孟 晶， 張 旭， 陳青山， 張日佳， 丁小燕

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院眼科，2醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)教研室，廣東 廣州 510632；3中山大學(xué)中山眼科中心，廣東 廣州 510060)

1000-4718(2012)04-0694-06

2011-12-09

2012-03-02

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目 (No.B2009125)；建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研課題(No.2010363)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011B031700045)

△通訊作者 Tel：020-38688116；E-mail:zqz1999@tom.com

銀杏苦內(nèi)酯B對(duì)N-甲基-N-亞硝脲誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的抑制作用*

孟 晶1△， 張 旭1， 陳青山2， 張日佳1， 丁小燕3

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院眼科，2醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)教研室，廣東 廣州 510632；3中山大學(xué)中山眼科中心，廣東 廣州 510060)

目的探討銀杏苦內(nèi)酯B(GB)對(duì)N-甲基-N-亞硝脲(MNU)誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜變性的影響及其機(jī)制。方法建立大鼠視網(wǎng)膜變性模型，應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)光感受器細(xì)胞凋亡，RT-PCR法和免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)MNU作用后不同時(shí)間大鼠視網(wǎng)膜中bcl-2和bax mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果GB治療組外核層細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于模型組(P<0.01)。MNU作用后12 h、1 d、2 d、3 d和5 d，bcl-2/bax mRNA模型組為0.36、0.15、0.29、0.42和0.64，GB治療組為0.98、0.92、0.53、0.45和0.68，顯著高于模型組(P<0.01)。GB治療組Bcl-2蛋白在MNU給藥后1 d表達(dá)最強(qiáng)，2 d陽(yáng)性表達(dá)下降，3 d后陽(yáng)性表達(dá)消失，模型組未見(jiàn)視網(wǎng)膜Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)；GB治療組Bax蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P<0.01)。結(jié)論銀杏苦內(nèi)酯B能抑制MNU誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡，可能與上調(diào)Bcl-2的表達(dá)量，提高Bcl-2/Bax比值有關(guān)。

N-甲基-N-亞硝脲； 銀杏苦內(nèi)酯B； 視網(wǎng)膜； 細(xì)胞凋亡； 光感受器細(xì)胞

銀杏苦內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)是銀杏苦葉提取物中的主要的活性成分。已有研究[1-2]證實(shí)GB通過(guò)上調(diào)Bcl-2/Bax比值，劑量依賴性對(duì)抗谷氨酸興奮性毒性，保護(hù)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，并對(duì)N-甲基-N-亞硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性大鼠視網(wǎng)膜變性所致的大鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞損傷和視功能損害具有抑制作用。但GB在體內(nèi)的作用尚缺乏研究。本研究擬用免疫組化方法及RT-PCR法檢測(cè)MNU作用不同時(shí)間大鼠視網(wǎng)膜中Bcl-2和Bax的表達(dá)水平，旨在探討GB對(duì)MNU誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜變性的影響及作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 SD大鼠26只，生后46 d，雌雄不拘，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為粵監(jiān)證字2004A089。全部動(dòng)物飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)鼠籠內(nèi)，維持12 h白晝、12 h夜晚的時(shí)間周期。

1.2試劑和藥物 GB購(gòu)自廣州市藥檢所；MNU購(gòu)自Sigma；蛋白酶K購(gòu)自Merck；InSituCell Death Detection Kit試劑盒購(gòu)自Roche Applied Science；Bcl-2及Bax羊抗大鼠單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；caspase-3兔抗羊多克隆抗體、即用型SABC試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色試劑盒均購(gòu)自博士德公司；焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate, DEPC)處理水購(gòu)自威佳生物有限公司。DEPC購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；TrizolTM購(gòu)自Invitrogen Life Technologies；DNase I購(gòu)自Pharmacia；RNA提取用耗材需經(jīng)如下處理：0.1%DEPC溶液浸泡過(guò)夜，121 ℃高溫高壓30 min，以除去DEPC。100 bp DNA Ladder及2×Taq Platinum PCR MasterMix購(gòu)自北京天為時(shí)代生物技術(shù)有限公司；First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自Fermentas；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，序列如下：bcl-2(274 bp)正義鏈5'-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3' ，反義鏈5'-TAGTTCCACAAAGGCATCCC-3'；bax(301 bp)正義鏈5'-TGGCGATGAACTGGACAACAAC-3' ，反義鏈5'-CCCGAAGTAGGAAAGGAGGC-3'；內(nèi)參照β-actin(660 bp)正義鏈5'-CCAACCGTGAAAAGATGACC-3'，反義鏈5'-CAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'。

1.3儀器 倒置相差顯微鏡(Leica)；高速離心機(jī)(蘇州凈化設(shè)備廠)；生物和光學(xué)顯微鏡(Olympus)，直流穩(wěn)壓電泳儀(北京)；IBAS 2.0全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(Kontron)；PCR儀(Eppendorf)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Vilber Lourmat)；彩色圖像攝錄輸入儀(JVKky-F30B-CCD)。

2方法

2.1動(dòng)物模型的建立 生后46 d的SD大鼠26只，隨機(jī)分為A：正常對(duì)照組(6只)；B：模型組(10只)；C：GB治療組(10只)。GB治療組于生后46 d GB 40 mg/kg灌胃給藥，模型組給等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)灌服7 d，并于生后第50 d將B、C組分別按體重一次性腹腔注射MNU 40 mg/kg，建立大鼠視網(wǎng)膜變性模型。各組每次2只分別于腹腔注射MNU后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d處死動(dòng)物，取1只大鼠眼球做病理切片，另1只分離出視網(wǎng)膜提取RNA。

2.2TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡[1]檢測(cè)方法同文獻(xiàn)[1]。

2.3RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)水平 總RNA的提?。簩?0～100 mg視網(wǎng)膜組織放入DEPC處理過(guò)的研缽中，加入液氮后將組織研碎，加入1 mL Trizol，勻漿；加0.2 mL氯仿?lián)u勻，4 ℃12 000 r/min離心15 min；水相移至新管，加0.5 mL的異丙醇，4 ℃ 12 000 r/min離10 min；棄上清，加75%乙醇1 mL清洗，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清。真空干燥后，用DEPC處理過(guò)的ddH2O溶解沉淀。取1 μL RNA樣品，檢測(cè)其在260 nm和280 nm處的吸光度值比，確定其質(zhì)量、濃度；取1 μL RNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測(cè)RNA的完整性，其余的總RNA保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

使用RT試劑盒以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA分裝，-20 ℃凍存待用。以cDNA為模板，加入引物等進(jìn)行PCR反應(yīng)，主要反應(yīng)條件如下：bcl-2 60 ℃退火30 s，循環(huán)30次，PCR產(chǎn)物274 bp；bax 60 ℃退火30 s，循環(huán)30次，PCR產(chǎn)物301 bp；內(nèi)參照β-actin 60 ℃退火30 s，循環(huán)30次，PCR產(chǎn)物660 bp。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)顯帶，拍照。

凝膠的顯影結(jié)果經(jīng)全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)處理，計(jì)算每個(gè)目的條帶的積分吸光度值，計(jì)算bcl-2和bax與β-actin積分吸光度值的比值，得出bcl-2和bax相對(duì)于β-actin mRNA的表達(dá)量(bcl-2、bax/β-actin)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色方法同第二部分。計(jì)數(shù)方法：采用Kontron IBAS 2.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。400倍鏡下，自視盤旁開(kāi)始向鋸齒緣方向連續(xù)取4個(gè)視野，記錄每個(gè)視野中免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取每個(gè)樣本的平均值進(jìn)行分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡情況

正常組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)未見(jiàn)凋亡細(xì)胞核。模型對(duì)照組MNU作用1 d，視網(wǎng)膜外核層出現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核，2 d時(shí)大量增多，達(dá)高峰，隨后逐漸減少，5 d時(shí)仍見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核。GB 40 mg/kg治療組與模型組比較外核層細(xì)胞凋亡指數(shù)有顯著差異(P<0.01)，見(jiàn)圖1、表1。GB 40 mg/kg治療組在MNU造模后5 d時(shí)未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核。

Figure 1. The photoreceptor cell apoptosis was detected by TUNEL(×200).A，B，C：retina from MNU group at 1 d，2 d and 5 d after the 40 mg/kg MNU injection;D，E，F(xiàn)： retina from GB group at 1 d，2 d and 5 d after the 40 mg/kg MNU injection.

圖1TUNEL法檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡

表1各組大鼠視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞凋亡指數(shù)

Group1d2d3d5d7dControl0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0MNU22.4±5.338.8±3.514.0±5.66.8±4.30.0±0.0GB+MNU14.0±5.6**25.5±5.0**7.9±2.8**0.0±0.0**0.0±0.0**

**P<0.01vsMNU group.

2視網(wǎng)膜bcl-2和baxmRNA的表達(dá)水平

如圖2所示，正常對(duì)照組可檢測(cè)到bcl-2 mRNA的表達(dá)。 模型對(duì)照組MNU作用后12 h視網(wǎng)膜bcl-2 mRNA表達(dá)量下降，第1 d降至最低，表達(dá)量約低至正常的1/4，此后開(kāi)始回升。GB治療組在MNU處理12 h時(shí)，bcl-2 mRNA的表達(dá)升高，高于正常的2倍，24 h時(shí)達(dá)到最高，此后漸下降，第3 d降低最顯著，第5 d時(shí)又開(kāi)始回升，見(jiàn)表2。

如圖2所示，正常組可檢測(cè)到bax mRNA的表達(dá)。模型組MNU腹腔注射后12 h視網(wǎng)膜bax mRNA表達(dá)量上升，第2 d升至最高，表達(dá)量約至正常的9倍，此后開(kāi)始下降，第5 d時(shí)仍為正常的5倍。GB治療組在MNU處理12 h時(shí)，bax mRNA的表達(dá)升高，高于正常，第2 d升至最高，表達(dá)量約至正常的6倍，此后漸下降，第5 d時(shí)仍為正常的4倍，見(jiàn)表3。

模型對(duì)照組12 h、1 d、2 d、3 d和5 d時(shí)bcl-2/bax比值為0.36、0.15、0.29、0.42和0.64。GB治療組在MNU處理12 h、1 d、2 d、3 d和5 d時(shí)，bcl-2/bax比值分別為0.98、0.92、0.53、0.45和0.68，均高于模型組。

3免疫組織化學(xué)染色

正常對(duì)照組視網(wǎng)膜各層均未見(jiàn)Bcl-2和Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)。模型對(duì)照組1 d后，視網(wǎng)膜外核層可見(jiàn)Bax陽(yáng)性表達(dá)，2 d時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，此后逐漸表達(dá)減弱，5 d時(shí)仍有少量陽(yáng)性表達(dá)。MNU處理組各時(shí)點(diǎn)均未見(jiàn)視網(wǎng)膜Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)。

GB治療組Bcl-2在1 d表達(dá)最強(qiáng)，2 d陽(yáng)性表達(dá)下降，3 d后陽(yáng)性表達(dá)消失。Bax在2 d表達(dá)最強(qiáng)，3 d陽(yáng)性表達(dá)下降，5 d后仍有陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖3、4和表4。

Figure 2. The expression of bcl-2 and bax mRNA in retina at different time points after MNU injection.A：normal control； B～F：retina from GB group at 12 h，1 d，2 d，3 d and 5 d after the 40 mg/kg MNU injection； G～K：retina from MNU group at 12 h，1 d，2 d，3 d and 5 d after the 40 mg/kg MNU injection.

圖2各組在不同時(shí)間大鼠視網(wǎng)膜bcl-2和baxmRNA表達(dá)

表2各組不同時(shí)間視網(wǎng)膜bcl-2mRNA表達(dá)

Group12h1d2d3d5dControl0.44±0.080.44±0.080.44±0.080.44±0.080.44±0.08MNU0.39±0.090.14±0.080.61±0.110.71±0.120.81±0.19GB+MNU0.98±0.07**1.19±0.26**0.81±0.18**0.48±0.11**0.67±0.18**

**P<0.01vsMNU group.

表3各組不同時(shí)間視網(wǎng)膜baxmRNA表達(dá)

Group12h1d2d3d5dControl0.25±0.060.25±0.060.25±0.060.25±0.060.25±0.06MNU1.06±0.091.64±0.082.11±0.211.66±0.071.26±0.14GB+MNU1.00±0.11**1.28±0.18**1.54±0.24**1.07±0.13**0.99±0.16**

**P<0.01vsMNU group.

Figure 3. Bcl-2 expression in retina at different time points after MNU injection(immunohistochemical staining,×400). A：normal control；B：retina from MNU group at 1 d after the 40 mg/kg MNU injection；C，D，E：retina from GB group at 1 d,2 d and 3 d after the 40 mg/kg MNU injection.

圖3各組不同時(shí)間視網(wǎng)膜Bcl-2的表達(dá)

討 論

在研究藥物對(duì)光感受器的保護(hù)作用機(jī)制中采用了TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法。細(xì)胞凋亡中，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的黏性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling, TUNEL)，在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用，可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞[3]。

以往研究結(jié)果顯示：正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)未見(jiàn)凋亡細(xì)胞核。模型對(duì)照組1 d時(shí)，視網(wǎng)膜外核層出現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核，2 d時(shí)大量增多，達(dá)高峰，隨后逐漸減少，5 d時(shí)仍見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核。GB 40 mg/kg治療組與模型組比較外核層細(xì)胞凋亡指數(shù)有顯著差異(P<0.01)，GB 40 mg/kg治療組在MNU造模后5 d時(shí)未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核。提示GB能抑制MNU誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷大鼠的光感受器細(xì)胞的凋亡。

Figure 4. Bax expression of retina at different time after MNU injection(immunohistochemical staining,×400).A：normal control；；B，D：Retina form MNU group 2 d and 3 d after the 40 mg/kg MNU injection；C，E：Retina form GB group at 2 d and 3 d after the 40 mg/kg MNU injection.

圖4各組不同時(shí)間視網(wǎng)膜Bax的表達(dá)

表4各組不同時(shí)間視網(wǎng)膜Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)

Protein Group1d2d3d5dBcl-2MNU0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0GB+MNU30.5±3.4**16.1±2.3**0.0±0.00.0±0.0BaxMNU20.1±3.238.6±3.425.8±2.913.2±2.2GB+MNU15.5±2.4**23.8±2.9**10.2±1.9**6.2±1.5**

**P<0.01vsMNU group.

Bcl-2家族成員自身或彼此之間有形成二聚體或多聚體的能力，它們的相互作用調(diào)節(jié)著細(xì)胞的存活與凋亡。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白，并且Bax是Bcl-2活性的主要調(diào)控因子，Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞生存，Bax促進(jìn)細(xì)胞死亡，Bcl-2與Bax的比值對(duì)于決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡起決定性作用[4]。

研究認(rèn)為[5]，細(xì)胞色素C等凋亡前體物質(zhì)是通過(guò)線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore，PTP)開(kāi)放釋放到細(xì)胞質(zhì)中，外界凋亡誘導(dǎo)因素可導(dǎo)致PTP開(kāi)放，引起線粒體膜電位下降和細(xì)胞色素C等釋放。Harris等[6]指出，Bcl-2家族對(duì)PTP的開(kāi)放和關(guān)閉起重要調(diào)節(jié)作用。促凋亡蛋白Bax 可通過(guò)與線粒體內(nèi)膜的腺苷轉(zhuǎn)位因子(adenine nucleotide translocator，ANT)或外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)結(jié)合介導(dǎo)PTP開(kāi)放，而抗凋亡蛋白Bcl-2則可通過(guò)與Bax競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ANT，或直接阻止Bax與ANT或VDAC結(jié)合介導(dǎo)PTP關(guān)閉，而發(fā)揮抗凋亡作用。Bax只有形成低聚物才能在線粒體內(nèi)外膜之間形成孔道并釋放細(xì)胞色素C等；Bcl-2可通過(guò)阻止Bax在線粒體形成低聚物來(lái)發(fā)揮其凋亡作用[7，8]。在細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白是以異二聚體的形式存在，阻止Bax插入線粒體外膜，保護(hù)線粒體電勢(shì)梯度，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的自穩(wěn)狀態(tài)和氧化還原狀態(tài)來(lái)抑制凋亡。如果Bcl-2和Bax的表達(dá)量相互平衡，形成的Bcl-2/Bax異二聚體占優(yōu)勢(shì)，則細(xì)胞的存活期正常；如果Bcl-2過(guò)表達(dá)而Bax的表達(dá)不相應(yīng)增多，使形成的Bcl-2/Bcl-2同二聚體占優(yōu)勢(shì)，則細(xì)胞的存活期延長(zhǎng)；如Bax過(guò)表達(dá)而Bcl-2不相應(yīng)增多，使形成的Bax/Bax同二聚體占優(yōu)勢(shì)，則發(fā)生細(xì)胞凋亡[9]。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B抑制視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的凋亡，與上調(diào)Bcl-2的表達(dá)量、降低Bax表達(dá)、提高Bcl-2/Bax比值有關(guān)。

[1] 孟 晶, 唐仕波, 林少芬,等. 銀杏苦內(nèi)酯B對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2006, 22 (2): 791-795.

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ProtectivemechanismsofginkgolideBonratretinalcellapoptosisinducedbyN-methyl-N-nitrosourea

MENG Jing1, ZHANG Xu1, CHEN Qing-shan2, ZHANG Ri-jia1, DING Xiao-yan3

(1DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofEpidemiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3ZhongshanOphthalmicCenter,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China.E-mail:zqz1999@tom.com)

AIM: To investigate the protective mechanisms of ginkgolide B (GB) on rat retinal degeneration induced byN-methyl-N-nitrosourea (MNU).METHODSThe rat retinal degeneration model was made. Photoreceptor cell apoptosis was measured by TUNEL assay. The expression of Bcl-2 and Bax in the different time points in the rat retina after treated with MNU was measured by RT-PCR and immunohistochemical methods.RESULTSThe outer nuclear layer cell apoptotic index in GB treatment group was significantly lower than that in model group (P<0.01). The bcl-2/bax mRNA ratios at scheduled time points of 12 h, 1 d, 2 d, 3 d and 5 d after MNU injection in model control were 0.36, 0.15, 0.29, 0.42 and 0.64, respectively, while the ratios in GB group were 0.98, 0.92, 0.53, 0.45 and 0.68, respectively, larger than those in model control group (P<0.01). No Bcl-2 positive expression was detected at any scheduled time points after MNU injection in model control group. Strong positive Bcl-2 expression was detected in GB group 1 d after MNU injection, decreased at the 2nd day and disappeared at the 3rd day. Compared with model control group, the Bax expression in GB group was significantly decreased (P<0.01).CONCLUSIONGinkgolide B effectively inhibits the apoptosis of photoreceptor cells. The mechanism of GB action may be related to the increase in the expression of Bcl-2 and the increase in the ratio of Bcl-2/Bax.

N-methyl-N-nitrosourea; Ginkgolide B; Retina; Apoptosis; Photoreceptor cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.020