李 輝， 王一陽， 李紅梅， 王發(fā)強， 呂秀秀， 戚仁斌， 陸大祥， 王彥平, 王華東△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，2醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,國家中醫(yī)藥管理局病理生理三級科研實驗室, 廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)04-0655-09

2011-12-12

2012-02-24

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30670826;No.30971191)；教育部科學(xué)技術(shù)研究重點項目(No.207140)；廣東省科技計劃項目(No.2008B030301352， 粵科計字[2008]144 號)

△通訊作者 Tel:020-85220253;E-mail：owanghd@jnu.edu.cn

小檗堿和育亨賓對內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟TLR4信號通路中相關(guān)基因表達的影響*

李 輝1， 王一陽2， 李紅梅2， 王發(fā)強2， 呂秀秀2， 戚仁斌2， 陸大祥2， 王彥平2, 王華東2△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，2醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,國家中醫(yī)藥管理局病理生理三級科研實驗室, 廣東 廣州 510632)

目的觀察小檗堿和α2腎上腺素能受體拮抗劑育亨賓對內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟Toll樣受體4(TLR4)信號通路84種基因表達的影響，并初步探討其作用機制。方法雄性BALB/c小鼠隨機分為對照組、脂多糖(LPS)組、小檗堿+LPS組、小檗堿+育亨賓+LPS組、育亨賓+LPS組、小檗堿組、小檗堿+育亨賓組和育亨賓組。分別用蒸餾水、小檗堿(50 mg/kg)、小檗堿+育亨賓(50 mg/kg+2 mg/kg) 和育亨賓(2 mg/kg)灌胃，每天1次，連續(xù)3 d，第3 d灌胃1 h后，腹腔注射LPS(20 mg/kg)或生理鹽水。腹腔注射1 h后，用RT2ProfilerTMPCR Array分析技術(shù)檢測小鼠脾臟TLR4信號通路84種基因mRNA的表達；用Western blotting分析小鼠脾臟TLR4信號通路的抑制分子細胞因子信號抑制物(SOCS)1、SOCS3和白細胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK)-M蛋白的表達。結(jié)果LPS可上調(diào)小鼠脾臟TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)炎癥因子的mRNA表達，包括CXCL10、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IFN-β。小檗堿能顯著下調(diào)下調(diào)髓樣分化因子(MyD88)依賴信號通路下游TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達，也能MyD88非依賴信號通路下游基因IFN-β和CXCL10 mRNA的表達(P<0.05)。育亨賓能顯著下調(diào)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IL-1α、IL-1β 和IFN-β mRNA的表達(P<0.05)，但對TNF-α、IL-6和CXCL10 mRNA表達的下調(diào)作用與LPS組相比沒有顯著差異(P>0.05)。小檗堿與育亨賓合劑能顯著下調(diào)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IFN-β和CXCL10 mRNA的表達，但不能顯著下調(diào)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IL-1α、IL-1β、TNF-α 和IL-6 mRNA的表達。LPS攻擊后1 h，小檗堿和(或)育亨賓均不能增強內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟SOCS1、SOCS3和IRAK-M蛋白的表達。結(jié)論小檗堿和育亨賓均能抑制LPS誘導(dǎo)的MyD88依賴和非依賴信號通路下游部分基因的表達，這種抑制作用的機制與SOCS1、SOCS3和IRAK-M蛋白無關(guān)。

小檗堿； 育亨賓； 內(nèi)毒素血癥； Toll樣受體4； 小鼠

內(nèi)毒素或脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性細菌感染患者并發(fā)膿毒癥的重要致病因子，LPS誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)在膿毒癥的發(fā)生機制中發(fā)揮重要作用[1]。研究表明，缺乏LPS的突變細菌刺激機體巨噬細胞產(chǎn)生炎癥細胞因子的能力顯著降低[2]；嚴重膿毒癥患者血中LPS水平升高與休克的發(fā)生和預(yù)后不良密切相關(guān)[3]。顯然，深入研究LPS誘發(fā)炎癥反應(yīng)的分子機制及其干預(yù)措施對膿毒癥的治療具有重要臨床價值。

業(yè)已證明，Toll樣受體(Toll-like receptors， TLRs)是機體免疫系統(tǒng)中最重要的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)識別受體，LPS作為一種PAMP進入機體后激活TLR4, 通過細胞內(nèi)髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和非MyD88依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription, STAT)等轉(zhuǎn)錄因子，引起一系列炎癥介質(zhì)的釋放。如：腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin, IL)-1、IL-6、IL-12 p40、趨化因子C-X-C模序配體10(chemokine C-X-C motif ligand 10,CXCL10)、單核細胞誘導(dǎo)蛋白等。另一方面，機體內(nèi)還存在多種下調(diào)TLR4信號通路的調(diào)節(jié)途徑，包括細胞因子信號抑制物(suppressors of cytokine signaling，SOCS)、白細胞介素-1受體相關(guān)激酶 (IL-1 receptor-associated kinase，IRAK)-M等[4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿(berberine, Ber)能明顯降低內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率，明顯抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α及IL-1β的生成，而且α2腎上腺素能受體拮抗劑育亨賓 (yohimbine, Y)可以增強Ber的抗內(nèi)毒素血癥作用，Y與Ber聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高膿毒癥小鼠的生存率[5-6]。然而，Ber和Y對LPS活化TLR4信號通路的調(diào)節(jié)作用尚缺乏全面研究；Ber抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α及IL-1β的生成是否與SOCS-1、SOCS-3和IRAK-M有關(guān)，尚不清楚。因此，本研究利用RT2ProfilerTMPCR Array觀察Ber和Y對內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟TLR4信號通路中84種相關(guān)基因表達的影響，以及SOCS-1、SOCS-3和IRAK-M在這一過程中的作用，旨在進一步探討B(tài)er和Y調(diào)節(jié)內(nèi)毒素血癥小鼠炎癥反應(yīng)的分子機制。

材 料 和 方 法

1動物和實驗藥品

無特殊病原菌(specific pathogen free, SPF)雄性BALB/c小鼠，購自廣東省實驗動物中心(許可證號為 SCXK粵2008-0002)，周齡6～8周，體重23～25 g。分籠飼養(yǎng)，自由飲水進食，實驗前放置于實驗環(huán)境中適應(yīng)3 d，實驗環(huán)境溫度控制在(23±2)℃，相對濕度為50%～70%。小鼠的處置符合暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會的相關(guān)管理規(guī)定。

LPS(O55∶B5)購自Sigma，實驗時用生理鹽水配制成實驗所需濃度。中性硫酸、Ber和Y均購自Sigma，實驗時用蒸餾水配制成實驗所需濃度。

2RT2ProfilerTMPCRArray分析

2.1主要試劑 Trizol試劑購自Invitrogen；RT2ProfilerTMPCR Array Mouse Toll-Like Receptor Signaling Pathway (PAMM-018A)購自SuperArray Bioscience Corporation；氯仿(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，異丙醇(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，100%乙醇 (上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；RNeasy? MinEluteTM純化試劑盒(Qiagen)，TE(10 mmol/L)、Tris-HCl、EDTA、溴化乙啶(ethidium bromide，EB) 購自華美生物工程公司(中國洛陽)；乙酸鈉、甲醛(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；SuperScript? III Reverse Transcriptase購自Invitrogen。

2.2實驗分組 將小鼠隨機分為5組，每組3只：(1)對照組(control)：蒸餾水(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3 d，每天1次，第3 d蒸餾水灌胃后1 h，于腹腔注射0.9%生理鹽水(20 mL/kg)；(2)LPS組：蒸餾水(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3 d，每天1次，第3 d灌胃后1 h，腹腔注射20 mg/kg LPS (20 mL/kg)；(3)Ber+LPS組：Ber 50 mg/kg(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3 d，每天1次，第3 d Ber灌胃后1 h，腹腔注射20 mg/kg LPS (20 mL/kg)；(4)Ber+ Y +LPS組：2 mg/kg Y+50 mg/kg Ber(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3 d，每天1次，第3 d Ber和Y混合制劑灌胃后1 h，于腹腔注射20 mg/kg LPS (20 mL/kg)；(5)Y +LPS組：Y 2 mg/kg(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)灌胃3 d，每天1次，第3 d Y灌胃后1 h，于腹腔注射20 mg/kg 的LPS (20 mL/kg)。

2.3脾臟RNA抽提與實時熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)分析 LPS或生理鹽水注射1 h后，處死小鼠，迅速打開腹腔，取出50 mg脾臟組織，用冷生理鹽水浸洗，然后用濾紙吸干液體。將脾臟置于勻漿器中，以1mL Trizol在冰面上充分勻漿，-80 ℃保存。用小鼠Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路RT2ProfilerTMPCR芯片測定Toll樣受體信號通路84種基因mRNA的表達：首先進行RNA分離、純化后樣品于30 ℃孵育5 min，以便核酸蛋白復(fù)合體完全解離。利用紫外吸收測定法，使用NanoDrop? ND-1000測定RNA濃度和純度，所獲得的RNA溶液A260/A280比值范圍在1.8～2.1之間， 隨后進行變性瓊脂糖凝膠電泳；第二步取總RNA 1.5 μg反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；最后進行real-time PCR及數(shù)據(jù)分析：在5 mL管中加入2× SuperArray PCR Master Mix 1 275 μL， 稀釋的cDNA 102 μL， H2O 1 173 μL，充分混合。將25 μL混合液加入PCR Array對應(yīng)的每個孔中，隨后將 PCR Array置于實時定量PCR儀進行PCR反應(yīng)。設(shè)置的程序如下： 95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40個循環(huán)。采用ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)，計算每個處理組中的每個基因的ΔCt。ΔCt(group 1) = average Ct - average housekeeping gene Ct for group 1 array，ΔCt (group 2) = average Ct - average housekeeping gene Ct for group 2 array。計算兩組PCR Array中每個基因的ΔΔCt。ΔΔCt = ΔCt (group 2) - ΔCt (group 1)，group 1為對照，group 2為實驗組。通過2-ΔΔCt計算實驗組與對照組對應(yīng)基因的表達差異。

3Westernblotting分析

3.1試劑 細胞裂解液(RIPA)購自北京百泰克生物科技有限公司；SOCS1、SOCS3和IRAK-M多克隆抗體購自Cell Signaling Technology，3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；BCA法蛋白定量試劑盒購自上海申能博彩生物公司；脫脂奶粉、甘氨酸、β-巰基乙醇、吐溫20(Tween 20)、丙烯酰胺、過硫酸胺、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、四甲基乙二胺(tetramethylethylene-diamine, TEMED)以及考馬斯亮藍R-250均購自Sigma；ECL發(fā)光液購自Pierce；硝酸纖維素膜(millipore)購自廣州魯誠生物科技有限公司。

3.2實驗分組 將小鼠隨機分為8組，每組6只：(1)對照組(control)：蒸餾水(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3 d，每天1次，第3 d蒸餾水灌胃后1 h，于腹腔注射0.9%生理鹽水(20 mL/kg)；(2)LPS組(LPS)：蒸餾水(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3 d，每天1次，第3 d蒸餾水灌胃后1 h，于腹腔注射20 mg/kg LPS (20 mL/kg)；(3)Ber+LPS組：Ber 50 mg/kg(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3 d，每天1次，第3 d Ber灌胃后1 h，于腹腔注射20 mg/kg LPS (20 mL/kg)；(4)Ber+ Y +LPS組：2 mg/kg Y+5 0 mg/kg Ber(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3d，每天1次，第3d混合制劑灌胃后1 h，于腹腔注射20 mg/kg LPS (20 mL/kg)；(5)Y +LPS組：2 mg/kg Y (10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3 d，每天1次，第3 d Y灌胃后1 h，于腹腔注射20 mg/kg LPS (20 mL/kg)；(6)Ber組：Ber 50 mg/kg(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3 d，每天1次，第3 d Ber灌胃后1 h，于腹腔注射生理鹽水(20 mL/kg)；(7)Ber+Y組：2 mg/kg Y+50 mg /kg Ber(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3 d，每天1次，第3 d混合制劑灌胃后1 h，于腹腔注射生理鹽水20 mL/kg；(8)Y組：Y 2 mg/kg(10 mL/kg)灌胃，連續(xù)3 d，每天1次，第3 d Y灌胃后1 h，于腹腔注射20 mL/kg生理鹽水。

3.3Western blotting分析脾臟SOCS1、SOCS3和IRAK-M蛋白的含量 LPS或生理鹽水注射后1 h，處死小鼠，迅速打開腹腔，取出脾臟，用冷生理鹽水浸洗，然后用濾紙吸干液體。將脾臟置于勻漿器中，以1 mL細胞裂解液(RIPA)在冰面上充分勻漿，所得勻漿液13 000 ×g離心5 min，收集上清分裝，BCA法測定蛋白濃度。按每個泳道孔加入80 μg蛋白樣品進行12%丙烯酰胺SDS-PAGE蛋白垂直電泳，Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印儀15 V恒壓轉(zhuǎn)印15 min至硝酸纖維素膜上。TBST配制的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，加1∶1 000稀釋的 Ⅰ 抗溶液，4 ℃過夜。TBST洗膜，加1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶標記 Ⅱ 抗溶液，室溫孵育1 h。以GAPDH為內(nèi)參照，加ECL發(fā)光劑，暗室中曝光X光片。用掃描儀掃描Western blotting 圖像，并用BI2000圖像分析系統(tǒng)分析各蛋白條帶的積分吸光度值，以3種蛋白與GAPDH積分吸光度的比值表示SOCS1、SOCS3和IRAK-M蛋白的相對水平。

4統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1小檗堿和育亨賓對內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟TLR4信號通路84種基因mRNA表達的影響

變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28S和18S RNA帶亮而濃，還有一條tRNA和5S核糖體RNA組成的條帶，見圖1。代表性擴增曲線見圖2。

Figure 1. Representative images of total RNA agarose gel electrophoresis. A: control; B1, B2, B3: LPS group; C1, C2, C3: Ber+LPS group; D1, D2, D3: Y+Ber+LPS group; E1, E2, E3: Y+LPS group.

圖1RNA變性瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure 2. The representative amplication curves of real-time PCR. A: control; B: LPS.

圖2代表性real-timePCR擴增曲線

通過數(shù)據(jù)分析證實LPS注射1 h可上調(diào)小鼠脾臟TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)炎癥細胞因子mRNA的表達，包括CXCL10、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IFN-β,見表1。Ber處理能顯著下調(diào)MyD88依賴信號通路下游TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達，也能下調(diào)MyD88非依賴信號通路下游基因IFN-β和CXCL10 mRNA的表達(P<0.05)。Y能顯著下調(diào)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IL-1α、IL-1β 和IFN-β mRNA的表達(P<0.05)，但對TNF-α、IL-6和CXCL10 mRNA的表達的下調(diào)作用與LPS組相比沒有顯著差異(P>0.05)。Ber+Y能顯著下調(diào)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IFN-β和 CXCL10 mRNA的表達，但不能顯著下調(diào)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IL-1α、IL-1β、TNF-α 和IL-6 mRNA的表達，見圖3 。

表1LPS注射1h后小鼠脾臟TLR信號通路相關(guān)基因mRNA的表達變化

GenBankAccessionSymbolDescriptionFoldchangeNM_011333Ccl2Chemokine(C-Cmotif)ligand2528.113±146.670*NM_009841Cd14CD14antigen18.857±4.533*NM_009855Cd80CD80antigen5.697±0.851*NM_019388Cd86CD86antigen2.300±0.366*NM_009883CebpbCCAAT/enhancerbindingprotein(C/EBP),beta9.840±1.329*NM_019948Clec4eC-typelectindomainfamily4,membere26.427±7.737*NM_009969Csf2Colonystimulatingfactor2(granulocyte-macrophage)25.690±1.773*NM_009971Csf3Colonystimulatingfactor3(granulocyte)229.033±40.745*NM_021274Cxcl10Chemokine(C-X-Cmotif)ligand1031.777±12.847*NM_010234FosFBJosteosarcomaoncogene45.807±7.771*NM_010479Hspa1aHeatshockprotein1A15.023±3.633*NM_010510Ifnb1Interferonbeta1,fibroblast1594.510±520.734*NM_008337IfngInterferongamma3.280±0.711*NM_010548Il10Interleukin1033.397±10.111*NM_010554Il1aInterleukin1α92.013±22.328*NM_008361Il1bInterleukin1β39.163±6.409*NM_008366Il2Interleukin24.163±1.285*NM_031168Il6Interleukin6514.013±112.025*NM_172161Irak2Interleukin-1receptor-associatedkinase22.157±0.267*NM_008390Irf1Interferonregulatoryfactor12.537±0.248*NM_010591JunJunoncogene10.123±1.507*NM_019408Nfkb2NuclearfactorofkappalightpolypeptidegeneenhancerinB-cells2,p49/p1003.507±0.497*NM_010907NfkbiaNuclearfactorofkappalightchaingeneenhancerinB-cellsinhibitor,alpha7.927±0.421*NM_010908NfkbibNuclearfactorofkappalightchaingeneenhancerinB-cellsinhibitor,beta7.063±0.818*NM_011198Ptgs2Prostaglandin-endoperoxidesynthase2837.193±189.594*NM_009044RelReticuloendotheliosisoncogene2.960±0.227*NM_009045RelaV-relreticuloendotheliosisviraloncogenehomologA(avian)2.117±0.087*NM_011905Tlr2Toll-likereceptor26.937±1.323*NM_021297Tlr4Toll-likereceptor41.423±0.636NM_013693TnfTumornecrosisfactor23.287±6.136*NM_009397Tnfaip3Tumornecrosisfactoralpha-inducedprotein311.787±1.835*

*P<0.05vscontrol (data not shown).

2Ber和Y對內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟SOCS1蛋白含量的影響

腹腔注射LPS 1 h后，小鼠脾臟SOCS1蛋白含量LPS組與對照組比較無顯著差異 (P>0.05)，Ber組、Ber+Y組以及Y組與LPS組比較亦無顯著差異(P>0.05)；Ber+Y組與Ber組比較無顯著差異；腹腔注射生理鹽水1 h后，小鼠脾臟SOCS1蛋白含量Ber組、Ber+Y組以及Y組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

3Ber和Y對內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟SOCS3蛋白含量的影響

腹腔注射LPS 1 h后，小鼠脾臟SOCS3蛋白含量的變化見圖5。LPS組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，Ber組、Ber+Y組以及Y組與LPS組比較無顯著差異(P>0.05)；Ber+Y組與Ber組和Y組比較無顯著差異(P>0.05)。

4Ber和Y對內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IRAK-M蛋白含量的影響

腹腔注射LPS后1h，小鼠脾臟IRAK-M蛋白含量變化見圖6。LPS組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，Ber組、Ber+Y組以及Y組與LPS組比較無顯著差異(P>0.05)。

圖3Ber和(或)Y對內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-β和CXCL10mRNA表達的影響

討 論

RT2ProfilerTMPCR Array分析技術(shù)是96孔模式芯片，含有基因特異性引物，是一簡單的、優(yōu)化的實時定量PCR體系，可同時研究大量的基因表達。該技術(shù)的特點是靈敏度高、引物特異性強，均一性好，擴增效率強[7]。因此，在本研究中， 我們采用RT2ProfilerTMPCR Array分析技術(shù)，觀察了腹腔注射內(nèi)毒素1 h后，Ber和/或Y對小鼠脾臟TLR4信號通路中84種基因mRNA表達的影響。結(jié)果表明，Ber預(yù)處理能顯著下調(diào)MyD88依賴信號通路下游TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達，也能下調(diào)MyD88非依賴信號通路下游基因IFN-β和IP-10 mRNA的表達；Y能顯著下調(diào)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IL-1α、IL-1β 和IFN-β mRNA的表達。這些結(jié)果說明，Ber和Y對LPS激活的MyD88依賴和MyD88非依賴信號通路下游的某些基因表達均有抑制作用。

先前的研究表明，Ber能抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化，從而抑制MyD88依賴信號通路相關(guān)基因的表達[8-11]。 Y阻斷α2腎上腺素能受體能顯著抑制內(nèi)毒素血癥小鼠血漿TNF-α水平的升高[12], 進一步研究發(fā)現(xiàn)，LPS攻擊機體時血中去甲腎上腺素(norepinephrine， NE)水平升高，NE增強LPS誘導(dǎo)的Kupffer細胞p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)的活化和TNF-α表達， 阻斷α2腎上腺素能受體能顯著抑制LPS引起的p38 MAPK)活化和TNF-α表達[13]。因此，這些資料表明，Ber和Y可以通過抑制MyD88依賴信號途徑抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-1β mRNA的表達。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，Ber和Y預(yù)處理均能抑制LPS誘導(dǎo)的IFN-β mRNA的表達，顯示Ber和Y對LPS激活的MyD88非依賴信號通路下游基因表達均有抑制作用，這一發(fā)現(xiàn)難以用目前所獲得的研究資料解釋。

圖4Ber和Y對正常小鼠和內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟SOCS1蛋白含量的影響

圖5內(nèi)毒素注射后1h，Ber和Y不影響內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟SOCS3蛋白的表達

圖6LPS注射后1h,Ber和Y對內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IRK-M蛋白含量的影響

業(yè)已證明， 一些抑制因子可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥細胞因子的基因表達，包括SOCS和IRAK-M等[14]。SOCS1是JAK-STAT通路的負反饋調(diào)控蛋白，LPS刺激可誘導(dǎo)MyD88非依賴的JAK-STAT通路活化，進而誘導(dǎo)SOCS1的表達。在LPS處理的巨噬細胞中，SOCS1的表達可抑制MyD88依賴信號通路中NF-κB 的活化和 MyD88非依賴信號通路中STAT1 的活化。SOCS1基因敲除小鼠不能對LPS產(chǎn)生耐受，對LPS的敏感性增加， LPS攻擊后血漿中TNF-α、IL-12和NO的水平明顯高于野生型小鼠，而且其死亡率也明顯高于野生型小鼠[15]。 SOCS3抑制MyD88非依賴信號通路中STAT-3的活化，是IL-6信號通路的一個重要負性調(diào)節(jié)因子，LPS可誘導(dǎo)巨噬細胞表達SOCS-3， 同時SOCS-3也能抑制NF-κB 信號通路，給予人工合成的膜滲透性SOCS3可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[16-17]。IRAK-M通過阻止IRAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB和MAPK的活化。缺乏IRAK-M小鼠對內(nèi)毒素的敏感性明顯增加，LPS誘導(dǎo)的細胞因子水平明顯高于野生型小鼠[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ber和Y對LPS激活的MyD88依賴和MyD88非依賴信號通路下游基因的表達均有抑制作用， 這種抑制作用是否與它們調(diào)節(jié)SOCS與IRAK-M的表達有關(guān)， 值得進一步研究。因此， 我們觀察了腹腔注射LPS 1h后，Ber和Y對LPS攻擊小鼠脾臟SOCS1、SOCS3、IRK-M蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ber、Ber與Y合劑以及Y預(yù)處理并不能提高SOCS1、SOCS3以及IRK-M蛋白的表達，這些結(jié)果表明Ber和/或Y并不是通過增強SOCS1 、SOCS3、IRK-M蛋白的表達來發(fā)揮對LPS激活的MyD88依賴和MyD88非依賴信號通路下游基因表達的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，Ber與Y合劑能顯著下調(diào)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IFN-β和 IP-10 mRNA的表達，但不能顯著下調(diào)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟IL-1α、IL-1β、TNF-α 和IL-6 mRNA的表達，并沒有顯示2種藥物對LPS誘導(dǎo)的細胞因子表達具有相加或協(xié)同作用。 這種現(xiàn)象的機制值得深入研究。研究表明Y不僅能阻斷α2腎上腺素能受體， 還能增強內(nèi)毒素血癥小鼠血漿NE的水平, 升高的 NE可刺激α1腎上腺素能受體，增強TLR4活化誘導(dǎo)的炎癥細胞因子的表達[18]。 因此， 聯(lián)合用藥對內(nèi)毒素血癥小鼠炎癥細胞因子表達的調(diào)節(jié)效應(yīng)是多種因素綜合作用的結(jié)果。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Ber或Y對內(nèi)毒素血癥小鼠TLR4信號通路中MyD88依賴和非依賴通路中多種基因的表達均具有抑制作用，但它們均不能提高內(nèi)毒素血癥小鼠TLR4信號通路抑制因子SOCS1 、SOCS3和IRK-M的表達， 提示Ber和/或Y發(fā)揮抗內(nèi)毒素血癥效應(yīng)的機制與SOCS1、SOCS3及IRAK-M蛋白無關(guān)。

[1] Opal SM. The host response to endotoxin, antilipopolysaccharide strategies, and the management of severe sepsis [J]. Int J Med Microbiol, 2007, 297(5):365-377.

[2] Pridmore AC, Wyllie DH, Abdillahi F, et al. A lipopolysaccharide-deficient mutant ofNeisseriameningitidiselicits attenuated cytokine release by human macrophages and signals via Toll-like receptor (TLR) 2 but not via TLR4/MD2[J]. J Infect Dis, 2001, 183(1):89-96.

[3] Marshall JC, Foster D, Vincent JL, et al. Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study[J]. J Infect Dis, 2004, 190(3):527-534.

[4] Lu YC, Yeh WC, Ohashi PS. LPS/TLR4 signal transduction pathway[J]. Cytokine, 2008, 42(2):145-151.

[5] Li F, Wang HD, Lu DX, et al. Neutral sulfate berberine modulates cytokine secretion and increases survival in endotoxemic mice[J]. Acta Pharmacol Sin, 2006, 27(9):1199-1205.

[6] Zhang HQ, Wang HD, Lu DX, et al. Berberine inhibits cytosolic phospholipase A2and protects against LPS-induced lung injury and lethality independent of the α2-adrenergic receptor in mice[J]. Shock, 2008, 29(5):617-622.

[7] Gaj S, Eijssen L, Mensink RP, et al. Validating nutrient-related gene expression changes from microarrays using RT2PCR-arrays [J]. Genes Nutr, 2008, 3(3-4):153-157.

[8] Li HM, Wang YY, Wang HD, et al. Berberine protects against lipopolysaccharide-induced intestinal injury in mice via α2adrenoceptor - independent mechanisms[J]. Acta Pharmacol Sin, 2011, 32(11):1364-1372.

[9] Gu L, Li N, Gong J, et al. Berberine ameliorates intestinal epithelial tight-junction damage and down-regulates myosin light chain kinase pathways in a mouse model of endotoxinemia[J]. J Infect Dis, 2011, 203(11):1602-1612.

[10]Wang YY, Li HM, Wang HD, et al. Pretreatment with berberine and yohimbine protects against LPS-induced myocardial dysfunction via inhibition of cardiac I-κBα phosphorylation and apoptosis in mice[J].Shock, 2011,35(3):322-328.

[11]Lee IA, Hyun YJ, Kim DH. Berberine ameliorates TNBS-induced colitis by inhibiting lipid peroxidation, enterobacterial growth and NF-κB activation[J]. Eur J Pharmacol, 2010, 648(1-3):162-170.

[12]Haskó G, Elenkov IJ, Kvetan V, et al. Differential effect of selective block of α2-adrenoreceptors on plasma levels of tumour necrosis factor-α, interleukin -6 and corticosterone induced by bacterial lipopolysaccharide in mice[J]. J Endocrinol, 1995, 144(3): 457-462.

[13]Miksa M, Das P, Zhou M, et al. Pivotal role of the alpha(2A)-adrenoceptor in producing inflammation and organ injury in a rat model of sepsis[J]. PLoS One, 2009, 4(5):e5504.

[14]Kobayashi K, Hernandez LD, Galán JE, et al. IRAK-M is a negative regulator of Toll-like receptor signaling[J]. Cell, 2002, 110(2):191-202.

[15]Nakagawa R, Naka T, Tsutsui H, et al. SOCS-1 participates in negative regulation of LPS responses[J]. Immunity, 2002, 17(5):677-687.

[16]Qin H, Roberts KL, Niyongere SA, et al. Molecular mechanism of lipopolysaccharide-induced SOCS-3 gene expression in macrophages and microglia[J]. J Immunol, 2007,179(9):5966-5976.

[17]Jo D, Liu D, Yao S, et al. Intracellular protein therapy with SOCS3 inhibits inflammation and apoptosis [J]. Nat Med, 2005,11(8):892-898.

[18]Grisanti LA, Woster AP, Dahlman J, et al. α1-Adrenergic receptors positively regulate Toll-like receptor cytokine production from human monocytes and macrophages[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2011, 338(2):648-657.

EffectofberberineandyohimbineonTLR4-dependentgeneexpressioninspleenofendotoxemicmice

LI Hui1, WANG Yi-yang2, LI Hong-mei2, WANG Fa-qiang2, Lü Xiu-xiu2, QI Ren-bin2, LU Da-xiang2, WANG Yan-ping2, WANG Hua-dong2

(1DepartmentofOtolaryngology,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:owanghd@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of berberine (Ber) and yohimbine (Y) on gene expression in Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling pathways in the spleen of endotoxemic mice.METHODSThe male BALB/c mice were randomly divided into the following groups: control,lipopolysaccharides (LPS), Ber+LPS, Y+Ber+LPS, Y+LPS, Ber, Y+Ber and Y alone. The mice were treated with water, Y (2 mg/kg) or/and Ber (50 mg/kg) intragastrically once a day for 3 days, and then injected intraperitoneally with normal saline or LPS (20 mg/kg) 1 h after intragastrical treatment on day 3. One hour after LPS challenge, the expression changes of 84 genes in TLR4 signaling pathways in the spleen of the mice were examined using RT2ProfilerTMPCR Array. Moreover, the protein expression of suppressor of cytokine signaling (SOCS)1, SOCS3 and IL-1 receptor-associated kinase (IRAK)-M in the spleen was examined using Western blotting.RESULTSLPS induced the expression of multiple downstream inflammatory mediators in myeloid differentiation factor 88 (MyD88)-dependent and independent signaling pathways, such as TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6,IFN-γ, IFN-β and CXCL10. Ber not only down-regulated LPS-induced mRNA expression of TNF-α, IL-1β, L-1β and IL-6, which were in the downstream of MyD88-dependent signaling pathway, but also reduced LPS-stimulated mRNA expression of IFN-β and CXCL10, which were in the downstream of MyD88-independent signaling pathway (P<0.05). Y markedly inhibited the mRNA expression of IL-1α,IL-1β and IFN-β in the spleen of endotoxemic mice (P<0.05), but did not affect the mRNA expression of TNF-α, IL-6 and CXCL10 (P>0.05). Combination of Ber with Y significantly reduced the mRNA expression of IFN-β and CXCL10 in the spleen of the mice challenged with LPS. One hour after LPS challenge, Ber or/and Y did not increase the protein expression of SOCS1, SOCS3 and IRAK-M in the spleen of the mice.CONCLUSIONPretreatment with Ber and Y down-regulates the expression of some genes in the downstream of MyD88-dependent and MyD88-independent signal pathways in the spleen of endotoxemic mice. The mechanism of these actions is not related with SOCS1, SOCS3 and IRAK-M at protein level.

Berberine; Yohimbine; Endotoxemia; Toll-like receptor 4; Mice

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.014