黎建軍， 陳詩萍， 古模發(fā)， 楊煒敏， 李永強(qiáng)， 王其京， 何 佳， 潘 科， 趙靖靖， 夏建川△

(華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)腫瘤防治中心 1生物治療中心，2放療科，廣東 廣州 510060；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510700)

1000-4718(2012)04-0638-05

2011-10-29

2012-02-17

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.9451008901002011)

△通訊作者 Tel：020-87343383;E-mail:xiajch@mail.sysu.edu.cn

NK細(xì)胞對不同人肝癌細(xì)胞株的殺傷作用*

黎建軍1， 陳詩萍1， 古模發(fā)2， 楊煒敏3， 李永強(qiáng)1， 王其京1， 何 佳1， 潘 科1， 趙靖靖1， 夏建川1△

(華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)腫瘤防治中心1生物治療中心，2放療科，廣東 廣州 510060；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510700)

目的觀察自然殺傷(NK)細(xì)胞對不同肝癌細(xì)胞株的體內(nèi)外抑瘤作用，并檢測肝癌細(xì)胞MHC-I類鏈相關(guān)蛋白(MIC蛋白)的表達(dá)。方法抽取志愿者外周血50 mL，分離單個(gè)核細(xì)胞，置入NK細(xì)胞試劑盒行孵化及逐級(jí)擴(kuò)增。計(jì)算NK細(xì)胞對人白血病細(xì)胞株K562及人肝癌細(xì)胞株BEL7402、HepG2、SMMC7721的殺傷率。接種建立人肝癌細(xì)胞株裸鼠移植瘤，進(jìn)行NK細(xì)胞瘤內(nèi)及瘤周注射；計(jì)算各組裸鼠移植瘤的體積，繪制各組腫瘤生長曲線；處死裸鼠，稱瘤重，計(jì)算NK細(xì)胞對各組腫瘤抑制率。檢測人肝癌細(xì)胞表面 MIC蛋白表達(dá)。結(jié)果NK細(xì)胞對K562細(xì)胞殺傷最強(qiáng)，BEL-7402次之，SMMC-7721細(xì)胞株殺傷敏感性最低。裸鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NK細(xì)胞對于BEL-7402細(xì)胞株的抑瘤效果最好，而對于SMMC-7721細(xì)胞株的抑瘤效果較差。BEL-7402及HepG2細(xì)胞株表面表達(dá)MIC，而SMMC-7721則很少表達(dá)。結(jié)論NK細(xì)胞對于不同人肝癌細(xì)胞株體內(nèi)外抑瘤作用不同，其差異可能和不同肝癌細(xì)胞株MIC的表達(dá)有關(guān)。

自然殺傷細(xì)胞； 肝腫瘤； MHC-I類鏈相關(guān)蛋白

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上常見且難以治療的腫瘤之一，初診時(shí)只有少數(shù)患者能進(jìn)行外科手術(shù)切除[1]。目前原發(fā)性肝癌的主要治療方法為外科手術(shù)切除、肝移植、經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞化療(transarterial chemobolization, TACE)以及局部消融治療[2-3]。然而，肝腫瘤行外科和局部治療后仍然不能解決其易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，故其生存率較低，預(yù)后仍然較差[4]。因此，探索新的替代或輔助治療方法以減少復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率、改善預(yù)后是令人感興趣的工作。

自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells, NK cells)是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,是機(jī)體抗御感染和惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的第一道防線。與T、B淋巴細(xì)胞不同,NK 細(xì)胞不表達(dá)T細(xì)胞受體(T-cell receptor,TCR)，也不表達(dá)B細(xì)胞受體(B-cell receptor,BCR)，其對自身正常細(xì)胞無殺傷作用，無需腫瘤特異性抗原識(shí)別便可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是腫瘤免疫治療的重要效應(yīng)細(xì)胞[5]。Wada等[6]通過肝癌術(shù)后病理切片檢測發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤是預(yù)后較好的標(biāo)志，表明肝癌組織中的免疫細(xì)胞可能具有抗腫瘤作用。肝臟NK細(xì)胞和肝癌等的發(fā)生、發(fā)展有明確的關(guān)系[7-8]。NK細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞(NKT細(xì)胞)在肝臟的免疫監(jiān)控中起著極其重要的作用。有證據(jù)顯示去除肝臟NK/NKT細(xì)胞，可使小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生率明顯升高，而增加肝臟NK/NKT細(xì)胞其轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生率明顯下降[9]。Taketomi等[10]研究顯示肝癌患者的NK細(xì)胞活性明顯下降，而且隨訪認(rèn)為術(shù)前檢測NK細(xì)胞活性的高低有助于預(yù)測肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)與否及其判斷預(yù)后。有研究表明，體外培養(yǎng)激活的NK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞有明顯的殺傷作用[11]。Harada等[12]于2002年發(fā)現(xiàn)經(jīng)X線處理后的Wilms瘤細(xì)胞株HFWT作為飼養(yǎng)細(xì)胞(feeder cells)，與提取的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)或臍血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可激活及大量擴(kuò)增NK細(xì)胞(58～401倍)。然而，NK細(xì)胞對不同腫瘤細(xì)胞殺傷效力不同,其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究,于是我們研究NK細(xì)胞對不同腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,并觀察腫瘤細(xì)胞株MT的表達(dá),以進(jìn)一步了解其相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1腫瘤細(xì)胞株及動(dòng)物

人肝癌細(xì)胞株HepG2、BEL-7402、SMMC-7721和人白血病細(xì)胞株K562由中山大學(xué)腫瘤防治中心實(shí)驗(yàn)研究部保存并傳代。實(shí)驗(yàn)用BALB/c-nu/nu裸鼠由廣州南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2方法

2.1PBMC的提取 抽取志愿者外周靜脈血50 mL，收集于肝素瓶中。用50 mL離心管離心全血，2 000 r/min離心8 min，收集自體血漿，56 ℃水浴滅活30 min，4 ℃冷水浴置15 min后，2 500 r/min離心8 min，取上清待用。將離心收集后的志愿者外周血細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸至60 mL，用玻璃毛細(xì)吸管將患者外周血均勻注入于離心管中的淋巴細(xì)胞分離液液面上層，每支離心管加30 mL外周血。高速低溫離心機(jī)離心，800×g離心15 min，20 ℃。使用負(fù)壓器吸掉離心后分離管中的血漿層大部分血漿，收獲分離所得的志愿者淋巴細(xì)胞層細(xì)胞于另一支50 mL離心管中。用適量含慶大霉素1.6×105U/L的注射用生理鹽水(500 mL生理鹽水+8×104慶大霉素)加滿到50 mL，混勻，1 800～2 000 r/min離心8 min，20 ℃，洗滌1次。棄上清液。

2.2NK細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增 將分離所得的志愿者淋巴細(xì)胞置于NK純化試劑盒(NK cell kit，F(xiàn)ukushima Life Sciences)中，置于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。第5 d，用顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，用培養(yǎng)液(IL-2 1×106U/L)將NK細(xì)胞傳代擴(kuò)瓶到2個(gè)75 cm2培養(yǎng)瓶中，50 mL/瓶，置于飽和濕度、37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)，平均每3 d擴(kuò)瓶1次。第14 d觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，并將細(xì)胞抽樣送檢，送檢驗(yàn)科行細(xì)菌、真菌檢測，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原。收集全部細(xì)胞于消毒好的250 mL離心杯中，2 500 r/min離心8 min。棄上清液，用0.9%注射用生理鹽水洗滌2次，2 000 r/min離心8 min；棄上清液，將細(xì)胞收集到約150 mL 0.9%注射用生理鹽水中,5 mL 20%人血白蛋白注入到細(xì)胞懸液中。

2.3NK細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)測定NK細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷活性，PBMC作為對照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)8個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3板。靶細(xì)胞(人白血病細(xì)胞株K562，人肝癌細(xì)胞株HepG2、BEL7402和SMMC7721)用10%牛血清RPMI-1640稀釋為1×108/L，加至96孔圓底培養(yǎng)板中，每孔100 μL，再按所定的效靶比例(分別設(shè)為30∶1、10∶1及3∶1)加入100 μL NK細(xì)胞。靶細(xì)胞最大釋放孔每孔加100 μL 2% NP40和100 μL靶細(xì)胞。每個(gè)效應(yīng)細(xì)胞均設(shè)自然釋放孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板移入CO2恒溫培養(yǎng)箱，在37 ℃、5%CO2濃度和飽和濕度的條件下培養(yǎng)。4 h后，500 r/min離心4 min，取上清50 μL，用多孔加樣槍轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中。在每個(gè)孔中加入50 μL substrate buffer，室溫避光作用30 min。每孔加入5 μL 終止液，在酶聯(lián)免疫檢測儀上，選擇492 nm為檢測波長，645 nm為參考波長，以培養(yǎng)液對照孔調(diào)零，測定各孔吸光度(A)。按下式計(jì)算CIK細(xì)胞殺傷活性。計(jì)算NK細(xì)胞對不同腫瘤細(xì)胞的殺傷率。NK細(xì)胞殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔A-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔A)/(最大釋放孔A-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔A)×100%。

2.4NK細(xì)胞體內(nèi)殺傷人肝癌細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.4.1人肝癌異位移植瘤動(dòng)物模型的建立 BALB/c-nu/nu裸鼠36只，鼠齡4～5周，體重18～23 g，雌雄各半。人肝癌細(xì)胞株Bel-7402、HepG2和SMMC-7721經(jīng)傳代培養(yǎng)后，以0.2 g/L EDTA和1.25 g/L胰蛋白酶聯(lián)合消化，收集細(xì)胞于無血清RPMI-1640液中；培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)，制成1×106/0.2 mL；接種至裸鼠右上肢背部皮下，約1～2周可見腫瘤形成。

2.4.2NK細(xì)胞抑瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 人肝癌細(xì)胞株BALB/c-nu/nu異位移植瘤裸鼠36只，鼠齡4～5周，分為3組，每組12只。每組再分為實(shí)驗(yàn)組(NK細(xì)胞注射組)和對照組(PBS空白對照組)，各6只裸鼠，亦為雌雄各半；實(shí)驗(yàn)組行NK細(xì)胞瘤內(nèi)注射[參考文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)，NK細(xì)胞數(shù)量約6×107/0.6 mL，腫瘤中央(2×107/0.2 mL)和腫瘤周圍(4×107/0.4 mL)同時(shí)注射]，5 d 1次，共3次;對照組裸鼠以PBS注射。NK細(xì)胞及PBS注射后，每隔3 d測量腫瘤長徑(a)及短徑(b)，依據(jù)公式V=π/6×[(a+b)/2]3計(jì)算瘤體積，繪制腫瘤生長曲線；同時(shí)測各裸鼠的體重，觀察其體重變化；3周后處死裸鼠，摘瘤并稱瘤重，計(jì)算NK細(xì)胞對各組腫瘤的抑制率[抑瘤率(%)=(對照組瘤重均值-實(shí)驗(yàn)組瘤重均值)/對照組瘤重均值×100%]。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測不同肝癌細(xì)胞株MIC-1類鏈相關(guān)蛋白(MHC class I chain-related protein,MIC蛋白)的表達(dá) 胰酶消化肝癌細(xì)胞，形成單細(xì)胞懸液，濃度為1×109/L。取100 μL細(xì)胞懸液，加入FITC-Anti-MICA/B流式抗體10 μL，同時(shí)做一管同型對照。室溫作用30 min。加入適量生理鹽水，離心洗滌細(xì)胞。采用0.5 mL的生理鹽水懸浮細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)測定MIC蛋白陽性細(xì)胞比例。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1NK細(xì)胞對K562及不同人肝癌細(xì)胞株的殺傷效應(yīng)

本研究殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示激活的NK細(xì)胞對人白血病細(xì)胞株K562及人肝癌細(xì)胞株BEL7402、HepG2、SMMC7721等均有明顯抑制作用，而且隨效靶比的增加，其殺傷率亦增加。同時(shí)NK細(xì)胞對各腫瘤細(xì)胞株作用不同，K562最強(qiáng)，其后依次為BEL7402和HepG2，SMMC7721作用最弱，見圖1。

圖1NK細(xì)胞對不同腫瘤細(xì)胞株殺傷作用不同，從強(qiáng)到弱依次為K562、BEL-7402、HepG2和SMMC-7721

2NK細(xì)胞對不同肝癌動(dòng)物移植瘤的抑制作用

本研究對BALB/c-nu/nu裸鼠接種不同人肝癌細(xì)胞株后，1～2周可見腫瘤形成，生長速度由快至慢依次為SMMC-7721、BEL-7402和HepG2,其生長曲線特別是注射15 d后，實(shí)驗(yàn)組移植瘤較對照組均可見明顯抑制，見圖2。NK細(xì)胞對各肝癌細(xì)胞株動(dòng)物移植瘤抑瘤率分別為46.5%(BEL-7402)、40.7%(HepG2)和36.0%(SMMC-7721)，見表1。

圖2不同人肝癌細(xì)胞株動(dòng)物移植瘤經(jīng)NK細(xì)胞注射后的生長曲線

表1NK細(xì)胞對接種不同肝癌細(xì)胞株裸鼠的抑瘤作用

*P<0.05vsNK group.

3不同肝癌細(xì)胞株表面MIC蛋白測定

流式細(xì)胞儀檢測示BEL-7402細(xì)胞MIC蛋白表達(dá)比例較高，達(dá)(46.8±8.6)%，中位數(shù)48.7%，n=6；HepG2細(xì)胞次之，(29.8±5.7)%，中位數(shù)32.8%，n=6；SMMC-7721細(xì)胞表達(dá)最少，(0.88±0.33)%，中位0.9%，n=6,見圖2。

Figure 3. The MIC expression in a variety of HCC cell lines (BEL-7402:48.7%; HepG2:32.8%; SMMC-7721:0.9%).

圖3不同肝癌細(xì)胞系MIC蛋白的表達(dá)

討 論

肝癌患者肝臟NK細(xì)胞數(shù)量下降，細(xì)胞毒性亦減弱，而且和切除后預(yù)后密切相關(guān)[5]。NK細(xì)胞在體內(nèi)外可以被IL-2、IL-12 、IL-15 和IFN-α、β激活[3]。龍?zhí)熘萚14]采用灌注法和消化法分離肝臟單個(gè)核細(xì)胞(liver mononuclear cells,LMNC),并應(yīng)用磁珠二次分選得到全肝NK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-2激活的NK細(xì)胞其形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)明顯不同并和細(xì)胞毒性相關(guān)。目前基于NK細(xì)胞的免疫治療主要是利用細(xì)胞因子體內(nèi)擴(kuò)增、激活NK 細(xì)胞。從早期的大劑量IL-2治療的嚴(yán)重毒副作用到隨后的長期小劑量聯(lián)合間斷中劑量IL-2治療證實(shí)在HIV 感染及惡性腫瘤患者中可以較好耐受。但這種治療方法只是增強(qiáng)骨髓祖細(xì)胞向NK細(xì)胞分化及依賴IL-2延遲NK細(xì)胞的凋亡，而并非外周血成熟NK細(xì)胞的增生[5]。因此聯(lián)合應(yīng)用IL-2和其它細(xì)胞因子(如IL-12、IL-15、IFN-α、-β、-γ) 可能達(dá)到更好的體內(nèi)和體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的效果[16]。

本研究采用包含經(jīng)X線處理的HFWT細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞，和提取的人PBMC進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，不僅培養(yǎng)周期短，培養(yǎng)效率高，而且對多種腫瘤包括肝癌細(xì)胞有明顯殺傷作用[17]。

本研究對人白血病細(xì)胞株K562[缺乏對NK細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)高度敏感的MHC-I類分子]，以及人癌細(xì)胞株BEL-7402、HepG2和SMMC-7721進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)并在上述肝癌細(xì)胞BALB/c-nu/nu動(dòng)物模型進(jìn)行抑瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示激活的NK細(xì)胞對不同的肝癌細(xì)胞株均有殺傷或抑瘤作用，但其作用有明顯差異，BEL7402最好，HepG2次之，SMMC7721最差。進(jìn)一步流式細(xì)胞測定腫瘤細(xì)胞表面MIC表達(dá)，顯示BEL-7402(48.7%)、 HepG2(32.8%)和SMMC-7721(0.9%)依次降低。因此，從初步結(jié)果看NK細(xì)胞殺傷肝癌的能力和肝癌細(xì)胞MIC呈正相關(guān)。然而，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，NK細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制非常復(fù)雜，MIC的表達(dá)可能僅是其中的一方面。

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ActivatedNKcellsagainsthumanhepatocellularcarcinomacelllinesinvitroandinvivo

LI Jian-jun1, CHEN Shi-ping1,GU Mo-fa2, YANG Wei-min3, LI Yong-qiang1, WANG Qi-jing1, HE Jia1, PAN Ke1, ZHAO Jing-jing1, XIA Jian-chuan1

(1BiotherapyCenter,2DepartmentofRadiationOncology,StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthChina,CancerCenter,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China;3DepartmentofObstetricsandGynaecology,HuangpuCampus,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China.E-mail:xiajch@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To evaluate the role of natural killer(NK) cells against a variety of human hepatocellular carcinoma (HCC) cell linesinvitroandinvivo, and to investigate the expression of MHC class I chain-related protein (MIC protein) in these HCC cell lines.METHODSPeripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from 50 mL peripheral blood donored by a healthy volunteer and cultured in the NK cell kit followed by amplification and cytokine activation. The release of lactate dehydrogenase (LDH) was detected by lysis experiment. Animal experiments were performed following vaccination with HCC cell lines (BEL7402, HepG2 and SMMC7721) in BALB/c-nu/nu mice. The diameters of the tumors were measured and the growth curves of difference cell lines were delineated. Three weeks later, these mice were sacrificed and the weight of the transplanted tumors was also detected. Furthermore, the expression of MIC protein was determined.RESULTSThe obvious differences of lysis effects of NK cells on different cell lines were observed, in which the lysis effect of NK cells on K562 cells was the strongest, the effect on BEL7402 cells was in the middle and the effect on SMMC7721 cells was the weakest. In animal experiments, NK cells also showed obvious and different restraining effects on a variety of HCC cell line-transplanted tumors in nude mice. The tumor inhibitory rates of NK cells were 43.5% in BEL-7402 cell-transplanted tumor, 40.7% in HepG2 cell-transplanted tumor and 36.0% in SMMC-7721 cell-transplanted tumor. The protein expression of MIC was 48.7%, 32.8% and 0.9% in the 3 cell lines,respectively.CONCLUSIONThe lysis effects of NK cells on a variety of human HCC cell lines are different. The expression of MIC in the tumor cells may play distinct role in evaluating these differences.

Natural killer cells; Liver neoplasms; MHC class I chain-related protein

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.011