余良英, 李永渝, 李 琨， 馮佳燕， 林旭紅， 馮雅靜， 曹明華， 徐 菁

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，同濟(jì)大學(xué)消化系疾病研究所，上海 200092)

1000-4718(2012)04-0664-05

2011-12-02

2012-02-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30971168;No.81141050)

△通訊作者 Tel:021-65981021；E-mail:liyongyu@#edu.cn

熱休克蛋白在結(jié)腸炎和胰腺炎時(shí)的表達(dá)特點(diǎn)及大麻類物質(zhì)WIN和O-1602的影響*

余良英, 李永渝△, 李 琨， 馮佳燕， 林旭紅， 馮雅靜， 曹明華， 徐 菁

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，同濟(jì)大學(xué)消化系疾病研究所，上海 200092)

目的觀察幾種熱休克蛋白(heat-shock proteins, HSPs)在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎和實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎炎癥組織中表達(dá)的變化，同時(shí)研究大麻經(jīng)典受體1和受體2激動(dòng)劑WIN55和212-2(WIN)，以及新型受體GPR55激動(dòng)劑O-1602對(duì)HSPs表達(dá)的影響及可能的意義。方法用C57/BL小鼠，通過(guò)連續(xù)飲用7 d 4%葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)復(fù)制結(jié)腸炎模型；通過(guò)腹腔注射雨蛙肽(cerulein，50 μg/kg，每小時(shí)1次，連續(xù) 6次)復(fù)制急性胰腺炎模型。同時(shí)設(shè)各模型組及WIN、O-1602治療組，檢測(cè)不同處理組小鼠結(jié)腸和胰腺組織形態(tài)學(xué)改變、血漿促炎細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-6(IL-6)及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞化學(xué)趨化因子-1(cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1) 的水平和淀粉酶活性，同時(shí)用免疫組化方法檢測(cè)結(jié)腸和胰腺組織HSPs(HSP27、HSP60、和HSP70)的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎及 cerulein 誘導(dǎo)的小鼠胰腺炎模型，其結(jié)腸和胰腺組織分別出現(xiàn)典型的炎癥及損傷，血漿促炎因子水平升高(P<0.05)，在胰腺炎小鼠還有血漿胰淀粉酶活性的升高。在結(jié)腸炎癥組織，HSP27表達(dá)明顯升高，HSP60和HSP70表達(dá)降低；WIN具有一定的抗炎作用，并能顯著提高結(jié)腸炎結(jié)腸組織HSP27和HSP70的表達(dá)(P<0.05)。在急性胰腺炎的胰腺組織，HSP27和HSP70表達(dá)升高，HSP60表達(dá)有所降低； O-1602有一定的抗炎作用，也能提高HSP70的表達(dá)，但總體來(lái)看，對(duì)這3種HSPs的影響均不太明顯(P>0.05)。結(jié)論DSS和cerulein分別誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎和急性胰腺炎的發(fā)生；在這2種模型的炎癥組織中HSPs的表達(dá)變化不一。大麻類物質(zhì)WIN和O-1602均有一定的抗炎作用，也在一定程度上提高部分HSPs的表達(dá)。HSPs的高表達(dá)是否與大麻類物質(zhì)的抗炎作用有關(guān)值得進(jìn)一步的研究。

熱休克蛋白質(zhì)類； 急性胰腺炎； 結(jié)腸炎； 大麻酚類

熱休克蛋白(heat-shock proteins, HSPs)是一類熱應(yīng)激蛋白，根據(jù)分子量的大小分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子HSP[1]。這些蛋白分子存在于幾乎所有的細(xì)胞器內(nèi)，包括胞漿、胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[2]。熱休克蛋白合成是應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞生存的一種保護(hù)機(jī)制,除了高熱等生理刺激外，各種病理狀態(tài)如組織損傷、炎癥、感染等也能誘導(dǎo)熱休克蛋白的合成[3]。研究顯示，熱休克蛋白與結(jié)腸炎、胰腺炎等炎癥性疾病的關(guān)系密切[4-5]，雖然對(duì)其作用還存在爭(zhēng)議，然而大多數(shù)結(jié)果認(rèn)為HSPs的高表達(dá)可抵抗損傷刺激[6]。大麻類物質(zhì)具有抗炎作用，它們對(duì)HSPs的表達(dá)是否具有影響目前尚不得知。本研究主要探討在不同消化系統(tǒng)炎癥疾病(小鼠結(jié)腸炎和小鼠急性胰腺炎模型)中HSPs的表達(dá)特點(diǎn)，并探討新型大麻類物質(zhì)WIN55、212-2(WIN)(大麻經(jīng)典受體1和受體2的激動(dòng)劑)以及O-1602(新型大麻受體GPR55的激動(dòng)劑)的抗炎作用及可能的機(jī)制，探討它們的作用是否與影響HSPs的表達(dá)有關(guān)。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物及分組

結(jié)腸炎造模及取材：體重18～22 g的成年C57/BL小鼠24只，雌雄各半，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水16 h后隨機(jī)均分為3大組，即正常對(duì)照(control)組、葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)組、 DSS+WIN組。結(jié)腸炎模型根據(jù)Schicho等[7]介紹的方法復(fù)制，即用4%的DSS替代飲水連續(xù)喂動(dòng)物7 d，DSS+WIN治療組在飲用DSS 7 d的過(guò)程中每天接受1次WIN腹腔注射(5 mg/kg)，對(duì)照組和DSS組接受等容量的生理鹽水腹腔注射(10 mL/kg)。7 d后七氟醚吸入麻醉小鼠，斷頭取血，1%肝素抗凝處理，收集血漿標(biāo)本-80 ℃保存，同時(shí)分離取出結(jié)腸組織，迅速置于4%多聚甲醛，用于相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

胰腺炎造模及取材：用體重18～22 g的成年C57/BL小鼠24只，雌雄各半(來(lái)源同上)，隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照(control)組、急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)組、 AP+O-1602組。參照Ding等[8]的方法復(fù)制AP模型，即小鼠腹腔注射雨蛙肽(cerulein, 50 μg/kg，每小時(shí)1次，共6次)。對(duì)照組用生理鹽水代替雨蛙肽處理； AP+O-1602組在AP造模前0.5 h及造模過(guò)程5 h給O-1602腹腔注射(10 mg/kg)，對(duì)照組和AP組接受等容量的生理鹽水腹腔注射(10 mL/kg體重)。最后一次注射后3 h七氟醚吸入麻醉斷頭處死動(dòng)物，同上取血液及胰腺組織標(biāo)本待用。

2主要藥品和試劑

DSS和雨蛙肽(Sigma)，WIN55和212-2 (Tocris Bio)，O-1602(Biotrend GmbH)，鼠抗小鼠HSP27、HSP60和HSP70單克隆抗體(Stressgen)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG Ⅱ抗試劑盒(ZYMED)，血漿淀粉酶檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞化學(xué)趨化因子-1(cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1)ELISA試劑盒(R&D)。

3各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)

3.1組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 將置于4%多聚甲醛中的組織進(jìn)行石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色。光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理改變。

3.2血漿指標(biāo)檢測(cè) 血漿淀粉酶活性按相關(guān)生化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)，血漿IL-6以及CINC-1水平按相關(guān)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè),按ng/L表示其濃度。

3.3結(jié)腸和胰腺組織中HSPs的表達(dá) HSP27、HSP60和HSP70的表達(dá)用免疫組化法，即組織石蠟切片脫蠟水化，經(jīng)微波加熱修復(fù)抗原；山羊血清封閉非特異抗原后，分別加入抗HSP27、HSP60或HSP 70 Ⅰ抗(1∶200)， 4 ℃孵育過(guò)夜；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，37 ℃孵育15 min，DAB顯色。PBS代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照。用Motic Med 6.0圖像分析系統(tǒng)觀測(cè)并采集圖片，并采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)其平均光密度進(jìn)行半定量分析。對(duì)照組數(shù)據(jù)作為100%，其余組的數(shù)據(jù)表示為對(duì)照組的百分比(% of control), 以比較各組間的變化。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1組織病理改變

1.1結(jié)腸組織 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，結(jié)腸組織呈現(xiàn)黏膜壞死、脫落，累及固有層和黏膜下肌層，黏膜下水腫明顯，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1B。在DSS+WIN治療組，結(jié)腸組織粘膜壞死、脫落，黏膜下水腫及炎癥程度減輕，雖然仍可見(jiàn)組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但程度減輕，見(jiàn)圖1C。

Figure 1. Effect of WIN on the morphology of colonic tissues in mice with DSS-induced colitis(HE staining,×100). A: control; B: DSS; C:DSS +WIN.

圖1結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)的改變及WIN的影響

1.2胰腺組織 如圖2所示，AP組胰腺組織呈現(xiàn)水腫及炎癥表現(xiàn)，包括胰腺細(xì)胞腫脹，有空泡形成，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張、充血等。在AP+O-1602組，胰腺水腫及炎癥程度減輕，間隙輕度增寬。

Figure 2. Effect of O-1602 on the morphology of pancreatic tissues in mice with cerulein-induced acute pancreatitis (AP) (HE staining,×100). A: control; B: AP; C： AP+O-1602.

圖2急性胰腺炎小鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的變化及O-1602的影響

2血漿生化指標(biāo)的變化

2.1結(jié)腸炎小鼠血漿 IL-6和CINC-1水平的改變 與正常對(duì)照組比較，結(jié)腸炎小鼠血漿 IL-6和CINC-1水平均顯著升高(P<0.01), WIN可一定程度降低結(jié)腸炎小鼠血漿IL-6(P<0.05)和CINC-1(P>0.05)的水平，見(jiàn)圖3。

2.2AP小鼠血漿淀粉酶活性及IL-6水平的改變 AP小鼠血漿淀粉酶活性明顯升高，為對(duì)照組的4倍左右(P<0.05)，IL-6水平也較對(duì)照組增高1.5倍(P<0.05)；O-1602處理可一定程度降低雨蛙肽誘導(dǎo)的AP血漿淀粉酶活性及 IL-6水平的增高，降低程度分別為25%(淀粉酶)和30%(IL-6)(P<0.05)。

3結(jié)腸及胰腺炎癥組織中HSPs表達(dá)的變化

3.1結(jié)腸組織HSPs表達(dá)的變化 在正常小鼠結(jié)腸組織，HSP27、HSP60和HSP70均表達(dá)于結(jié)腸黏膜層腺細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色染色。半定量分析表明，與正常小鼠比較，結(jié)腸炎時(shí)小鼠結(jié)腸組織HSP27表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而HSP60和HSP70表達(dá)均有降低趨勢(shì)，且HSP70與對(duì)照組比有顯著差異(P<0.05)。WIN對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎組織中HSP27和HSP60的表達(dá)均無(wú)明顯影響，但顯著上調(diào)結(jié)腸組織HSP70的表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖3結(jié)腸炎小鼠血漿IL-6及CINC-1水平的改變及WIN的影響

圖4WIN對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織HSPs表達(dá)的影響

3.2胰腺組織HSPs表達(dá)的變化 在正常小鼠胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)，HSP27、HSP60和HSP70均有表達(dá)，主要在其胞漿內(nèi)，呈棕黃色。半定量分析顯示，與正常對(duì)照組比較，胰腺炎時(shí)胰腺組織HSP27和HSP70表達(dá)明顯升高 (P<0.05)，而HSP60無(wú)明顯改變。O-1602對(duì)cerulein誘導(dǎo)的小鼠胰腺炎組織中HSP27、HSP60和HSP70的表達(dá)均無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖5。

討 論

細(xì)胞內(nèi)的熱休克蛋白有充當(dāng)分子伴侶、抗凋亡、參與炎癥反應(yīng)等一系列的作用[4]。有研究報(bào)道，HSPs與腸道炎癥有密切的關(guān)系， HSPs的高表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸炎的發(fā)展，例如Rodolico等[6]發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病患者結(jié)腸黏膜HSP60的表達(dá)顯著升高。然而也有人認(rèn)為，作為細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)劑，HSPs可以使結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞免受刺激損傷，例如高熱誘導(dǎo)的HSP70高表達(dá)減輕2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸組織損傷和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，也能保護(hù)結(jié)腸黏膜免受乙酸誘導(dǎo)的黏膜損傷[9]。直腸內(nèi)給鋅衍生物誘導(dǎo)的HSPs高表達(dá)也能通過(guò)NF-κB失活而表現(xiàn)出對(duì)結(jié)腸黏膜的保護(hù)作用[9]。另外，短鏈脂肪酸、白細(xì)胞介素-11或LPS特異性誘導(dǎo)的HSP27高表達(dá)可保護(hù)結(jié)腸黏膜免受氧化應(yīng)激損傷[10-12]。因此結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展很可能與HSPs的功能紊亂或表達(dá)下降有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示結(jié)腸炎時(shí)結(jié)腸組織HSP60和HSP70的表達(dá)比對(duì)照組的明顯降低，而HSP27的表達(dá)有顯著升高。

圖5O-1602對(duì)急性胰腺炎小鼠胰腺組織HSPs表達(dá)的影響

熱休克蛋白和急性胰腺炎也有密切的關(guān)系，高熱誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)能阻止胰腺內(nèi)的胰蛋白酶原激活，從而抵抗雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎[13]。有報(bào)道稱，先前用冷水浸漬法誘導(dǎo)HSP60的高表達(dá)通過(guò)阻止胰腺細(xì)胞中酶的異常積累和激活，可顯著改善雨蛙肽誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎的嚴(yán)重性[14]。最近我們課題組也發(fā)現(xiàn)，用RNA干擾技術(shù)抑制HSP60基因表達(dá)后，胰腺更易受到損傷因子的破壞[4]。這些結(jié)果表明熱休克蛋白的高表達(dá)能保護(hù)動(dòng)物模型免受或減輕急性胰腺炎誘導(dǎo)因子的損傷。我們先前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎時(shí)胰腺組織HSP60的表達(dá)(基因水平和蛋白水平)降低，尤其在重型胰腺炎時(shí)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)用雨蛙肽腹腔注射復(fù)制AP模型，從病理結(jié)果證實(shí)是水腫型，仍見(jiàn)到HSP60表達(dá)降低，然而HSP27和HSP70的表達(dá)比正常對(duì)照組明顯升高，表明AP時(shí)各種HSP表達(dá)的變化不一。

大麻素系統(tǒng)主要包括機(jī)體內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(ECS)和外源性大麻類物質(zhì)。ECS包括大麻素受體、該受體的內(nèi)源性配體以及相關(guān)的合成和降解酶類，它們?cè)谔弁?、炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)死亡以及各種胃腸功能的生理和病理過(guò)程中起有重要的調(diào)節(jié)作用[16]。大麻類物質(zhì)能作用于靶組織中特定受體發(fā)揮效用。目前已知的大麻受體主要有經(jīng)典的CB1、CB2受體和新型大麻受體GPR55。WIN與O-1602均是大麻受體激動(dòng)劑，前者主要通過(guò)CB1和CB2受體而發(fā)揮作用，O-1602能特異激活GPR55，對(duì)CB1和CB2受體無(wú)作用。大量的研究證實(shí)， WIN有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用。Berdyshev等[17]研究顯示W(wǎng)IN在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠支氣管炎模型中有抗炎作用。 Farquhar-Smith等[18]的研究也證實(shí)了WIN在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子及抗炎方面的功效。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)O-1602可一定程度下調(diào)促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，控制AP的發(fā)生發(fā)展[14]。有趣的是，大麻素與HSPs之間也有密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 無(wú)論WIN或O-1602均可一定程度改善炎癥組織的病理變化，下調(diào)促炎細(xì)胞因子水平，提高組織HSPs的表達(dá)， 如WIN提高結(jié)腸組織HSP27和HSP70的表達(dá)，O-1602提高胰腺組織HSP70的表達(dá)。然而，大麻類物質(zhì)的抗炎作用是否與它們對(duì)HSPs的調(diào)節(jié)有關(guān)，其作用的環(huán)節(jié)及其機(jī)制如何，這些問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究闡明。

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EffectsofcannabinoidsWINandO-1602onexpressionofHSPsinmicewithcolitisoracutepancreatitis

YU Liang-ying, LI Yong-yu, LI Kun, FENG Jia-yan, LIN Xu-hong, FENG Ya-jing, CAO Ming-hua, XU Jing

(DepartmentofPathophysiology,InstituteofDigestiveDisease,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China.E-mail:liyongyu@#edu.cn)

AIM: To investigate the effects of cannabinoids WIN55, 212-2 (WIN) and O-1602 on the expression of heat-shock proteins (HSPs), such as HSP27, HSP60 and HSP70， in the inflammatory tissues of mice with experimental colitis or acute pancreatitis (AP).METHODSMouse colitis was induced by feeding the C57/BL with 4% dextran sulfate sodium (DSS) for 7 d, and AP was induced by intraperitoneal injection of ceruline in the mice (50 μg/kg hourly, with a total of 6 times). The mice were intraperitoneally administered with WIN or O-1602 for the therapeutic evaluation by observing the following parameters: pathological changes of the tissues, plasma activity of amylase, plasma levels of IL-6 and cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1 (CINC-1), and HSP expression in the colonic and pancreatic tissues.RESULTSCompared with normal control mice, the colonic tissues from colitis mice and the pancreatic tissues from AP mice appeared obvious signs of inflammation and injury. The plasma levels of IL-6 and CINC-1 significantly increased in colitis mice and AP mice. In DSS group of colitis mice, HSP27 expression increased, but HSP60 and HSP70 were reduced in the colonic tissues. WIN showed anti-inflammatory effects on the pathological changes of colonic tissues and the plasma cytokine levels. WIN also improved the expression of HSP70 (P<0.05). In AP group, the expression of HSP27 and HSP70 in pancreatic tissues increased, and HSP60 decreased. O-1602 also showed some anti-inflammatory effects on the changes of the pathological tissues and the plasma parameters, but had no obvious effects on the HSP expression (P>0.05).CONCLUSIONThe experimental colitis and acute pancreatitis in mice were induced by feeding DSS and injection of cerulein, respectively. The changes of HSP expression were different in the inflammatory tissues. WIN and O-1602 show anti-inflammatory effects and increase the expression of several HSPs to some extent.

Heat-shock proteins; Acute pancreatitis; Colitis; Cannabinoids

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.015