1、2、3) 和pGL3-1151(1、2、3)，經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，pGL3-2210 重組質(zhì)粒中的1和2被切出大小約為2.2 kb和5 kb的條帶，為陽性質(zhì)粒，而3為假陽性，見圖3A。pGL3-1584 (1、2、3)質(zhì)粒僅2被切出大小約為1.5 kb和5 kb的條帶，為陽性質(zhì)粒，而1、3為假陽性，見圖3B。pGL3-1151 (1、2、3)質(zhì)粒均被切出大小約為1.1 kb和5 kb的條帶，均為陽性質(zhì)粒，見圖3C。

3重組pcDNA3.1(+)-c-Jun真核表達載體的酶切鑒定

重組質(zhì)粒用BamH I/XhoⅠ雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，結果可見分別在約5 kb和1 kb處有一條帶，說明目的片段已經(jīng)連接到克隆載體上，見圖4。

4突變質(zhì)粒測序鑒定結果

用通用引物對重組突變質(zhì)粒DNA進行測序，序列分析結果經(jīng)Vector NT軟件比對同源性，測序結果顯示TrxR1啟動子pGL3-1584質(zhì)粒上c-Jun的核心結合序列AGTC被成功突變?yōu)镃GTA,見圖5。

Figure 3. Randomly picked recombinant plasmids, including pGL3-2210(A), pGL3-1584(B) and pGL3-2210(C),were digested byKpnI andXhoⅠ, and shown by agarose gel electrophoresis.M:1 kb DNA marker..

圖3TrxR1基因啟動子截短質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠酶切鑒定圖

Figure 4. By double digestion and agarose gel electrophoresis, pcDNA3.1(+)-c-Jun was cut out, and two bands,5 kb and 1 kb, were observed, suggesting that the target gene fragment was connected to the cloning vector.

圖4重組pcDNA3.1(+)-c-Jun真核表達載體的瓊脂糖凝膠酶切鑒定圖

Figure 5. Core AP-1 binding sequence AGTC inTrxR1 promo-ter plasmid pGL3-1584 was successfully mutated to CGTA.

圖5pGL3-mut-1584突變質(zhì)粒測序鑒定結果

5截短TrxR1啟動子活性分析

針對TrxR1基因啟動子區(qū)域截短的質(zhì)粒pGL3-2210、pGL3-1584和pGL3-1151轉(zhuǎn)染HEK293細胞后(轉(zhuǎn)染pRL-TK作為內(nèi)參照)，產(chǎn)生的螢光素酶活性與陰性對照pGL3-Basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的螢光素酶活性相比較，結果顯示TrxR1啟動子質(zhì)粒有活性，差異顯著(P<0.05)；此外，3種截短的質(zhì)粒，啟動子活性依次升高；且距離轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)較近的質(zhì)粒pGL3-1151啟動子活性與距離TSS較遠的pGL3-2210質(zhì)粒相比，活性明顯增高，差異顯著(P<0.05)，見圖6。

圖6截短TrxR1啟動子螢光素酶活性分析

6c-Jun對TrxR1啟動子活性的調(diào)控

HEK293細胞和H9c2細胞中共轉(zhuǎn)染c-Jun表達質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-c-Jun能明顯增強pGL3-2210和pGL3-1584兩種質(zhì)粒的啟動子活性。而共轉(zhuǎn)染c-Jun表達質(zhì)粒與只轉(zhuǎn)染pGL3-1151質(zhì)粒相比，pGL3-1151質(zhì)粒的啟動子活性無明顯增強，差異顯著(P<0.05)，見圖7。我們推測c-Jun可以增強TrxR1基因啟動子區(qū)域-2 283～-1 224的螢光素酶活性。

AP-1 結合位點的定點突變結果顯示：突變AP-1結合位點的pGL3-mut-1584報告載體與未突變的pGL3- 1584相比，AP-1結合位點的突變消除了c-Jun對TrxR1啟動子的上調(diào)作用，差異顯著(P<0.05)。這提示c-Jun在對TrxR1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中可以通過與其結合位點結合，從而上調(diào)TrxR1的轉(zhuǎn)錄活性,見圖8。

圖7c-Jun對截短TrxR1啟動子調(diào)控的螢光素酶活性分析

圖8AP-1結合位點突變的TrxR1啟動子螢光素酶活性分析

7ChIP證實c-Jun在細胞內(nèi)與TrxR1啟動子結合

在HEK293細胞中轉(zhuǎn)染c-Jun表達質(zhì)粒48 h后，通過ChIP檢測在細胞內(nèi)c-Jun是否與TrxR1啟動子上的AP-1結合位點結合。圖9顯示，c-Jun與內(nèi)源性TrxR1的啟動子可以結合。作為陰性對照，TrxR1啟動子上游-1 115～-881之間無c-Jun結合位點，沒有PCR 條帶出現(xiàn)。

討 論

TrxR是一種包含F(xiàn)AD 結構域的NADPH依賴的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，分為TrxR1、TrxR2和TrxR3。TrxR1主要存在于細胞漿中，TrxR2主要存在于線粒體中，TrxR3主要存在于睪丸組織中。由它組成的Trx系統(tǒng)和谷胱甘肽系統(tǒng)有很多相似之處，但也有著不同的功能特性。哺乳動物TrxR活性位點Cyc殘基位于黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)結構域中，Cyc殘基自身結合NADPH，并且與FAD的異咯嗪環(huán)緊密相鄰，電子通過FAD的異咯嗪環(huán)從NADPH流動到Trx，從而還原TrxR保守的催化位點二硫鍵，同時C末端Cyc-Ser催化位點處于氧化狀態(tài)；巰基-二硫化物交換后，保守的催化位點被氧化，而C末端Cyc-Ser催化位點被還原，將電子轉(zhuǎn)移給底物，在這個過程中TrxR活性位點的二硫化物沒有發(fā)生構象變化[4]。由于TrxR具有C末端氧化還原活性位點，且該位點是TrxR催化活性所必需的，因此具有廣泛的底物特異性，它能還原除Trx外的非二硫化物底物，如硫辛酸、氫過氧化物、維生素C、亞硒酸鹽、二硫代硝基苯甲酸 (dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB)和四氧嘧啶。此外，它在機體氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御、細胞增殖和生存過程及信號轉(zhuǎn)導中也起到重要作用。

Figure 9. Binding of c-Jun withTrxR1 promoter in HEK293 cells detected by chromatin immunoprecipitation.

圖9ChIP顯示c-Jun在HEK293細胞內(nèi)可以與TrxR1啟動子結合

c-Jun作為AP-1轉(zhuǎn)錄因子的亞家族成員，可以被環(huán)境中的許多應激因素(如營養(yǎng)因素撤除、物理射線、DNA 損傷藥物、活性氧等)激活c-Jun[7]；并使c-Jun通過調(diào)控下游FasL、Bim、bcl-2、bcl-XL、p53等基因影響細胞的生長與凋亡。

有研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)決定于活性氧及其氧化產(chǎn)物與抗氧化物，尤其是巰基/二硫化物之間的平衡。在許多類型細胞中，對氧化還原敏感的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子都參與了細胞信號轉(zhuǎn)導，例如MAPK、p21、AP-1和NF-κB等[8]。這些蛋白分子上半胱氨酸側鏈的CH2-SH是感受胞液氧化還原狀態(tài)的關鍵結構，它與蛋白激酶之間的信息傳遞以及轉(zhuǎn)錄因子與DNA結合有密切關系。AP-1家族成員Fos和Jun蛋白DNA結合域內(nèi)賴氨酸-半胱氨酸-精氨酸結構中的半胱氨酸是高度保守的單一半胱氨酸。半胱氨酸保持在還原狀態(tài)是AP-1結合DNA所必需的條件。當細胞內(nèi)活性氧增多時，半胱氨酸被氧化成可逆的次黃酸和亞硫酸，能促進AP-1與DNA結合[9]。而半胱氨酸的巰基被烷化劑或巰基氧化劑二酰胺氧化為二硫鍵時，AP-1與DNA結合的活性明顯下降，提示保持半胱氨酸的還原狀態(tài)可以調(diào)控AP-1轉(zhuǎn)錄活性。胞液中的硫氧還原蛋白具有氧化還原作用，可以通過其分子表面巰基的還原作用使AP-1分子DNA結合域的半胱氨酸殘基保持還原狀態(tài)，從而增強AP-1的轉(zhuǎn)錄活性[9]。這提示TrxR1 的表達可能與AP-1有關。另外，已有研究表明在牛動脈內(nèi)皮細胞(bovine aortic endothelial cells，BAEC)中，鎘和TNF-α可以促進人TrxR1基因的5′端(-1 692～+ 49 bp) 啟動子活性，NF-E2-related factor-2(Nrf2) 亦能增加TrxR1啟動子的活性[10]。而在本研究中，我們首先將c-Jun的真核表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞，探討高表達c-Jun對TrxR1啟動子活性的影響。結果顯示，轉(zhuǎn)染c-Jun后TrxR1啟動子活性明顯升高。此外，根據(jù)AP-1在啟動子中的通用核心結合序列AGTC，將所預測的AP-1作用元件序列進行相應突變，采用定點突變的方法，將突變點直接引入構建好的pGL3-1584質(zhì)粒中，形成包含AP-1突變位點的pGL3-mut-1584螢光素酶報告質(zhì)粒。我們將c-Jun和突變體(或截短質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染HEK293和H9c2 細胞，測定啟動子活性發(fā)現(xiàn): 刪除了AP-1結合位點后，導致啟動子活性明顯降低，下降約1倍。然而，AP-1結合位點被突變后，TrxR1啟動子活性也下降。這進一步說明c-Jun可與該位點結合，上調(diào)TrxR1啟動子活性。盡管通過轉(zhuǎn)染分析及生物信息學預測強有力地證明了c-Jun與-1 612～-1 600區(qū)域的相互關系，但仍需進一步的證據(jù)。因此我們進行了ChIP實驗，結果表明HEK293細胞中的核蛋白可以與TrxR1啟動子區(qū)域相結合。我們的實驗證明，TrxR1也是c-Jun調(diào)控的靶基因，它有助于進一步認識TrxR1發(fā)揮作用的機制及與其它網(wǎng)絡調(diào)節(jié)因子的相互聯(lián)系，為下一步研究衰老過程中氧自由基激活c-Jun，從而調(diào)控TrxR1，達到抗氧化或者抗凋亡的作用奠定工作基礎。

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c-Junpositivelyregulatestranscriptionofthioredoxinreductase1genethroughdirectbindingtoitspromoter

LIU Li-hua, QI Ben-ling, WU Qin-qin, LI Yuan-yuan

(DepartmentofGeriatrics,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China.E-mail:qibenlingok@163.com)

AIM: To investigate whether the transcription factor activator protein-1 (AP-1) family member c-Jun regulates the transcription of thioredoxin reductase 1 (TrxR1).METHODSThe interaction of transcription factors with promoter region ofTrxR1 was analyzed by bioinformatics methods. A series of plasmids containing truncatedTrxR1 promoter regions with luciferase reporter gene were constructed. A c-Jun eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+)-c-Jun was also prepared. The plasmids containing truncatedTrxR1 promoter regions were transfected into human embryonic kidney HEK293 cells and rat myocardium H9c2 cells for determining the luciferase activity. A putative AP-1 binding site located atTrxR1 promoter region -1 612～-1 600 was mutated by the method of site-directed mutagenesis. A c-Jun expression vector was transiently transfected into the 2 cell lines, and luciferase activity in each group was detected. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was used to demonstrate the binding ability of c-Jun to the promoter ofTrxR1.RESULTSRestriction digestion analysis and sequencing results showed that 3 fragments ofTrxR1 promoter with different lengths were obtained and the clones were consistent with the sequence in GenBank DNA database. The truncatedTrxR1 promoter regions showed significant promoter activity. Transient transfection of c-Jun expression vector into HEK293 and H9c2 cells elevatedTrxR1 promoter activity. However, the promoter activity disappeared when the AP-1 binding site was mutated or deleted. Similarly, ChIP analysis confirmed that c-Jun bound toTrxR1 promoter region.CONCLUSIONThese results provide evidence that AP-1 family member c-Jun positively regulatesTrxR1 gene expression through direct binding to its promoter.

Thioredoxin reductase 1; c-Jun; Transcription regulation

R592

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.021