劉麗華， 戚本玲， 吳欽欽， 李圓圓

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院老年病科，湖北 武漢 430022)

1000-4718(2012)04-0700-08

2011-10-22

2012-01-17

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No.2008CDB217)

△通訊作者 Tel:027-85351540；E-mail:qibenlingok@163.com

c-Jun對硫氧還蛋白還原酶1啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用*

劉麗華， 戚本玲△， 吳欽欽， 李圓圓

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院老年病科，湖北 武漢 430022)

目的探討轉(zhuǎn)錄因子激活劑蛋白-1(activator protein-1，AP-1)家族成員c-Jun對硫氧還蛋白還原酶1(thioredoxin reductase 1，TrxR1)啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。方法利用生物信息學(xué)技術(shù)分析調(diào)控TrxR1啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建TrxR1啟動子區(qū)域一系列截短的螢光素酶報告基因載體，將含c-Jun的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-c-Jun和含有TrxR1啟動子的螢光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293細(xì)胞和鼠心肌H9c2細(xì)胞，檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中螢光素酶活性。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)針對TrxR1啟動子區(qū)域AP-1的可能結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，與c-Jun的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染上述2種細(xì)胞，檢測各組螢光素酶活性。利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)，分析c-Jun與TrxR1啟動子區(qū)域的AP-1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合情況。結(jié)果酶切及測序結(jié)果表明，獲得的3個不同長度的TrxR1啟動子克隆與GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫對比分析序列一致，且插入方向正確；此3種質(zhì)粒都有明顯的啟動子活性，在人胚腎HEK293和鼠心肌H9c2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA 3. 1(+)-c-Jun可以上調(diào)TrxR1啟動子活性。突變AP-1結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致TrxR1啟動子活性明顯降低；ChIP結(jié)果顯示c-Jun結(jié)合在TrxR1啟動子區(qū)域的AP-1結(jié)合位點(diǎn)上。結(jié)論轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族成員c-Jun可能通過與TrxR1基因啟動子區(qū)域AP-1結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，上調(diào)TrxR1基因的轉(zhuǎn)錄。

硫氧還蛋白還原酶1; c-Jun; 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)，是一種含硒酶，它與硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx) 還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(還原型輔酶Ⅱ，reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和硫氧還蛋白過氧化物酶 (thioredoxin peroxidase，TPx)三者共同組成硫氧還蛋白系統(tǒng)(Trx系統(tǒng))。其廣泛存在于原核、真核生物中。Trx系統(tǒng)是一個控制細(xì)胞還原/氧化狀態(tài)和細(xì)胞增殖/生存的廣泛表達(dá)的氧化還原系統(tǒng)，它控制機(jī)體氧化還原狀態(tài)的功能獨(dú)立于谷胱甘肽(glutathione，GSH)之外，是抗氧化應(yīng)激的重要防御機(jī)制[1]。在清除活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、抵抗培養(yǎng)細(xì)胞中的過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)等調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的過程中起到重要作用[2]。Trx在TrxR的作用下可以從氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型，還原型的Trx可以催化許多含有二硫鍵蛋白質(zhì)的還原反應(yīng)。TPx可以在還原型Trx的參與下將H2O2還原為H2O。氧化型Trx(Trx-S2)以NADPH依賴的方式被TrxR還原。除了通過發(fā)揮強(qiáng)大的氧化還原功能調(diào)節(jié)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以外，Trx還有直接抗凋亡的作用。

激活劑蛋白-1(activator protein-1，AP-1)是一類立早基因編碼的核轉(zhuǎn)錄因子，它與人金屬硫蛋白基因的順式調(diào)控元件結(jié)合。其組成成員包括c-Fos家族的c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2與c-Jun家族的c-Jun、JunB、JunD。這種轉(zhuǎn)錄因子主要由Jun、Fos、ATF及JDP亞家族組成，亞家族單體以同源或異源二聚體的形式結(jié)合DNA靶序列，調(diào)節(jié)靶基因，在細(xì)胞的正常生長和癌性轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用，特別是在心肌和神經(jīng)元的凋亡過程中，c-Jun均發(fā)揮著重要作用[3]。我們通過對人TrxR1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TrxR1基因5′側(cè)翼序列存在有多種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，其中AP-1可以與TrxR1啟動子區(qū)域的-1 612～-1 600結(jié)合。本研究通過構(gòu)建TrxR1啟動子區(qū)域的螢光素酶報告基因載體，通過螢光素酶報告基因以及染色質(zhì)免疫共沉淀分析，探索AP-1家族成員c-Jun是否可以與TrxR1啟動子上預(yù)測的位點(diǎn)相結(jié)合。

材 料 和 方 法

1主要試劑及儀器

pGL3系列螢光素酶報告基因表達(dá)載體、Dual Luciferase 檢測試劑盒均購自Promega。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen。人c-Jun cDNA(GenBank: BC006175)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。c-Jun抗體(ab31419)購自Abcam。染色質(zhì)免疫共沉淀EZ-ChIPTM試劑盒購自Millipore。定點(diǎn)突變QuikChange? Site-Directed Mutagenesis試劑盒購自Stratagene。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR片段回收及純化試劑盒和外周血DNA提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司。限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自Fermentas。LA Taq DNA聚合酶和GC Buffer均購自TaKaRa。電泳中所用DNA marker購自東盛生物公司。PCR儀、凝膠成像分析系統(tǒng)Gel Doc 2000 購自Bio-Rad。超聲破碎儀Sonifier 450購自Branson，螢光素酶檢測儀Lumat LB 9507 購自Berthold。

2方法

2.1截短的TrxR1基因啟動子螢光素酶報告基因載體的構(gòu)建

2.1.1TrxR1基因啟動子區(qū)域的擴(kuò)增 采用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計 3 對分別攜帶KpnⅠ/XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)的引物(序列見表1)，引物由上海生工公司合成。以正常人外周血基因組 DNA為模板，根據(jù)GenBank報道的TrxR1基因的啟動子區(qū)(Gene ID: 7296)，通過使用相應(yīng)的引物組合，PCR 擴(kuò)增TrxR1基因起始密碼子5′端上游約2 500 bp 區(qū)域的 3個依次截短的 PCR 片段,見圖1。

The underlined sequences are cleavage sites forKpnI orXhoI.

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：25 μL 2×GC Buffer、5 μL 2 mmol/L dNTPs、10 μmol/L 上、下游引物各 1 μL、300 ng 外周血基因組DNA、1 μL LA Taq酶(2.5×106U/L)，雙蒸水補(bǔ)足至 50 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 變性 10 min，然后用逐步程序 95 ℃ 50 s、60 ℃ 50 s、72 ℃ 2～4 min,35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。

Figure 1. Diagram of the location of cloned fragments of different lengths inTrxR1 gene promoter region.TSS:transcriptional start site.

圖1TrxR1基因啟動子區(qū)域不同長度的片段克隆位置示意圖

2.1.2螢光素酶報告基因載體的構(gòu)建 用KpnⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶分別雙酶切擴(kuò)增后純化回收的PCR產(chǎn)物和pGL3-Basic載體，瓊脂糖凝膠電泳分離雙酶切產(chǎn)物后切下目的片段，使用天根凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收?；厥漳康钠魏蚿GL3-Basic用T4 DNA連接酶于16 ℃下連接16 h，按照常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α中。

2.1.3TrxR1基因啟動子螢光素酶報告基因載體的鑒定 將轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含氨芐的LB 平板，37 ℃培養(yǎng)16 h，隨機(jī)挑取白色菌落，在LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，提取質(zhì)粒后，使用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定呈陽性的質(zhì)粒送公司進(jìn)行DNA測序分析(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。

2.1.4c-Jun真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以人c-Jun cDNA質(zhì)粒為模板(cDNA clone MGC:13254;IMAGE:4053956)，設(shè)計針對c-Jun編碼區(qū)設(shè)計攜帶BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)的引物(下劃線為酶切位點(diǎn)序列),上游引物5′-GCCGGATCCATGACTGCAAAGATGGAAACGACC-3′,下游引物5′- CGCCTCGAG-TCAAAATGTTTGCAACTGCTGCGT-3′，經(jīng)PCR擴(kuò)增c-Jun基因編碼區(qū)全長序列。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min將其克隆到pcDNA3.1(+)載體，方法同前(見2.1.2和2.1.3)，將重組質(zhì)粒行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，挑取陽性克隆送測序。

2.1.5AP-1結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)突變 通過MatInspector軟件預(yù)測AP-1在TrxR1基因啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)位于-1 600～-1 612，結(jié)合位點(diǎn)序列為ATTTGAGTCACCT。按照QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit說明書結(jié)合StrataGene公司的在線突變引物設(shè)計軟件(http://www.Stratagene.com/qcprimerdesign)進(jìn)行設(shè)計。突變的上游引物5′ -CCTTGAGACCAGGGAATTTGCGTAACCTTGTAACCCTAAAC-3′，下游引物 5′- GTTTAGGGTTACAAGGTTACGCAAATTCCCTGGTCTCAAGG-3′； 突變反應(yīng)：以包含AP-1結(jié)合位點(diǎn)的pGL3-1584質(zhì)粒為模板，采用PfuDNA聚合酶進(jìn)行PCR突變反應(yīng)。采用25 μL反應(yīng)體系：2×GC Buffer 12.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，引物(10 mmol/L)各1 μL，模板1 μL，PfuDNA聚合酶0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，68 ℃ 16 min，18個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，直接加入DpnI酶 1 μL 37 ℃消化1.5 h，以去除模板質(zhì)粒DNA。直接將DpnI消化后的PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取氨芐西林抗性平板上生長的單克隆送測序鑒定是否突變成功。

2.1.6細(xì)胞培養(yǎng) 人胚腎細(xì)胞株HEK293和大鼠心肌細(xì)胞株H9c2 培養(yǎng)于含有10%新生牛血清、青霉素(1×105U/L)、鏈霉素(100 mg/L)的DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.1.7脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 將人胚腎細(xì)胞株HEK293和大鼠心肌細(xì)胞株H9c2接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)至融合60%～80%時，轉(zhuǎn)染內(nèi)參照海腎螢光素酶質(zhì)粒pRL-TK、螢光素酶報告基因載體[pGL3-Basic(陰性對照)、pGL3-2210、pGL3-1584、pGL3-1151和pGL3-mut-2210]和pcDNA3.1(+)-c-Jun，比例為 10∶100∶400 (ng/well)。在相同條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

2.1.8螢光素酶活性的檢測 按照Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega)試劑盒說明書，于轉(zhuǎn)染24 h后檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢光素酶活性。用100 μL 1×PLB/well 裂解液裂解細(xì)胞后，加20 μL LARⅡ試劑于20 μL細(xì)胞裂解液中，混勻10 s后測報告基因(pGL3系列質(zhì)粒)的螢火蟲螢光素酶的活性水平。隨后加入20 μL Stop & Glo，混勻10 s后測內(nèi)參質(zhì)粒(pRL-TK)海腎螢光素酶的活性水平。螢火蟲螢光素酶的活性與海腎螢光素酶的活性的比值來反映這些重組質(zhì)粒在HEK293和H9c2細(xì)胞中的啟動活性。

2.1.9染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP) 在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染c-Jun表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h后，1%甲醛固定細(xì)胞后，裂解細(xì)胞并超聲剪切DNA 至200～1 000 bp，用anti-c-Jun抗體沉淀DNA片段并純化DNA。具體操作按ChIP試劑盒(EZ-ChIPTMassay kit)說明書進(jìn)行。以沉淀DNA為PCR模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增包含AP-1結(jié)合位點(diǎn)的TrxR1啟動子-1 718～-1 474區(qū)域，上游引物 5′-CCACAAACCCAAATGAAA-3′,下游引物5′- CCACATTGCGGCACATCA- 3′。擴(kuò)增TrxR1啟動子不含AP-1結(jié)合位點(diǎn)的- 1 115～- 881區(qū)域作為陰性對照， 其引物為: 上游引物5′-TACATGGGCAGGGTGTCG-3′,下游引物5′- CTGGGATTACAGGCGTCA- 3′。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1TrxR1基因啟動子區(qū)域的擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示，在約2.2 kb、1.5 kb和1.1 kb處均有一明顯擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小一致，見圖2 。

Figure 2. Different lengths of PCR products ofTrxR1 gene promoter amplified from human blood shown by agarose gel electrophoresis. A:PCR product ofTrxR1 gene promoter from-2 283～-74; B:PCR product ofTrxR1 gene promoter from-1 657～-74; C:PCR product ofTrxR1 gene promoter from-1 224～-74.M: 1 kb DNA marker.

圖2人血DNA擴(kuò)增不同長度的TrxR1基因啟動子PCR產(chǎn)物

2TrxR1基因啟動子截短質(zhì)粒的酶切鑒定

隨機(jī)挑取的3個重組質(zhì)粒pGL3-2210(1、2、3)、pGL3-1584(1、2、3) 和pGL3-1151(1、2、3)，經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，pGL3-2210 重組質(zhì)粒中的1和2被切出大小約為2.2 kb和5 kb的條帶，為陽性質(zhì)粒，而3為假陽性，見圖3A。pGL3-1584 (1、2、3)質(zhì)粒僅2被切出大小約為1.5 kb和5 kb的條帶，為陽性質(zhì)粒，而1、3為假陽性，見圖3B。pGL3-1151 (1、2、3)質(zhì)粒均被切出大小約為1.1 kb和5 kb的條帶，均為陽性質(zhì)粒，見圖3C。

3重組pcDNA3.1(+)-c-Jun真核表達(dá)載體的酶切鑒定

重組質(zhì)粒用BamH I/XhoⅠ雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見分別在約5 kb和1 kb處有一條帶，說明目的片段已經(jīng)連接到克隆載體上，見圖4。

4突變質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果

用通用引物對重組突變質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序，序列分析結(jié)果經(jīng)Vector NT軟件比對同源性，測序結(jié)果顯示TrxR1啟動子pGL3-1584質(zhì)粒上c-Jun的核心結(jié)合序列AGTC被成功突變?yōu)镃GTA,見圖5。

Figure 3. Randomly picked recombinant plasmids, including pGL3-2210(A), pGL3-1584(B) and pGL3-2210(C),were digested byKpnI andXhoⅠ, and shown by agarose gel electrophoresis.M:1 kb DNA marker..

圖3TrxR1基因啟動子截短質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠酶切鑒定圖

Figure 4. By double digestion and agarose gel electrophoresis, pcDNA3.1(+)-c-Jun was cut out, and two bands,5 kb and 1 kb, were observed, suggesting that the target gene fragment was connected to the cloning vector.

圖4重組pcDNA3.1(+)-c-Jun真核表達(dá)載體的瓊脂糖凝膠酶切鑒定圖

Figure 5. Core AP-1 binding sequence AGTC inTrxR1 promo-ter plasmid pGL3-1584 was successfully mutated to CGTA.

圖5pGL3-mut-1584突變質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果

5截短TrxR1啟動子活性分析

針對TrxR1基因啟動子區(qū)域截短的質(zhì)粒pGL3-2210、pGL3-1584和pGL3-1151轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后(轉(zhuǎn)染pRL-TK作為內(nèi)參照)，產(chǎn)生的螢光素酶活性與陰性對照pGL3-Basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的螢光素酶活性相比較，結(jié)果顯示TrxR1啟動子質(zhì)粒有活性，差異顯著(P<0.05)；此外，3種截短的質(zhì)粒，啟動子活性依次升高；且距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)較近的質(zhì)粒pGL3-1151啟動子活性與距離TSS較遠(yuǎn)的pGL3-2210質(zhì)粒相比，活性明顯增高，差異顯著(P<0.05)，見圖6。

圖6截短TrxR1啟動子螢光素酶活性分析

6c-Jun對TrxR1啟動子活性的調(diào)控

HEK293細(xì)胞和H9c2細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染c-Jun表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-c-Jun能明顯增強(qiáng)pGL3-2210和pGL3-1584兩種質(zhì)粒的啟動子活性。而共轉(zhuǎn)染c-Jun表達(dá)質(zhì)粒與只轉(zhuǎn)染pGL3-1151質(zhì)粒相比，pGL3-1151質(zhì)粒的啟動子活性無明顯增強(qiáng)，差異顯著(P<0.05)，見圖7。我們推測c-Jun可以增強(qiáng)TrxR1基因啟動子區(qū)域-2 283～-1 224的螢光素酶活性。

AP-1 結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)突變結(jié)果顯示：突變AP-1結(jié)合位點(diǎn)的pGL3-mut-1584報告載體與未突變的pGL3- 1584相比，AP-1結(jié)合位點(diǎn)的突變消除了c-Jun對TrxR1啟動子的上調(diào)作用，差異顯著(P<0.05)。這提示c-Jun在對TrxR1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中可以通過與其結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而上調(diào)TrxR1的轉(zhuǎn)錄活性,見圖8。

圖7c-Jun對截短TrxR1啟動子調(diào)控的螢光素酶活性分析

圖8AP-1結(jié)合位點(diǎn)突變的TrxR1啟動子螢光素酶活性分析

7ChIP證實(shí)c-Jun在細(xì)胞內(nèi)與TrxR1啟動子結(jié)合

在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染c-Jun表達(dá)質(zhì)粒48 h后，通過ChIP檢測在細(xì)胞內(nèi)c-Jun是否與TrxR1啟動子上的AP-1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。圖9顯示，c-Jun與內(nèi)源性TrxR1的啟動子可以結(jié)合。作為陰性對照，TrxR1啟動子上游-1 115～-881之間無c-Jun結(jié)合位點(diǎn)，沒有PCR 條帶出現(xiàn)。

討 論

TrxR是一種包含F(xiàn)AD 結(jié)構(gòu)域的NADPH依賴的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，分為TrxR1、TrxR2和TrxR3。TrxR1主要存在于細(xì)胞漿中，TrxR2主要存在于線粒體中，TrxR3主要存在于睪丸組織中。由它組成的Trx系統(tǒng)和谷胱甘肽系統(tǒng)有很多相似之處，但也有著不同的功能特性。哺乳動物TrxR活性位點(diǎn)Cyc殘基位于黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)結(jié)構(gòu)域中，Cyc殘基自身結(jié)合NADPH，并且與FAD的異咯嗪環(huán)緊密相鄰，電子通過FAD的異咯嗪環(huán)從NADPH流動到Trx，從而還原TrxR保守的催化位點(diǎn)二硫鍵，同時C末端Cyc-Ser催化位點(diǎn)處于氧化狀態(tài)；巰基-二硫化物交換后，保守的催化位點(diǎn)被氧化，而C末端Cyc-Ser催化位點(diǎn)被還原，將電子轉(zhuǎn)移給底物，在這個過程中TrxR活性位點(diǎn)的二硫化物沒有發(fā)生構(gòu)象變化[4]。由于TrxR具有C末端氧化還原活性位點(diǎn)，且該位點(diǎn)是TrxR催化活性所必需的，因此具有廣泛的底物特異性，它能還原除Trx外的非二硫化物底物，如硫辛酸、氫過氧化物、維生素C、亞硒酸鹽、二硫代硝基苯甲酸 (dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB)和四氧嘧啶。此外，它在機(jī)體氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御、細(xì)胞增殖和生存過程及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中也起到重要作用。

Figure 9. Binding of c-Jun withTrxR1 promoter in HEK293 cells detected by chromatin immunoprecipitation.

圖9ChIP顯示c-Jun在HEK293細(xì)胞內(nèi)可以與TrxR1啟動子結(jié)合

c-Jun作為AP-1轉(zhuǎn)錄因子的亞家族成員，可以被環(huán)境中的許多應(yīng)激因素(如營養(yǎng)因素撤除、物理射線、DNA 損傷藥物、活性氧等)激活c-Jun[7]；并使c-Jun通過調(diào)控下游FasL、Bim、bcl-2、bcl-XL、p53等基因影響細(xì)胞的生長與凋亡。

有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)決定于活性氧及其氧化產(chǎn)物與抗氧化物，尤其是巰基/二硫化物之間的平衡。在許多類型細(xì)胞中，對氧化還原敏感的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子都參與了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如MAPK、p21、AP-1和NF-κB等[8]。這些蛋白分子上半胱氨酸側(cè)鏈的CH2-SH是感受胞液氧化還原狀態(tài)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，它與蛋白激酶之間的信息傳遞以及轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合有密切關(guān)系。AP-1家族成員Fos和Jun蛋白DNA結(jié)合域內(nèi)賴氨酸-半胱氨酸-精氨酸結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸是高度保守的單一半胱氨酸。半胱氨酸保持在還原狀態(tài)是AP-1結(jié)合DNA所必需的條件。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)活性氧增多時，半胱氨酸被氧化成可逆的次黃酸和亞硫酸，能促進(jìn)AP-1與DNA結(jié)合[9]。而半胱氨酸的巰基被烷化劑或巰基氧化劑二酰胺氧化為二硫鍵時，AP-1與DNA結(jié)合的活性明顯下降，提示保持半胱氨酸的還原狀態(tài)可以調(diào)控AP-1轉(zhuǎn)錄活性。胞液中的硫氧還原蛋白具有氧化還原作用，可以通過其分子表面巰基的還原作用使AP-1分子DNA結(jié)合域的半胱氨酸殘基保持還原狀態(tài)，從而增強(qiáng)AP-1的轉(zhuǎn)錄活性[9]。這提示TrxR1 的表達(dá)可能與AP-1有關(guān)。另外，已有研究表明在牛動脈內(nèi)皮細(xì)胞(bovine aortic endothelial cells，BAEC)中，鎘和TNF-α可以促進(jìn)人TrxR1基因的5′端(-1 692～+ 49 bp) 啟動子活性，NF-E2-related factor-2(Nrf2) 亦能增加TrxR1啟動子的活性[10]。而在本研究中，我們首先將c-Jun的真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，探討高表達(dá)c-Jun對TrxR1啟動子活性的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染c-Jun后TrxR1啟動子活性明顯升高。此外，根據(jù)AP-1在啟動子中的通用核心結(jié)合序列AGTC，將所預(yù)測的AP-1作用元件序列進(jìn)行相應(yīng)突變，采用定點(diǎn)突變的方法，將突變點(diǎn)直接引入構(gòu)建好的pGL3-1584質(zhì)粒中，形成包含AP-1突變位點(diǎn)的pGL3-mut-1584螢光素酶報告質(zhì)粒。我們將c-Jun和突變體(或截短質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染HEK293和H9c2 細(xì)胞，測定啟動子活性發(fā)現(xiàn): 刪除了AP-1結(jié)合位點(diǎn)后，導(dǎo)致啟動子活性明顯降低，下降約1倍。然而，AP-1結(jié)合位點(diǎn)被突變后，TrxR1啟動子活性也下降。這進(jìn)一步說明c-Jun可與該位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)TrxR1啟動子活性。盡管通過轉(zhuǎn)染分析及生物信息學(xué)預(yù)測強(qiáng)有力地證明了c-Jun與-1 612～-1 600區(qū)域的相互關(guān)系，但仍需進(jìn)一步的證據(jù)。因此我們進(jìn)行了ChIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明HEK293細(xì)胞中的核蛋白可以與TrxR1啟動子區(qū)域相結(jié)合。我們的實(shí)驗(yàn)證明，TrxR1也是c-Jun調(diào)控的靶基因，它有助于進(jìn)一步認(rèn)識TrxR1發(fā)揮作用的機(jī)制及與其它網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)因子的相互聯(lián)系，為下一步研究衰老過程中氧自由基激活c-Jun，從而調(diào)控TrxR1，達(dá)到抗氧化或者抗凋亡的作用奠定工作基礎(chǔ)。

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c-Junpositivelyregulatestranscriptionofthioredoxinreductase1genethroughdirectbindingtoitspromoter

LIU Li-hua, QI Ben-ling, WU Qin-qin, LI Yuan-yuan

(DepartmentofGeriatrics,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China.E-mail:qibenlingok@163.com)

AIM: To investigate whether the transcription factor activator protein-1 (AP-1) family member c-Jun regulates the transcription of thioredoxin reductase 1 (TrxR1).METHODSThe interaction of transcription factors with promoter region ofTrxR1 was analyzed by bioinformatics methods. A series of plasmids containing truncatedTrxR1 promoter regions with luciferase reporter gene were constructed. A c-Jun eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+)-c-Jun was also prepared. The plasmids containing truncatedTrxR1 promoter regions were transfected into human embryonic kidney HEK293 cells and rat myocardium H9c2 cells for determining the luciferase activity. A putative AP-1 binding site located atTrxR1 promoter region -1 612～-1 600 was mutated by the method of site-directed mutagenesis. A c-Jun expression vector was transiently transfected into the 2 cell lines, and luciferase activity in each group was detected. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was used to demonstrate the binding ability of c-Jun to the promoter ofTrxR1.RESULTSRestriction digestion analysis and sequencing results showed that 3 fragments ofTrxR1 promoter with different lengths were obtained and the clones were consistent with the sequence in GenBank DNA database. The truncatedTrxR1 promoter regions showed significant promoter activity. Transient transfection of c-Jun expression vector into HEK293 and H9c2 cells elevatedTrxR1 promoter activity. However, the promoter activity disappeared when the AP-1 binding site was mutated or deleted. Similarly, ChIP analysis confirmed that c-Jun bound toTrxR1 promoter region.CONCLUSIONThese results provide evidence that AP-1 family member c-Jun positively regulatesTrxR1 gene expression through direct binding to its promoter.

Thioredoxin reductase 1; c-Jun; Transcription regulation

R592

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.021