楊彩紅， 張軒萍， 梁月琴， 李 焰， 郝一彬

(山西醫(yī)科大學(xué)1藥理教研室，2機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001)

1000-4718(2012)04-0669-06

2011-10-21

2012-02-13

山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No.03201102)

△通訊作者 Tel: 0351-4135079; E-mail: tyyangxiaoluo@163.com

CGRP通過抑制TNF-α介導(dǎo)單磷酰脂A對大鼠小腸的預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)作用*

楊彩紅1△， 張軒萍1， 梁月琴2， 李 焰2， 郝一彬1

(山西醫(yī)科大學(xué)1藥理教研室，2機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001)

目的探討降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)介導(dǎo)的單磷酰脂A(MLA)對大鼠小腸的預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)作用是否通過抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)而產(chǎn)生。方法通過給予MLA(500 μg·kg-1，ip)藥物預(yù)適應(yīng)，利用在體缺血再灌注(I/R)和原位灌流模型，檢測外周血、灌流液和組織中乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量和組織形態(tài)學(xué)改變以顯示缺血再灌注損傷和藥物的作用；通過放射免疫法測定血漿中CGRP和TNF-α含量探討MLA預(yù)適應(yīng)對大鼠小腸保護(hù)作用的機(jī)制。結(jié)果與I/R組相比，給予MLA后可使I/R組LDH活性和MDA含量明顯降低(P<0.05)；同時(shí)MLA使I/R損傷大鼠CGRP含量顯著升高，TNF-α含量下降(P<0.01)。使用CGRP拮抗劑CGRP8-37及辣椒素(capsaicin)耗竭CGRP后，均可消除MLA的這一作用。結(jié)論MLA對在體、原位灌流大鼠小腸均誘導(dǎo)產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)的延遲保護(hù)作用；CGRP可能通過抑制TNF-α的產(chǎn)生而介導(dǎo)MLA誘導(dǎo)的預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)作用。

單磷酰脂A； 降鈣素基因相關(guān)肽； 腫瘤壞死因子

預(yù)適應(yīng)是對抗缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷的一種最有效手段，有早期保護(hù)和延遲保護(hù)2個(gè)不同時(shí)相的作用。延遲預(yù)適應(yīng)(delayed preconditioning)的保護(hù)作用需經(jīng)過10多個(gè)小時(shí)才明顯形成，并能維持幾天甚至更長時(shí)間。預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用不僅發(fā)生在心臟，也出現(xiàn)在心外組織[1]，本課題組早期的研究工作均表明小腸也存在預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用，而且表明其保護(hù)機(jī)制與KATP通道開放及內(nèi)源性阿片肽的釋放有關(guān)[2-3]。

單磷酰脂A(monophosphoryl lipid A, MLA)是從細(xì)菌脂多糖中提取純化的一種內(nèi)毒素的無毒衍生物。MLA預(yù)處理對動(dòng)物在體心臟與離體心臟均能誘導(dǎo)產(chǎn)生延遲保護(hù)作用，顯著縮小心肌梗塞面積和改善心功能，其效果明確，毒副作用小，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景[4]。但其產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用的機(jī)制還不清楚，有研究結(jié)果表明，其預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用可能是通過刺激降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)的釋放誘導(dǎo)產(chǎn)生的[5-6]。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白細(xì)胞介素-6等細(xì)胞因子已確認(rèn)參與介導(dǎo)缺血再灌注中的組織損傷。其中，TNF-α是缺血再灌注損傷中細(xì)胞因子連續(xù)反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵性介質(zhì)[7]。已有研究證明TNF-α在心臟、小腸缺血再灌注時(shí)均明顯升高，使用TNF-α單克隆抗體后能明顯減輕再灌注引起的器官損傷，改善組織器官功能，減輕機(jī)體的全身性損害，而CGRP含量升高則可明顯減輕再灌注損傷，CGRP抗體使用后可逆轉(zhuǎn)這一保護(hù)作用[8-9]。但TNF-α與CGRP在預(yù)適應(yīng)中的地位和作用尚不十分清楚，本實(shí)驗(yàn)采用MLA預(yù)適應(yīng)給藥，利用大鼠小腸缺血再灌注模型，初步探討TNF-α與CGRP在MLA預(yù)適應(yīng)中的作用及意義。

材 料 和 方 法

1試劑

MLA購自Sigma；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；CGRP和TNF-α放免試劑盒由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)放免所提供；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1動(dòng)物模型制備 健康Wistar雄性大鼠，體重(260±30) g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2.1.1在體動(dòng)物缺血再灌注模型制備 大鼠術(shù)前24 h禁食，自由飲水。以20%烏拉坦1 g·kg-1腹腔注射麻醉，舌靜脈注射肝素600 U·kg-1抗凝血。分離頸總動(dòng)脈連接動(dòng)脈血壓計(jì)，記錄動(dòng)脈血壓以監(jiān)測動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)中的狀態(tài)。在動(dòng)物腹部實(shí)行中線切口，分離腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery，SMA)。術(shù)后穩(wěn)定20 min，用無創(chuàng)傷動(dòng)脈夾夾閉SMA 30 min，再灌注60 min，制成缺血再灌注模型。

2.1.2原位灌流模型制備 參照文獻(xiàn)[10]方法在動(dòng)物腹部實(shí)行中線切口，分離SMA及腸系膜上靜脈，由SMA主干插管，連蠕動(dòng)泵持續(xù)恒流(6 mL·min-1)灌注。灌注液為37 ℃，經(jīng)95% O2和5% CO2平衡的K-H改良液，腸系膜上靜脈插管導(dǎo)出液體。灌流開始后，腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物。所有暴露的組織均置于塑料泡沫板上，并用鹽水浸泡的紗布敷蓋。用熱照法使整個(gè)灌流過程的溫度維持在(37.0±0.5) ℃，預(yù)灌注30 min后，開始實(shí)驗(yàn)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組

2.2.1在體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組8只：(1)對照組(control)：僅分離SMA，不夾閉，觀察90 min；(2)缺血再灌注組(I/R)：分離SMA，夾閉30 min，再灌注60 min，結(jié)束實(shí)驗(yàn)；(3)MLA預(yù)適應(yīng)組(MLA)：實(shí)驗(yàn)前24 h給予MLA (500 μg·kg-1, ip)，其后操作同I/R組；(4)MLA溶劑組(MLA vehicle)：實(shí)驗(yàn)前24 h給予同體積MLA溶劑(40%丙二醇、10%乙醇及50%生理鹽水，ip)，其后操作同I/R組。

2.2.2原位灌流實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組，每組6～8只：(1)對照組(control)：持續(xù)灌流75 min，結(jié)束實(shí)驗(yàn)；(2)缺血再灌注組(I/R)：停灌1 h后再灌注15 min，結(jié)束實(shí)驗(yàn)；(3)MLA預(yù)適應(yīng)組(MLA)：實(shí)驗(yàn)前24 h給予MLA (500 μg·kg-1，ip)，余同I/R組；(4)MLA溶劑組(MLA vehicle)：實(shí)驗(yàn)前24 h給予同體積MLA溶劑，余同I/R組；(5)辣椒素(capsaicin)+MLA組：戊巴比妥鈉麻醉后，連續(xù)4 d注射capsaicin(50 mg·kg-1·d-1, sc)耗竭CGRP，余同MLA組；(6)CGRP8-37+MLA組：實(shí)驗(yàn)前24 h給予MLA (500 μg·kg-1, ip)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用濃度為10-7mol·L-1的CGRP8-37灌流5 min，隨后操作同I/R組。

2.3標(biāo)本采集及處理

2.3.1血清LDH活性的測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腹主動(dòng)脈取血4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清，按試劑盒方法測定。

2.3.2血漿CGRP測定 同上取血3 mL，加入備有10%乙二胺四乙酸鈉30 μL和400 U·L-1抑肽酶的試管中，4 000 r/min離心20 min(4 ℃)，取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按試劑盒方法測定。

2.3.3血漿TNF-α的測定 同上取血，加入備有10%乙二胺四乙酸鈉的試管中，3 000 r/min離心10 min(4 ℃)，取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按試劑盒方法測定。

2.3.4在體組織形態(tài)學(xué)分析 取回盲部以上10 cm的小腸組織，迅速置于中性甲醛液中固定，石蠟包埋，HE染色光鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變。按文獻(xiàn)分級方法[10]觀察小腸黏膜出血的病理損傷：0°：無出血；Ⅰ°：散在點(diǎn)狀出血；Ⅱ°：大段出血占1/4腸段(從十二指腸到回腸)；Ⅲ°：50%以上腸段出血；Ⅳ°：幾乎全部小腸段出血。

2.3.5小腸組織MDA含量測定 取回盲部以上10 cm處小腸組織，加其9倍體積生理鹽水，用電動(dòng)勻漿器制成10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清，按試劑盒方法測定。

2.3.6灌流液LDH活性、TNF-α和CGRP含量測定 收集再灌后5 min的灌流液，分別4 ℃和-20 ℃密封保存，按試劑盒方法測定。

2.3.7原位灌流組織形態(tài)學(xué)分析 同上取小腸組織，迅速置于中性甲醛液中固定，石蠟包埋，HE染色光鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變。參照文獻(xiàn)分級方法[10]，根據(jù)小腸組織損傷的程度，將其分為0～Ⅷ級：0級為正常的小腸黏膜；Ⅰ級病理損傷為絨毛端上皮下空間的增大；Ⅱ級為這種空間的進(jìn)一步擴(kuò)大；Ⅲ級則有大量的上皮在絨毛邊緣起伏；Ⅳ級有絨毛上皮的剝落；Ⅴ級有絨毛自身的脫落；Ⅵ級發(fā)展到小腸隱窩層的損傷；Ⅶ級為整個(gè)小腸黏膜的壞死；Ⅷ級則有穿透性的梗死。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，I/R可使小腸黏膜明顯損傷，LDH和MDA水平顯著升高，與對照組比較差異顯著(P<0.01)；MLA則可明顯改善小腸黏膜的I/R損傷，同時(shí)使LDH和MDA水平顯著降低(P<0.05)，見圖1及表1、2。

Figure 1. Representative example of small intestine mucosal hemorrhage frominvivoexperiment(HE staining,×200).A：control;B:I/R;C:MLA;D:MLA vehicle.

圖1MLA預(yù)處理對在體大鼠小腸病理改變的作用

表1單磷酰脂A預(yù)處理對缺血再灌注損傷大鼠小腸病理改變的保護(hù)作用

GroupHemorrhagicdegreeofmucosa0ⅠⅡⅢⅣMeangradeControl620000.25I/R002333.13**MLA043101.63#MLAvehicle001243.43**

**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsI/R.

I/R使大鼠血漿中TNF-α水平顯著升高，與對照組比較差異顯著(P<0.01)；MLA預(yù)適應(yīng)則使血漿中TNF-α含量降低，與I/R組相比有顯著差異(P<0.01)。血漿CGRP結(jié)果顯示，I/R使血漿CGRP水平顯著降低，MLA預(yù)適應(yīng)則使I/R損傷大鼠血漿CGRP顯著回升，與I/R組相比差異顯著(P<0.01),見表2。

2原位灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1灌注液中LDH活性和組織中MDA含量的變化 I/R使灌流液中LDH和組織中MDA與對照組相比顯著增加(P<0.01)；而MLA預(yù)適應(yīng)可顯著降低I/R引起的LDH、MDA增加，使灌流液中LDH和組織中MDA下降(P<0.01)。但給予CGRP8-37及capsaicin后，則逆轉(zhuǎn)MLA的上述作用，使LDH和MDA水平又重新回升，與I/R組比較無顯著差異(P>0.05),見表3。

表2單磷酰脂A預(yù)處理對缺血再灌注大鼠血清LDH活性、血漿CGRP和TNF-α含量及小腸MDA含量的影響

GroupnLDH(U·L-1)MDA(μmol·g-1protein)TNF-α(μg·L-1)CGRP(ng·L-1)Control8300.80±20.521.04±0.270.94±0.1656.60±5.44I/R81014.82±141.19**2.69±0.52**1.54±0.44**43.55±2.70*MLA8472.17±36.71##1.34±0.45##1.01±0.20##85.49±11.26**##MLAvehi-cle7862.35±30.61**3.15±0.86**1.47±0.37**40.29±6.30**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsI/R.

表3單磷酰脂A預(yù)處理對原位灌流大鼠小腸灌流液中LDH活性、CGRP和TNF-α含量及小腸組織中MDA含量的影響

GroupnLDH(U·L-1)MDA(μmol·g-1protein)TNF-α(μg·L-1)CGRP(ng·L-1)Control8435.86±91.181.60±0.870.36±0.12135.32±45.37I/R8871.71±187.12**4.28±1.35**1.12±0.12**73.68±27.50MLA8512.59±136.15##2.22±1.19#0.54±0.14#341.20±103.22*##CGRP8-37+MLA8729.41±283.84**4.20±2.58**1.17±0.20**175.73±44.51Capsaicin+MLA7866.11±214.99**4.15±1.20**1.12±0.21**44.67±10.14MLAvehicle8831.40±173.49**4.83±2.52**1.16±0.23**111.13±28.85

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05,##P<0.01vsI/R.

2.2小腸組織形態(tài)變化 I/R可以引起小腸黏膜的嚴(yán)重?fù)p傷，平均分級由對照組的0.25升至7.00(P<0.01)；MLA可顯著降低損傷程度，與I/R組比較差異顯著(P<0.05)；給予CGRP8-37及capsaicin則可逆轉(zhuǎn)MLA對大鼠小腸的保護(hù)作用，使損傷程度加重，與對照組比較差異顯著(P<0.05)，見圖2、表4。

2.3灌流液中的CGRP和TNF-α含量的改變 MLA可顯著刺激CGRP的釋放，與I/R組比較有顯著差異(P<0.01)。I/R使灌流液中TNF-α水平顯著升高(P<0.01vs對照組)，而MLA可使I/R損傷后灌流液中TNF-α降低，與I/R組相比差異顯著(P<0.05)。但給予CGRP8-37及capsaicin后，則逆轉(zhuǎn)MLA這一作用，灌流液中TNF-α水平又重新升高至I/R組水平，與對照組相比差異顯著(P<0.01),見表3。

討 論

近年發(fā)現(xiàn)CGRP對缺血心肌具有保護(hù)作用，但其機(jī)制目前還不清楚。在離體大鼠心臟和心臟外器官的缺血預(yù)適應(yīng)發(fā)現(xiàn)，CGRP是一種內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，可能是預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用中的共同介質(zhì)[11-12]， 研究表明，MLA介導(dǎo)的心臟預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)作用與CGRP的大量產(chǎn)生有關(guān)，而capsaicin可消除MLA的預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用[13]，說明CGRP參與介導(dǎo)MLA的心肌預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，實(shí)驗(yàn)前24 h給予大鼠MLA(500 μg·kg-1, ip)后，與I/R組比較，發(fā)現(xiàn)MLA可以明顯地降低LDH、MDA的釋放，顯著抑制I/R引起的小腸黏膜損傷，減輕小腸水腫。給予10-7mol·L-1CGRP受體阻斷劑CGRP8-37，及CGRP耗竭劑capsaicin(50 mg·kg-1, sc)后，則可顯著扭轉(zhuǎn)MLA的保護(hù)作用。證明MLA可誘導(dǎo)大鼠小腸產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)作用，CGRP參與并介導(dǎo)了這一過程。

TNF是一種具有廣泛生物活性的多功能細(xì)胞因子，主要由被激活的巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞產(chǎn)生，具有防御和致?lián)p傷的雙重作用。在體內(nèi)適量產(chǎn)生TNF，對機(jī)體具有重要的免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)作用；隨著TNF在體內(nèi)濃度的持續(xù)增加，則參與機(jī)體的多種病理改變，甚至造成多器官損傷[14]。缺血再灌注導(dǎo)致TNF-α含量的大量增加，且對抗缺血再灌損傷的缺血預(yù)適應(yīng)與抑制或阻斷TNF-α產(chǎn)生有關(guān)[8]，提示TNF-α可能是缺血預(yù)適應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)刺激因子。研究表明缺血預(yù)適應(yīng)和CGRP預(yù)適應(yīng)均可抑制TNF-α的產(chǎn)生，而CGRP8-37和capsaicin可以消除缺血預(yù)適應(yīng)或CGRP預(yù)適應(yīng)對TNF-α的抑制作用[8]，表明CGRP介導(dǎo)的預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用可能同抑制TNF-α的產(chǎn)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)，MLA預(yù)適應(yīng)可以抑制伴隨缺血再灌損傷產(chǎn)生的TNF-α的增加；CGRP8-37或capsaicin可消除MLA預(yù)適應(yīng)對TNF-α的抑制作用。有研究證明TNF-α在缺血再灌注損傷中還可誘導(dǎo)激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)，使NO合成增加[15]，而NO已經(jīng)被證明為心肌早期缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用的誘發(fā)物質(zhì)之一。MLA可通過增加NO的釋放和合成刺激CGRP的釋放從而產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)的延遲保護(hù)作用，而給予CGRP8-37或用capsaicin耗竭CGRP后，其保護(hù)作用消失[5]。CGRP促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的作用與其增加內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平可能有密切關(guān)系。NOS為鈣依賴性激酶，CGRP升高細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+，在鈣調(diào)素的輔助作用下激活細(xì)胞內(nèi)NOS，促使大量L-精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镹O，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[16]。由此，我們或可推測MLA對大鼠小腸預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用的產(chǎn)生原因可能是：(1)MLA誘導(dǎo)CGRP生成增加，同時(shí)TNF-α作為缺血再灌注損傷的誘導(dǎo)因子，使NO合成增加，進(jìn)而刺激CGRP的產(chǎn)生，并伴同CGRP介導(dǎo)預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用；(2)CGRP產(chǎn)生后一方面抑制TNF-α的繼續(xù)增加，阻止其對機(jī)體組織器官的致?lián)p傷作用，另一方面進(jìn)一步促進(jìn)CGRP的增加，而產(chǎn)生對大鼠小腸的預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用。有關(guān)CGRP通過抑制TNF-α產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用的機(jī)理目前還不清楚，上述假設(shè)還需進(jìn)一步驗(yàn)證才可證實(shí)。

Figure 2. Repersentative examples of small intestine mucosal injury frominvitroexperiment(HE staining,×100).A:control;B:I/R;C:MLA;D:MLA vehicle;E:capsaicin+MLA;F:CGRP8-37+MLA.

圖2MLA預(yù)處理對大鼠原位灌流小腸病理改變的作用

表4 單磷酰脂A預(yù)處理對原位灌流大鼠小腸病理改變的保護(hù)作用

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsI/R.

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Calcitoningene-relatedpeptidemediatesdelayedpreconditioningofmonophosphoryllipidAbydecreasingtumornecrosisfactorαinratsmallintestine

YANG Cai-hong1, ZHANG Xuan-ping1, LIANG Yue-qin2, LI Yan2, HAO Yi-bin1

(1DepartmentofPharmacology,2FunctionalLaboratory,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:tyyangxiaoluo@163.com)

AIM: To explore whether monophosphoryl lipid A participates in the protective process of the delayed ischemic preconditioning in the small intestine of rats, and whether endogenous calcitonin gene-related peptide and tumor necrosis factor α are mediators in this process.METHODSIntestinal ischemia was induced by occlusion of super mesenteric artery for 30 min, followed by reperfusion for 60 min. The ischemia/reperfusion(I/R) injury was made by 1 h ischemia and 15 min reperfusioninsituperfusion in rat small intestine. The intestine lesions were evaluated by the measurement of serum lactate dehydrogenase and malondialdehyde in the small intestinal tissues. In addition, calcitonin gene-related peptide and tumor necrosis factor α in plasma and superior mesenteric vein effluent were also examined.RESULTSPretreatment with monophosphoryl lipid A (500 μg/kg, ip) 24 h prior to I/R significantly alleviated the histolo-gical lesions of intestinal tissues, decreased serum level of lactate dehydrogenase and reduced the tissue content of malondialdehyde. Moreover, monophosphoryl lipid A markedly increased plasma concentrations of calcitonin gene-related peptide and decreased plasma concentrations of tumor necrosis factor α. Pretreatment with capasicin, which specifically depletes the neurotransmitter content of sensory nerves, or calcitonin gene-related peptide (8-37), a selective calcitonin gene-related peptide receptor antagonist, inhibited the increase in calcitonin gene-related peptide release and subsequently abrogated the protective effect of monophosphoryl lipid A.CONCLUSIONMonophosphoryl lipid A pharmacologically mimics delayed preconditioning, which may be related to the stimulation of calcitonin gene-related peptide release and inhibition of tumor necrosis factor α production in rat small intestine.

Monophosphoryl lipid A; Calcitonin gene-related peptide; Tumor necrosis factor

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.016