韋美丹, 林繼宗, 朱 寧, 王克萬(wàn), 王 勇△

(1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科, 廣東 廣州 510282； 2中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝膽外科, 廣東 廣州 510630； 3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科, 廣東 廣州 510015)

1000-4718(2012)04-0683-06

2011-12-27

2012-03-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No.30973162); 廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No.07005203)

△通訊作者 Tel:020-61643555; E-mail:yongwh2005@163.com

Aβ1-42作用的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞生存的影響*

韋美丹1, 林繼宗2, 朱 寧1, 王克萬(wàn)3, 王 勇1△

(1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科, 廣東 廣州 510282；2中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝膽外科, 廣東 廣州 510630；3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科, 廣東 廣州 510015)

目的探討β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)作用的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)生存的影響。方法利用Transwell小室在體外建立NSCs與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，檢測(cè)Aβ1-42蛋白作用小膠質(zhì)細(xì)胞前后NSCs增殖、分化及凋亡情況。結(jié)果與單純共培養(yǎng)組相比，Aβ1-42干預(yù)共培養(yǎng)組的增殖率降低，且微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)化酶(CHAT)陽(yáng)性表達(dá)率也均降低。結(jié)論Aβ1-42介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，并能顯著降低其分化成神經(jīng)元尤其是膽堿能神經(jīng)元的能力。

小膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞；阿爾茨海默??； 淀粉樣β蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種神經(jīng)元進(jìn)行性丟失和認(rèn)知障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein, Aβ)沉積激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致AD腦內(nèi)神經(jīng)元丟失的重要原因[2]。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的神經(jīng)前體細(xì)胞，正常條件下可以分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等。但是，從神經(jīng)干細(xì)胞技術(shù)治療AD構(gòu)想的提出到現(xiàn)在，無(wú)論是促進(jìn)AD患者內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞生成還是外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植，均未獲得成功。這可能與Aβ致AD患者顱內(nèi)“微環(huán)境”改變有關(guān)。因此，如何改善AD腦內(nèi)“微環(huán)境”進(jìn)行干細(xì)胞移植成為治療AD研究熱點(diǎn)。本研究旨在利用Transwell裝置建立神經(jīng)干細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，在細(xì)胞水平上探討Aβ作用的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞生存的影響，以證實(shí)Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞生成抑制是否通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞間接實(shí)現(xiàn)。

材 料 和 方 法

1材料

新生SD大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)為SCXK (粵) 2006-0015]。DMEM/F12、B27、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、胰酶和L-谷氨酰胺(L-glutamine,L-Gln)均購(gòu)自Gibco；表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EFG)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth, bFGF)均購(gòu)自R&D system；神經(jīng)巢蛋白(nestin)、5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、CD11b/c、微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2, MAP-2)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase, CHAT)抗體及相關(guān)Ⅱ抗均購(gòu)自Abcam; 多聚賴(lài)氨酸、Aβ1-42、Hoechst 33258及annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma；Transwell板 (孔直徑0.4 μm) 購(gòu)自Costar。

2方法

2.1大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定 參照蘭艷纖等[3]的方法,新生SD大鼠海馬組織中分離出的細(xì)胞用含EGF(20 μg/L)、bFGF(20 μg/L)、B27(2%)、L-Gln(2%)和青鏈雙霉素(1%)的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸后以1×109/L接種于25 cm2透氣培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d半量換液第7 d結(jié)束原代培養(yǎng)并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每6～7 d傳代1次。取第2代NSCs進(jìn)行nestin鑒定；第2代神經(jīng)細(xì)胞球制備單細(xì)胞懸液，加入10 μmol/L BrdU標(biāo)記24 h后全量換液培養(yǎng)4 d后將神經(jīng)細(xì)胞球轉(zhuǎn)移到用多聚賴(lài)氨酸包處理的24孔板中貼壁培養(yǎng)2 h后，免疫熒光鑒定細(xì)胞增殖能力；第2代神經(jīng)干細(xì)胞用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行正常分化處理，分化10 d后分別行GFAP和MAP-2免疫細(xì)胞熒光染色鑒定細(xì)胞多向分化潛能。

2.2大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的純化、培養(yǎng)與鑒定 參照雷露雯等[4]的方法，新生SD大鼠海馬組織經(jīng)0.125% 胰蛋白酶消化后離心，棄上清，細(xì)胞沉淀用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，單細(xì)胞懸液以5×108/L細(xì)胞密度接種于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸包被處理的75 cm2透氣培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)2 d后全量換液，待培養(yǎng)至7～9 d，手搖法分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞，并通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體CD11b/c進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，同時(shí)以Hoechst 33258對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，以明確細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算小膠質(zhì)細(xì)胞純度。

2.3共培養(yǎng)體系的建立與實(shí)驗(yàn)分組 用6孔板的Transwell小室構(gòu)建雙層細(xì)胞共用培養(yǎng)液而不直接接觸的共培養(yǎng)體系。將Transwell小室作為培養(yǎng)體系上室，接種NSCs，培養(yǎng)體系下室為6孔塑料培養(yǎng)板，接種純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞，探討Aβ1-42激活小膠質(zhì)細(xì)胞前后對(duì)NSCs生存的影響。實(shí)驗(yàn)分4組：(1) 空白對(duì)照組(control)：神經(jīng)干細(xì)胞正常培養(yǎng)于上室，下室加培養(yǎng)基；(2) 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(Aβ1-42+NSCs)：神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)于上室，下室加入10 μmol/L Aβ1-42的培養(yǎng)基；(3) 單純共培養(yǎng)組(microglia and NSCs coculture)：神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞以1∶1的濃度比依次接種于上室和下室； (4) Aβ1-42干預(yù)共培養(yǎng)組(Aβ1-42+microglia and NSCs coculture)：神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞以1∶1的濃度比依次接種于上室和下室，同時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞層加入10 μmol/L Aβ1-42。各處理組于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)96 h后，進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

2.4BrdU摻入法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖率 第2代神經(jīng)干細(xì)胞球制備成單細(xì)胞懸液，加入10 μmol/L BrdU標(biāo)記24 h后，收集細(xì)胞并重懸。細(xì)胞懸液按照實(shí)驗(yàn)分組情況分別進(jìn)行加藥處理。共培養(yǎng)96 h后將各組神經(jīng)細(xì)胞球轉(zhuǎn)移到用多聚賴(lài)氨酸包被處理過(guò)的24孔板中貼壁培養(yǎng)2 h后，按常規(guī)方法進(jìn)行免疫熒光鑒定各組細(xì)胞BrdU表達(dá)，即：收集各組細(xì)胞，4% 多聚甲醛室溫固定；0.3% Triton X-100透化處理；10% 山羊血清封閉后，小鼠抗BrdU單抗4 ℃濕盒孵育過(guò)夜；FITC羊抗小鼠IgG避光孵育1.5 h。Hoechst 33258核染后，熒光顯微鏡下觀察并照相。

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞分化 第2代神經(jīng)干細(xì)胞球用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行正常分化處理5 d后，按照實(shí)驗(yàn)分組情況分別進(jìn)行加藥處理。共培養(yǎng)96 h后行MAP-2和CHAT免疫熒光染色。所用Ⅰ抗分別為鑒定神經(jīng)元的小鼠抗MAP-2單抗和鑒定膽堿能神經(jīng)元的兔抗CHAT多克隆抗體。所用Ⅱ抗分別為FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG和抗兔IgG 抗體。采用流式細(xì)胞儀(FACS)分析，用Cell Quest 3.0 軟件進(jìn)行分析。

2.6流式細(xì)胞儀分析神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率 第2代神經(jīng)干細(xì)胞球制備成單個(gè)細(xì)胞懸液并用含EGF(20 μg/L)、bFGF(20 μg/L)、B27(2%)、L-Gln(2%)和青鏈雙霉素(1%)的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，然后按照實(shí)驗(yàn)分組情況分別進(jìn)行加藥處理。各組細(xì)胞經(jīng)處理96 h之后，參照annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行前期處理后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1NSCs培養(yǎng)及鑒定

倒置顯微鏡鏡下觀察：原代接種的細(xì)胞為圓型、透亮的單個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)2～4 d后，可形成由數(shù)十至數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的神經(jīng)干細(xì)胞球，細(xì)胞球球體透亮，形態(tài)規(guī)則，邊緣整齊，邊界清晰，排列緊密，周邊有亮的光暈，培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1A；經(jīng)免疫熒光鑒定神經(jīng)細(xì)胞球表達(dá)nestin陽(yáng)性，見(jiàn)圖1B；BrdU陽(yáng)性，見(jiàn)圖2。10% FBS分化條件下培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，可見(jiàn)細(xì)胞逐漸從球體中“爬”出來(lái)，培養(yǎng)5 d后細(xì)胞呈多種形態(tài)，見(jiàn)圖3A；經(jīng)免疫熒光鑒定部分細(xì)胞呈MAP-2陽(yáng)性，見(jiàn)圖3B；GFAP陽(yáng)性，見(jiàn)圖3C。

Figure 1. Morphology and identification of the cultured fetal neural stem cells derived from the hippocampus (scale bar=100 μm). A:inverted microscope photograph showed numerous neurospheres at 3 d of primary culture. B: most of the cells in the second passage of neurospheres were nestin positive.

圖1神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

Figure 2. Identification of the neural stem cells (NSCs) by BrdU incorporation. Nearly all cells expressed high level of BrdU (A and C, green). Nuclei were counterstained with Hoechst 33258 (B and C, blue). Scale bar=100 μm.

圖2BrdU摻入法檢測(cè)NSCs增殖

Figure 3. Identification of the neural stem cells (NSCs) by immunofluorescence.A:a number of cells migrated from the neurosphere and were induced by 10% FBS for 5 dinvitro(×400);B:the microtubule-associated protein 2 (MAP-2) positive cells differentiated from passage neurospheres (green);C:the glial fibrillary acidic protein (GFAP) positive cells differentiated from passage neurosphere (red). Scale bar=100 μm in B and C.

圖3免疫熒光檢測(cè)NSCs分化

2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

原代培養(yǎng)的細(xì)胞主要是以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主，并含有小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少量的少突膠質(zhì)細(xì)胞，見(jiàn)圖4A。細(xì)胞培養(yǎng)9 d出現(xiàn)分層現(xiàn)象后，通過(guò)手搖法分離純化獲得小膠質(zhì)細(xì)胞。顯微鏡下觀察：小膠質(zhì)細(xì)胞胞體扁平或卵圓形,突起細(xì)長(zhǎng)，見(jiàn)圖4B。經(jīng)CD11b/c免疫熒光檢測(cè)，陽(yáng)性率在95%以上，見(jiàn)圖5。

Figure 4. Isolation and purification of microglia (×200).A: morphology of the primary glial cells 9 d after culture;B: the purity of microglia 2 d after culture.

圖4小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化

Figure 5. Identification of the purified microglia by CD11b/c immunofluorescent staining(scale bar=100 μm). A:the localization of CD11b/c was shown in red;B:nuclei were counterstained with Hoechst 33258;C:a merged image showed that more than 95% cells were double positive for microglial marker CD11b/c.

圖5免疫熒光鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞

3BrdU摻入法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖

BrdU摻入法檢測(cè)各組神經(jīng)干細(xì)胞增殖率依次為：78.78%±5.49%、48.58%±1.83%、77.23%±14.77%和26.95%±3.30%。數(shù)據(jù)顯示，單純共培養(yǎng)組與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而Aβ1-42干預(yù)共培養(yǎng)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及單純共培養(yǎng)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。這表明未經(jīng)Aβ1-42作用的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)NSCs增殖影響不顯著；Aβ1-42既能直接影響NSCs的增殖，又能通過(guò)作用于小膠質(zhì)細(xì)胞使NSCs增殖抑制加強(qiáng)，見(jiàn)圖6。

Figure 6. The proliferation of NSCs detected by BrdU incorporation (scale bar=100 μm). A:NSCs control;B: Aβ1-42+NSCs;C:microglia and NSCs coculture;D:Aβ1-42+microglia and NSCs coculture. The proportion of BrdU positive cells (A-D, green) relative to total cell count was estimated under a fluorescent microscope.Nuclei were counterstained with Hoechst 33258 (A-D, blue).

圖6BrdU摻入法檢測(cè)NSCs增殖

4小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)共培養(yǎng)NSCs分化的影響

圖7顯示，單純共培養(yǎng)組的MAP-2和CHAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于空白對(duì)照組(P<0.01)。與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和單純共培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)體系中10 μmol/L Aβ1-42作用于小膠質(zhì)細(xì)胞后， MAP-2和CHAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

5流式細(xì)胞儀檢測(cè)NSCs凋亡率

表1顯示，單純共培養(yǎng)NSCs與小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，NSCs凋亡率與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而在共培養(yǎng)體系中，小膠質(zhì)細(xì)胞層中加入10 μmol/L Aβ1-42共同孵育96 h后，NSCs凋亡率均高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與單純共培養(yǎng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

討 論

Transwell是一種帶有Transwell小室、外形為一個(gè)可放置在細(xì)胞培養(yǎng)板里的小杯子，杯子底層具有通透性的聚碳酸酯膜的裝置，目前主要應(yīng)用于細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、共培養(yǎng)等多種方面的研究。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者利用共培養(yǎng)技術(shù)研究細(xì)胞與細(xì)胞或是細(xì)胞與組織間的相互作用[5]。而這些研究主要是采取同一培養(yǎng)瓶、細(xì)胞相互接觸的方法進(jìn)行共培養(yǎng)，針對(duì)的對(duì)象主要為神經(jīng)元，關(guān)于NSCs共培養(yǎng)研究較少。我們根據(jù)孔徑0.4 μm的Transwell半透膜僅可以通過(guò)培養(yǎng)液而不能透過(guò)細(xì)胞的特點(diǎn)，在6孔塑料培養(yǎng)板上架起Transwell小室，構(gòu)建NSCs與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系。與以往研究不同的是，我們采用Transwell這種特殊裝置，實(shí)現(xiàn)非接觸性細(xì)胞通訊，觀察共培養(yǎng)體系中小膠質(zhì)細(xì)胞在Aβ1-42作用下對(duì)NSCs生存的影響。為此，獲得高純度的神經(jīng)干細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是本研究構(gòu)建共培養(yǎng)體系成功與否的關(guān)鍵。

Nestin(巢蛋白)是一種中間絲類(lèi)型的蛋白，能夠特異性表達(dá)在神經(jīng)上皮干細(xì)胞上的一種分子標(biāo)記物，是目前鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的主要特征性標(biāo)記物[6]。本研究從新生SD乳鼠的海馬組織中分離出單細(xì)胞重懸于無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)第3 d即可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞球，懸浮于培養(yǎng)液中。神經(jīng)球經(jīng)0.125 %胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，3～4 d后重新形成神經(jīng)球，數(shù)量明顯多于第1代，免疫熒光鑒定呈nestin陽(yáng)性，證實(shí)具有神經(jīng)干細(xì)胞特性。神經(jīng)干細(xì)胞除能表達(dá)nestin外，在功能上具有增殖分化的能力，因此，我們繼續(xù)觀察了培養(yǎng)的細(xì)胞球增殖分化的能力。將原細(xì)胞球分散成單細(xì)胞后，用10 μmol/L BrdU標(biāo)記24 h后全量換液培養(yǎng)4 d后，行免疫熒光鑒定。結(jié)果顯示絕大多數(shù)細(xì)胞呈BrdU陽(yáng)性，說(shuō)明它們是具有分裂、增殖能力的細(xì)胞。當(dāng)神經(jīng)球重懸于含10% FBS的DMEM/F12并接種于預(yù)先經(jīng)多聚賴(lài)氨酸包被的24孔板時(shí)，神經(jīng)球開(kāi)始貼壁分化，可見(jiàn)細(xì)胞從球體周?chē)饾u遷移，隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)突起細(xì)胞并漸有突起增長(zhǎng)、相互連接交織成網(wǎng)，形成可表達(dá)MAP-2、GFAP的神經(jīng)元樣細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，提示培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞具有分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的潛能，從而也進(jìn)一步證實(shí)了神經(jīng)干細(xì)胞的多向分化潛能。

圖7各組MAP-2及CHAT陽(yáng)性細(xì)胞熒光表達(dá)率的比較

表1各組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率的比較

GroupApoptoticrateNSCscontrol5.76±2.01Aβ1-42+NSCs25.77±0.48**MicrogliaandNSCscoculture8.43±5.35##Aβ1-42+microgliaandNSCscoculture45.19±1.02**##

**P<0.01vsNSCs control;##P<0.01vsAβ1-42+NSCs.

關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，目前學(xué)者們主要是采用搖床振搖和利多卡因分離的方式從混合培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中分離小膠質(zhì)細(xì)胞[4, 7]。本研究考慮到分離的小膠質(zhì)細(xì)胞純度會(huì)直接影響到Transwell體系的建立，我們采用了溫和的手搖法從混合培養(yǎng)的神膠質(zhì)細(xì)胞中分離小膠質(zhì)細(xì)胞。該方法收集到的小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較佳，細(xì)胞胞體呈圓型并具有較好的折光性，30 min內(nèi)即可貼壁。同時(shí)，收獲的小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)30 min后全量換液，去除未貼壁的細(xì)胞可達(dá)到純化的目的。繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，可出現(xiàn)較多較短突起，少數(shù)細(xì)長(zhǎng)突起，部分為圓型或橢圓形。經(jīng)免疫熒光鑒定，分離的細(xì)胞有95% 可表達(dá)CD11b/c陽(yáng)性，即為小膠質(zhì)細(xì)胞。本研究體外獲得了高純度、高活力的神經(jīng)干細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，為T(mén)ranswell共培養(yǎng)體系的建立提供了良好的細(xì)胞來(lái)源。

體內(nèi)外研究均提示Aβ可激活小膠質(zhì)細(xì)胞[8]，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞后可釋放多種細(xì)胞因子、趨化因子、補(bǔ)體及其激活物，導(dǎo)致非特異性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生慢性炎性反應(yīng)[9]。這種效應(yīng)能否破壞腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞生存和分化環(huán)境，造成內(nèi)源性或移植的外源性神經(jīng)干細(xì)胞不能發(fā)揮正常功能，導(dǎo)致AD腦內(nèi)丟失的神經(jīng)細(xì)胞得不到及時(shí)補(bǔ)充，目前尚未得到證實(shí)。因此，本實(shí)驗(yàn)建立神經(jīng)干細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，先觀察了Aβ1-42作用于小膠質(zhì)細(xì)胞前后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化情況。結(jié)果顯示未經(jīng)Aβ1-42作用的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)共培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響作用，以往的研究也有類(lèi)似報(bào)道[10]；但神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元的比例下降，這可能與正常情況下小膠質(zhì)細(xì)胞分泌某些因子有關(guān)。研究表明Aβ1-42能夠直接抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，減少其分化成神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元的比例。在神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，Aβ1-42抑制神經(jīng)干細(xì)胞自我更新能力及多向分化潛能的這種作用尤為明顯，證實(shí)了Aβ1-42對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生存抑制的作用可能通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞而加強(qiáng)。也許正是這些因素，導(dǎo)致AD腦內(nèi)微環(huán)境改變，影響內(nèi)源性或外源性NSCs的生存。這既構(gòu)成目前臨床上應(yīng)用NSCs治療AD的嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，也為AD的進(jìn)一步治療提供了新的線(xiàn)索。

因此，通過(guò)干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞改善患者腦內(nèi)“微環(huán)境”，促進(jìn)內(nèi)源性或外源性NSCs生存，是干細(xì)胞移植治療神經(jīng)元退行性疾病的有效途徑。而Aβ介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與NSCs失能之間的關(guān)系及作用機(jī)制還須進(jìn)一步深入研究。

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EffectsofAβ1-42-inducedmicroglialcellsonsurvivalofneuralstemcellsinvitro

WEI Mei-dan1, LIN Ji-zong2, ZHU Ning1, WANG Ke-wan3, WANG Yong1

(1DepartmentofPharmacy,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China;2DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;3DepartmentofNeurosurgery,SouthernHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:yongwh2005@163.com)

AIM: To explore the effects of β-amyloid protein 1-42 (Aβ1-42)-induced microglia on the survival of cultured neural stem cells (NSCs)invitro.METHODSUsing the Transwell chambers to build a coculture system of NSCs and microglia, we detected the proliferation, differentiation and apoptosis of the NSCs with the microglia before and after induction by Aβ1-42.RESULTSCompared with non-intervention group, the proliferation rate of NSCs in Aβ1-42intervention coculture group decreased, as well as the positive expression rates of microtubule-associated protein 2 (MAP-2) and choline acetyltransferase.CONCLUSIONThe inflammation mediated by Aβ1-42inhib their the proliferation of NSCs and induces their apoptosis. Inflammation also significantly reduces the ratio of NSCs differentiating to neurons, especially to cholinergic neurons.

Microglial; Neural stem cells; Alzheimer disease; Amyloid beta-protein

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.018