劉小勇， 陳 劍△， 周 清， 吳 靜， 王彥平， 金 玲， 徐錦堂， 賀春香， 姚 敏

(暨南大學 1附屬第一醫(yī)院眼科， 2醫(yī)學院眼科研究室， 3醫(yī)學院病理生理學教研室， 廣東 廣州 510630；4深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院眼科， 廣東 深圳 518101)

1000-4718(2012)04-0689-05

2011-11-01

2012-01-09

國家自然科學基金資助項目(No. 30872808；No. 81100637)；廣東省醫(yī)學科研基金資助項目(No. A2009364)

△通訊作者 Tel: 020-38688116； E-mail: drchenj@163.com

人羊膜上皮細胞體外培養(yǎng)重建角膜上皮的實驗研究*

劉小勇1， 陳 劍1△， 周 清1， 吳 靜2， 王彥平3， 金 玲4， 徐錦堂2， 賀春香1， 姚 敏1

(暨南大學1附屬第一醫(yī)院眼科，2醫(yī)學院眼科研究室，3醫(yī)學院病理生理學教研室， 廣東 廣州 510630；4深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院眼科， 廣東 深圳 518101)

目的探討人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells, HAECs)誘導分化為角膜上皮細胞的可塑性及其重建角膜上皮的可行性。方法取足月產(chǎn)人羊膜，通過膠原酶、胰蛋白酶和EDTA消化獲得HAECs，將細胞在體外培養(yǎng)擴增、傳代，將2～3代HAECs接種于去上皮的兔角膜基質(zhì)上培養(yǎng)，待HAECs融合形成單層后，置于插入式培養(yǎng)皿中進行氣液界面培養(yǎng)14 d。對角膜基質(zhì)上培養(yǎng)的HAECs用光鏡、掃描電鏡和透射電鏡進行形態(tài)學及超微結(jié)構(gòu)觀察，以及細胞角蛋白(CK)3/12的免疫組織化學檢測。結(jié)果HAECs可在角膜基質(zhì)上生長，培養(yǎng)1～2 d可形成單層，氣液界面培養(yǎng)14 d可形成4～5層細胞的復層上皮，掃描電鏡觀察細胞表面有豐富的微絨毛，透射電鏡下可見上皮細胞之間有橋粒連接，免疫組化檢測復層細胞表達CK3/12，所形成的復層結(jié)構(gòu)與正常角膜上皮相似。結(jié)論HAECs有可能作為種子細胞用于組織工程角膜上皮重建。

羊膜； 角膜； 上皮細胞； 組織工程

嚴重的眼表熱灼傷和化學傷、Stevens-Johnson 綜合征和眼類天皰瘡等所致的眼表損傷，可引起角膜緣干細胞缺損(limbal stem cell deficiency，LSCD)，表現(xiàn)為角膜上皮結(jié)膜化、角膜新生血管、角膜基質(zhì)瘢痕，最終導致視力嚴重受損。傳統(tǒng)的眼表重建術(shù)普遍存在供體來源匱乏、免疫排斥等缺點，組織工程角膜上皮重建給這類患者的治療帶來了希望，用培養(yǎng)的自體角膜緣干細胞進行角膜上皮重建已經(jīng)取得成功[1]，但由于其來源有限且對健眼不可避免地造成損傷，在臨床上應用受到一定限制；對于雙眼角膜緣干細胞缺乏者，則根本無自體角膜緣干細胞可供培養(yǎng)。

羊膜是位于羊膜腔內(nèi)的一層薄膜，人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells, HAECs)具有干細胞的某些的特性[2]。像許多未成熟細胞或干細胞一樣，HAECs表達的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)Ⅰ類抗原很少[1,3]。HAECs和角膜上皮細胞都是由外胚層分化而來，HAECs和角膜緣干細胞有相似的生物學特性。本實驗探討HAECs體外重建角膜上皮的可能性。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 新西蘭白兔(體重2.5～3.0 kg)由廣東省實驗動物中心提供。

1.2人羊膜的取材 人羊膜組織取自暨南大學附屬第一醫(yī)院剖宮產(chǎn)分娩健康產(chǎn)婦的胎膜，人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、甲肝、乙肝、梅毒等血清學檢測均為陰性。取材前征得產(chǎn)婦知情同意及醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。將羊膜與絨毛膜鈍性分離，置于含有1×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的PBS中反復沖洗。

1.3主要試劑 培養(yǎng)基DMEM (Gibco)，10%優(yōu)級胎牛血清 (Gibco)，10 μg/L 表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF, Peprotech)，4 mmol/ L谷氨酰氨(Sigma)，青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L和膠原酶Ⅱ(Gibco)，胰蛋白酶(Amresco)，EDTA(Amresco)。小鼠抗人細胞角蛋白(cytokeratin,CK)3/12單克隆抗體(Chemicon)，插入式培養(yǎng)皿Millipore-CM，孔徑0.4 μm，直徑30 mm。

2方法

2.1HAECs的培養(yǎng)及觀察 將漂冼后的羊膜用眼科剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm小塊，加入0.2%的膠原酶在37 ℃孵箱靜置消化2 h，1 000 r/min離心5 min，吸出膠原酶消化液，再加入1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化液在室溫下消化10 min，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，以1×108cells/L HAECs 2 mL細胞接種于培養(yǎng)瓶中，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液1 次，一般5～7 d以1∶3 傳代1次。培養(yǎng)的HAECs每天在倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化及其生長、增殖狀況。

2.2表層角膜基質(zhì)的制備 無菌條件下摘取新西蘭白兔眼球，徹底剪除球結(jié)膜及筋膜囊，正庚醇棉片敷在角膜上，30s后用棉簽擦去整個角膜的表層細胞，特別是角膜緣區(qū)上皮細胞，在解剖顯微鏡下觀察，確保角膜上皮細胞完全被去掉，無殘留。板層分離角膜，鉆取直徑7.5mm基質(zhì)片，黏附在無菌96 孔培養(yǎng)板底，加入相應的培養(yǎng)液，備用。隨機選取3 片用以上方法制備的角膜基質(zhì)片進行掃描電鏡檢查，確保無上皮殘留才使用。

2.3HAECs在角膜基質(zhì)上的生長分化及體外角膜上皮的重建 (1)實驗組：將獲得的2～3代HAECs種植在去上皮的兔角膜基質(zhì)片上，在每個基質(zhì)片上種植(0.5～1.0)×105個細胞。置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行浸泡培養(yǎng)。1～2 d后移入插入式培養(yǎng)皿加入適量培養(yǎng)液，使角膜基質(zhì)片與培養(yǎng)液接觸，上皮細胞與空氣接觸，進行氣液界面培養(yǎng)，隔天換液，連續(xù)14 d。(2)空白對照組，該組除角膜基質(zhì)片上不種植HAECs外其培養(yǎng)方式與實驗組完全相同。

2.4體外構(gòu)建的復層上皮組織的觀察與檢測

2.4.1定期于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況 氣液界面培養(yǎng)14 d進行HE染色檢測。

2.4.2掃描電子顯微鏡觀察 標本用2.5%戊二醛固定，PBS 液漂洗，1%鋨酸固定， 乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換，CO2臨界點真空干燥，BAL - TEC 離子濺射后， 應用Philips公司ESEM-30 掃描電鏡進行觀察。

2.4.3透射電鏡觀察 組織塊標本用2.5%戊二醛固定24 h，1%鋨酸后固定2 h，乙醇梯度脫水，再經(jīng)醋酸異戊酯置換、包埋液滲透、EPON 包埋后，超薄切片，應用Philips公司TECANAI-10 透射電鏡進行觀察。

2.4.4免疫組織化學檢測 體外培養(yǎng)的復層上皮組織采用10%甲醛固定。然后進行小鼠抗人CK3/CK12 單克隆抗體免疫組織化學鑒定，以正常角膜組織作為陽性對照，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。切片脫蠟至水；新鮮配制的3%H2O2室溫處理5～10 min，滅活內(nèi)源性酶； 0.5% Triton X-100打孔；滴加復合消化液，室溫10 min；滴加正常血清封閉液，室溫20 min；滴加1∶100稀釋的小鼠抗人CK3/12單抗(Ⅰ抗)，4 ℃過夜，PBS洗2 min×3次；滴加生物素化兔抗小鼠IgG (Ⅱ抗)，37 ℃ 20 min，PBS洗2 min ×3次；滴加抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37℃作用30min，PBS沖洗5 min ×5次；DAB顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素復染；脫水，透明，封片。

結(jié) 果

1倒置顯微鏡下觀察生物學特性

原代培養(yǎng)24 h后大部分細胞貼壁，剛貼壁的細胞呈圓形，折光性強，隨后細胞胞質(zhì)逐漸展開，折光性減弱。細胞貼壁3 d后生長迅速，增殖明顯，細胞數(shù)量明顯增多，細胞進入指數(shù)生長期。5～7 d左右形成單層，細胞融合成片，呈膜狀生長。細胞呈扁平不規(guī)則多角形，輪廓清晰，胞漿豐富，胞核呈圓形、卵圓形，見圖1。

Figure 1. Primary HAECs (inverted microscope, ×100).

圖1原代培養(yǎng)的人羊膜上皮細胞

將培養(yǎng)擴增的HAECs接種在制備的角膜基質(zhì)片上， 2～ 4 h細胞即貼附于基質(zhì)片上， 爾后細胞逐漸伸展成多角形，1～2 d融合成片，形成單層上皮細胞，見圖2。

Figure 2. HAECs formed a monolayer on the corneal stroma (HE staining,×100).

圖2人羊膜上皮細胞在角膜基質(zhì)上形成單層

2體外構(gòu)建的復層上皮組織學檢測

常規(guī)HE染色的組織切片顯示：形成單層的上皮細胞在插入式培養(yǎng)皿中進行氣液界面培養(yǎng)14 d，可形成復層上皮。體外培養(yǎng)的角膜組織由角膜基質(zhì)層和復層的上皮細胞組成，共4～5 層上皮細胞貼附于角膜基質(zhì)上，接觸角膜基質(zhì)的上皮細胞呈立方形或柱狀，表層上皮細胞形態(tài)呈扁平狀，見圖3，與正常角膜上皮相似，見圖4。而空白對照組上無任何上皮細胞生長，見圖5。

Figure 3. HAECs formed 4 to 5 layers of cells on the corneal stroma(HE staining,×200).

圖3人羊膜上皮細胞在角膜基質(zhì)上形成復層

Figure 4. Normal rabbit cornea(HE staining,×200).

圖4正常兔角膜

Figure 5. The control group without corneal epithelial cells on the stroma(HE staining,×200).

圖5空白對照組角膜基質(zhì)片上無上皮細胞生長

3復層上皮組織的超微結(jié)構(gòu)觀察

3.1掃描電鏡下見角膜基質(zhì)上生長的上皮細胞呈多角形，形態(tài)不規(guī)則，細胞間伸出足突連接，體形飽滿，立體感強，表面有豐富的微絨毛，細胞呈疊層生長，見圖6。

Figure 6. A wealth of microvilli on the surface of HAECs(SEM,×4 000).

圖6羊膜上皮細胞表面有豐富的微絨毛

3.2透射電鏡下見上皮細胞含豐富的細胞器，細胞核呈橢圓形，核膜清晰，基底層細胞較表層細胞高大，細胞間可見橋粒連接，見圖7。

Figure 7. Desmosomes (arrows indicated) formed among HAECs(TEM,bar=0.5 μm).

圖7上皮細胞之間橋粒形成

4免疫組織化學檢測

抗CK3/12 單克隆抗體免疫組織化學檢測顯示角膜基質(zhì)上培養(yǎng)的HAECs以及作為陽性對照的正常兔角膜上皮細胞都有棕黃色顆粒表達，即細胞正常表達角膜上皮特異性CK3/12，見圖8；而陰性對照無表達，胞漿里無棕黃色顆粒，只見襯染的核呈紫藍色(結(jié)果未顯示)。

討 論

角膜緣干細胞位于角膜緣上皮基底層，具有分化程度低、生命周期長、高度增生潛能、自我更新的能力，是角膜上皮細胞增殖和分化的源泉。Pellegrini 等[1]以治療性親水的軟性角膜接觸鏡為載體種植體外擴增的自體角膜緣干細胞，成功治療了角膜緣干細胞缺陷性眼表疾病。角膜緣干細胞是眼表重建最理想的種子細胞，但這種方法不可避免要對供體眼造成損傷，且由于角膜緣干細胞的重要性及數(shù)量有限，很難獲得足夠數(shù)量的自體角膜緣干細胞。對于因各種疾病及理化因素導致雙眼角膜緣干細胞缺損，則無自體角膜緣干細胞可供利用。因此需要尋找可替代角膜緣干細胞功能的種子細胞來重建眼表。

Figure 8. Positive expression of CK3/12 in HAECs cultured on rabbit corneal stroma for 14 d (immunohistochemical staining,×200).

圖8hAECs在兔角膜基質(zhì)片上培養(yǎng)14d，誘導后的上皮細胞CK3/12呈陽性表達

細胞能經(jīng)受一種上皮細胞型到另外一種上皮細胞型的轉(zhuǎn)化，這種現(xiàn)象在上皮細胞生物學領(lǐng)域已被廣泛接受[4]。HAECs位于羊膜的最內(nèi)層，HAECs在受精后第8 d從外胚葉發(fā)育而來，使其可能維持原腸胚形成前期胚胎干細胞的可塑性[1]。HAECs不表達HLA-A、B、C或DR抗原，移植后不易引起免疫排斥反應[2]。此外，HAECs被認為即使在異體移植術(shù)后也有相對抵抗排斥反應的能力，因為HAECs表達免疫抑制因子如CD59[5]和可溶性HLA-G[6]。HAECs擁有和胚胎干細胞同樣的表面標記蛋白，也擁有oct-4和Nanog基因[2]，這兩個基因是使細胞保持分化潛力的關(guān)鍵基因。HAECs能在不同微環(huán)境和生長因子的調(diào)控下，分化成肝細胞[7]、神經(jīng)元細胞[8]、毛囊和皮膚上皮細胞[4]，HAECs理論上可以分化成各種組織細胞[2]。Parmar等[9]將HAECs種植在角膜膠原罩上治療持續(xù)性角膜上皮缺損，取得了良好的效果。Fatimah通過對HAECs的體外分化能力、免疫型、上皮細胞基因表達及免疫細胞化學分析，認為HAECs具有上皮干細胞的特征，具有分化為角膜上皮細胞的能力[10]。李瑋等[11]研究發(fā)現(xiàn)體外構(gòu)建的維蛋白支架與羊膜上皮細胞有組織相容性，纖維蛋白支架可能作為人羊膜上皮細胞的生長載體和胎膜破口的修復材料。趙芳等[12]則通過纖維蛋白膠為載體構(gòu)建組織工程HAECs植片的實驗表明HAECs可能應用于眼表重建。

我們設(shè)想HAECs能在角膜基質(zhì)的誘導下分化為角膜樣上皮細胞，并構(gòu)建組織工程角膜表層。實驗表明，培養(yǎng)擴增的HAECs能在去除上皮細胞的角膜基質(zhì)上較好地黏附生長并增殖，形成4～5層復層上皮，基底細胞呈柱狀或立方形，表層細胞呈扁平上皮細胞狀。上皮細胞之間有橋粒連接形成，并在角膜基質(zhì)上形成復層上皮組織，組織結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)與生理條件下角膜上皮極為相似，而且表達CK3/12。目前認為CK3/12是角膜上皮細胞表達的特異性標志角蛋白，正常情況下HAECs并不表達CK3/12。據(jù)此可以推測誘導分化后的HAECs表達了角膜上皮細胞的部分功能，HAECs在角膜基質(zhì)的誘導下可以分化為角膜樣上皮細胞。

不同組織的微環(huán)境成分不同，細胞的分化和發(fā)育與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)。角膜基質(zhì)是角膜上皮細胞生長分化重要的微環(huán)境，角膜基質(zhì)具有誘導其表面的非角膜細胞向角膜上皮細胞分化的能力[13]。體外實驗顯示，角膜基質(zhì)也可以誘導胚胎干細胞定向分化為角膜上皮細胞[14]。皮膚干細胞[15]、毛囊干細胞[16]在角膜基質(zhì)的誘導下也可以分化為角膜上皮細胞。我們利用角膜基質(zhì)作為載體誘導HAECs分化，得到了在形態(tài)結(jié)構(gòu)以及在角膜上皮特異性表面標志蛋白CK3/12的表達上均類似角膜上皮細胞的細胞。這進一步證明角膜基質(zhì)微環(huán)境在調(diào)控角膜上皮細胞的分化過程中起重要作用。

本實驗表明HAECs在角膜基質(zhì)的調(diào)控下可向角膜上皮細胞分化，HAECs可能是角膜上皮組織工程重建的一種潛在的種子細胞。

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Reconstructionofcornealepitheliumbyhumanamnioticepithelialcellsculturedinvitro

LIU Xiao-yong1, CHEN Jian1, ZHOU Qing1, WU Jing2, WANG Yan-ping3, JIN Ling4, XU Jing-tang2, HE Chun-xiang1, YAO Min1

(1DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospital，2DepartmentofOphthalmology,SchoolofMedicine，3DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510630,China;4DepartmentofOphthalmology,People’sHospitalofBao’anDistrict,Shenzhen518101,China.E-mail:drchenj@163.com)

AIM: To investigate the plasticity of human amniotic epithelial cells induced to differentiate into corneal epithelial cells and the feasibility of corneal epithelium reconstruction.METHODSA piece of amniotic membrane taken from an uncomplicated elective caesarean section was digested by collagenase, trypsin and EDTA. The amniotic epithelial cells were primarily cultured and passaged in Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% fetal bovine serum. The HAECs of the 2nd or 3rd generation were continuously cultured on fresh corneal stroma. One or two days later, the human amniotic epithelial cells formed a monolayer, and then the air-lifting cultivation was carried out in an insert culture dish. The cultured cells on corneal stroma were investigated morphologically by hematoxylin-eosin staining,and its ultramicrostructure was studied by scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). Meanwhile, the expression of cytokeratin (CK)3/12 was detected by immunohistochemistry.RESULTSHuman amniotic epithelial cells were successfully reproduced on corneal stromainvitro. The monolayer was formed after cultured for 1 or 2 days, and stratification with 4 to 5 layers of epithelial cells was observed 14 days after air-lifting cultivation. A wealth of microvilli on the surface of HAECs were observed by SEM,while desmosomes among HAECs were found by TEM.The stra-tified cells expressed CK3/12. The composed tissue was very similar to normal corneal epithelium.CONCLUSIONHuman amniotic epithelial cells can be used as seed cells to reconstruct the corneal epithelium by the technique of tissue engineering.

Amnion; Cornea; Epithelial cells; Tissue engineering

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.019