黎建軍， 陳詩萍， 古模發(fā)， 楊煒敏， 李永強， 王其京， 何 佳， 潘 科， 趙靖靖， 夏建川△

(華南腫瘤學國家重點實驗室，中山大學腫瘤防治中心 1生物治療中心，2放療科，廣東 廣州 510060；3中山大學附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)婦產科，廣東 廣州 510700)

1000-4718(2012)04-0638-05

2011-10-29

2012-02-17

廣東省自然科學基金資助項目(No.9451008901002011)

△通訊作者 Tel：020-87343383;E-mail:xiajch@mail.sysu.edu.cn

NK細胞對不同人肝癌細胞株的殺傷作用*

黎建軍1， 陳詩萍1， 古模發(fā)2， 楊煒敏3， 李永強1， 王其京1， 何 佳1， 潘 科1， 趙靖靖1， 夏建川1△

(華南腫瘤學國家重點實驗室，中山大學腫瘤防治中心1生物治療中心，2放療科，廣東 廣州 510060；3中山大學附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)婦產科，廣東 廣州 510700)

目的觀察自然殺傷(NK)細胞對不同肝癌細胞株的體內外抑瘤作用，并檢測肝癌細胞MHC-I類鏈相關蛋白(MIC蛋白)的表達。方法抽取志愿者外周血50 mL，分離單個核細胞，置入NK細胞試劑盒行孵化及逐級擴增。計算NK細胞對人白血病細胞株K562及人肝癌細胞株BEL7402、HepG2、SMMC7721的殺傷率。接種建立人肝癌細胞株裸鼠移植瘤，進行NK細胞瘤內及瘤周注射；計算各組裸鼠移植瘤的體積，繪制各組腫瘤生長曲線；處死裸鼠，稱瘤重，計算NK細胞對各組腫瘤抑制率。檢測人肝癌細胞表面 MIC蛋白表達。結果NK細胞對K562細胞殺傷最強，BEL-7402次之，SMMC-7721細胞株殺傷敏感性最低。裸鼠抑瘤實驗結果顯示NK細胞對于BEL-7402細胞株的抑瘤效果最好，而對于SMMC-7721細胞株的抑瘤效果較差。BEL-7402及HepG2細胞株表面表達MIC，而SMMC-7721則很少表達。結論NK細胞對于不同人肝癌細胞株體內外抑瘤作用不同，其差異可能和不同肝癌細胞株MIC的表達有關。

自然殺傷細胞； 肝腫瘤； MHC-I類鏈相關蛋白

原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上常見且難以治療的腫瘤之一，初診時只有少數患者能進行外科手術切除[1]。目前原發(fā)性肝癌的主要治療方法為外科手術切除、肝移植、經肝動脈栓塞化療(transarterial chemobolization, TACE)以及局部消融治療[2-3]。然而，肝腫瘤行外科和局部治療后仍然不能解決其易復發(fā)、轉移的特點，故其生存率較低，預后仍然較差[4]。因此，探索新的替代或輔助治療方法以減少復發(fā)轉移率、改善預后是令人感興趣的工作。

自然殺傷細胞(natural killer cells, NK cells)是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,是機體抗御感染和惡性轉化細胞的第一道防線。與T、B淋巴細胞不同,NK 細胞不表達T細胞受體(T-cell receptor,TCR)，也不表達B細胞受體(B-cell receptor,BCR)，其對自身正常細胞無殺傷作用，無需腫瘤特異性抗原識別便可以直接殺傷腫瘤細胞，是腫瘤免疫治療的重要效應細胞[5]。Wada等[6]通過肝癌術后病理切片檢測發(fā)現淋巴細胞浸潤是預后較好的標志，表明肝癌組織中的免疫細胞可能具有抗腫瘤作用。肝臟NK細胞和肝癌等的發(fā)生、發(fā)展有明確的關系[7-8]。NK細胞和自然殺傷T細胞(NKT細胞)在肝臟的免疫監(jiān)控中起著極其重要的作用。有證據顯示去除肝臟NK/NKT細胞，可使小鼠肝轉移瘤的發(fā)生率明顯升高，而增加肝臟NK/NKT細胞其轉移瘤發(fā)生率明顯下降[9]。Taketomi等[10]研究顯示肝癌患者的NK細胞活性明顯下降，而且隨訪認為術前檢測NK細胞活性的高低有助于預測肝癌患者術后復發(fā)與否及其判斷預后。有研究表明，體外培養(yǎng)激活的NK細胞對肝癌細胞有明顯的殺傷作用[11]。Harada等[12]于2002年發(fā)現經X線處理后的Wilms瘤細胞株HFWT作為飼養(yǎng)細胞(feeder cells)，與提取的人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)或臍血單個核細胞進行培養(yǎng)，可激活及大量擴增NK細胞(58～401倍)。然而，NK細胞對不同腫瘤細胞殺傷效力不同,其機制尚需進一步研究,于是我們研究NK細胞對不同腫瘤細胞的殺傷作用,并觀察腫瘤細胞株MT的表達,以進一步了解其相關機制。

材 料 和 方 法

1腫瘤細胞株及動物

人肝癌細胞株HepG2、BEL-7402、SMMC-7721和人白血病細胞株K562由中山大學腫瘤防治中心實驗研究部保存并傳代。實驗用BALB/c-nu/nu裸鼠由廣州南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

2方法

2.1PBMC的提取 抽取志愿者外周靜脈血50 mL，收集于肝素瓶中。用50 mL離心管離心全血，2 000 r/min離心8 min，收集自體血漿，56 ℃水浴滅活30 min，4 ℃冷水浴置15 min后，2 500 r/min離心8 min，取上清待用。將離心收集后的志愿者外周血細胞用無血清培養(yǎng)基重懸至60 mL，用玻璃毛細吸管將患者外周血均勻注入于離心管中的淋巴細胞分離液液面上層，每支離心管加30 mL外周血。高速低溫離心機離心，800×g離心15 min，20 ℃。使用負壓器吸掉離心后分離管中的血漿層大部分血漿，收獲分離所得的志愿者淋巴細胞層細胞于另一支50 mL離心管中。用適量含慶大霉素1.6×105U/L的注射用生理鹽水(500 mL生理鹽水+8×104慶大霉素)加滿到50 mL，混勻，1 800～2 000 r/min離心8 min，20 ℃，洗滌1次。棄上清液。

2.2NK細胞的培養(yǎng)和擴增 將分離所得的志愿者淋巴細胞置于NK純化試劑盒(NK cell kit，Fukushima Life Sciences)中，置于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。第5 d，用顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，用培養(yǎng)液(IL-2 1×106U/L)將NK細胞傳代擴瓶到2個75 cm2培養(yǎng)瓶中，50 mL/瓶，置于飽和濕度、37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)，平均每3 d擴瓶1次。第14 d觀察細胞生長狀態(tài)，并將細胞抽樣送檢，送檢驗科行細菌、真菌檢測，流式細胞儀檢測細胞表面抗原。收集全部細胞于消毒好的250 mL離心杯中，2 500 r/min離心8 min。棄上清液，用0.9%注射用生理鹽水洗滌2次，2 000 r/min離心8 min；棄上清液，將細胞收集到約150 mL 0.9%注射用生理鹽水中,5 mL 20%人血白蛋白注入到細胞懸液中。

2.3NK細胞體外殺傷實驗 應用乳酸脫氫酶釋放實驗測定NK細胞的腫瘤細胞殺傷活性，PBMC作為對照。每個實驗設8個復孔，重復3板。靶細胞(人白血病細胞株K562，人肝癌細胞株HepG2、BEL7402和SMMC7721)用10%牛血清RPMI-1640稀釋為1×108/L，加至96孔圓底培養(yǎng)板中，每孔100 μL，再按所定的效靶比例(分別設為30∶1、10∶1及3∶1)加入100 μL NK細胞。靶細胞最大釋放孔每孔加100 μL 2% NP40和100 μL靶細胞。每個效應細胞均設自然釋放孔。將細胞培養(yǎng)板移入CO2恒溫培養(yǎng)箱，在37 ℃、5%CO2濃度和飽和濕度的條件下培養(yǎng)。4 h后，500 r/min離心4 min，取上清50 μL，用多孔加樣槍轉移至96孔培養(yǎng)板中。在每個孔中加入50 μL substrate buffer，室溫避光作用30 min。每孔加入5 μL 終止液，在酶聯免疫檢測儀上，選擇492 nm為檢測波長，645 nm為參考波長，以培養(yǎng)液對照孔調零，測定各孔吸光度(A)。按下式計算CIK細胞殺傷活性。計算NK細胞對不同腫瘤細胞的殺傷率。NK細胞殺傷率(%)=(實驗孔A-靶細胞自發(fā)釋放孔A-效應細胞自發(fā)釋放孔A)/(最大釋放孔A-靶細胞自發(fā)釋放孔A)×100%。

2.4NK細胞體內殺傷人肝癌細胞的動物實驗

2.4.1人肝癌異位移植瘤動物模型的建立 BALB/c-nu/nu裸鼠36只，鼠齡4～5周，體重18～23 g，雌雄各半。人肝癌細胞株Bel-7402、HepG2和SMMC-7721經傳代培養(yǎng)后，以0.2 g/L EDTA和1.25 g/L胰蛋白酶聯合消化，收集細胞于無血清RPMI-1640液中；培養(yǎng)至對數生長期時，制成1×106/0.2 mL；接種至裸鼠右上肢背部皮下，約1～2周可見腫瘤形成。

2.4.2NK細胞抑瘤動物實驗 人肝癌細胞株BALB/c-nu/nu異位移植瘤裸鼠36只，鼠齡4～5周，分為3組，每組12只。每組再分為實驗組(NK細胞注射組)和對照組(PBS空白對照組)，各6只裸鼠，亦為雌雄各半；實驗組行NK細胞瘤內注射[參考文獻及預實驗，NK細胞數量約6×107/0.6 mL，腫瘤中央(2×107/0.2 mL)和腫瘤周圍(4×107/0.4 mL)同時注射]，5 d 1次，共3次;對照組裸鼠以PBS注射。NK細胞及PBS注射后，每隔3 d測量腫瘤長徑(a)及短徑(b)，依據公式V=π/6×[(a+b)/2]3計算瘤體積，繪制腫瘤生長曲線；同時測各裸鼠的體重，觀察其體重變化；3周后處死裸鼠，摘瘤并稱瘤重，計算NK細胞對各組腫瘤的抑制率[抑瘤率(%)=(對照組瘤重均值-實驗組瘤重均值)/對照組瘤重均值×100%]。

2.5流式細胞術檢測不同肝癌細胞株MIC-1類鏈相關蛋白(MHC class I chain-related protein,MIC蛋白)的表達 胰酶消化肝癌細胞，形成單細胞懸液，濃度為1×109/L。取100 μL細胞懸液，加入FITC-Anti-MICA/B流式抗體10 μL，同時做一管同型對照。室溫作用30 min。加入適量生理鹽水，離心洗滌細胞。采用0.5 mL的生理鹽水懸浮細胞后，流式細胞術測定MIC蛋白陽性細胞比例。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1NK細胞對K562及不同人肝癌細胞株的殺傷效應

本研究殺傷實驗結果顯示激活的NK細胞對人白血病細胞株K562及人肝癌細胞株BEL7402、HepG2、SMMC7721等均有明顯抑制作用，而且隨效靶比的增加，其殺傷率亦增加。同時NK細胞對各腫瘤細胞株作用不同，K562最強，其后依次為BEL7402和HepG2，SMMC7721作用最弱，見圖1。

圖1NK細胞對不同腫瘤細胞株殺傷作用不同，從強到弱依次為K562、BEL-7402、HepG2和SMMC-7721

2NK細胞對不同肝癌動物移植瘤的抑制作用

本研究對BALB/c-nu/nu裸鼠接種不同人肝癌細胞株后，1～2周可見腫瘤形成，生長速度由快至慢依次為SMMC-7721、BEL-7402和HepG2,其生長曲線特別是注射15 d后，實驗組移植瘤較對照組均可見明顯抑制，見圖2。NK細胞對各肝癌細胞株動物移植瘤抑瘤率分別為46.5%(BEL-7402)、40.7%(HepG2)和36.0%(SMMC-7721)，見表1。

圖2不同人肝癌細胞株動物移植瘤經NK細胞注射后的生長曲線

表1NK細胞對接種不同肝癌細胞株裸鼠的抑瘤作用

*P<0.05vsNK group.

3不同肝癌細胞株表面MIC蛋白測定

流式細胞儀檢測示BEL-7402細胞MIC蛋白表達比例較高，達(46.8±8.6)%，中位數48.7%，n=6；HepG2細胞次之，(29.8±5.7)%，中位數32.8%，n=6；SMMC-7721細胞表達最少，(0.88±0.33)%，中位0.9%，n=6,見圖2。

Figure 3. The MIC expression in a variety of HCC cell lines (BEL-7402:48.7%; HepG2:32.8%; SMMC-7721:0.9%).

圖3不同肝癌細胞系MIC蛋白的表達

討 論

肝癌患者肝臟NK細胞數量下降，細胞毒性亦減弱，而且和切除后預后密切相關[5]。NK細胞在體內外可以被IL-2、IL-12 、IL-15 和IFN-α、β激活[3]。龍?zhí)熘萚14]采用灌注法和消化法分離肝臟單個核細胞(liver mononuclear cells,LMNC),并應用磁珠二次分選得到全肝NK細胞，發(fā)現經IL-2激活的NK細胞其形態(tài)、超微結構明顯不同并和細胞毒性相關。目前基于NK細胞的免疫治療主要是利用細胞因子體內擴增、激活NK 細胞。從早期的大劑量IL-2治療的嚴重毒副作用到隨后的長期小劑量聯合間斷中劑量IL-2治療證實在HIV 感染及惡性腫瘤患者中可以較好耐受。但這種治療方法只是增強骨髓祖細胞向NK細胞分化及依賴IL-2延遲NK細胞的凋亡，而并非外周血成熟NK細胞的增生[5]。因此聯合應用IL-2和其它細胞因子(如IL-12、IL-15、IFN-α、-β、-γ) 可能達到更好的體內和體外擴增NK細胞的效果[16]。

本研究采用包含經X線處理的HFWT細胞為飼養(yǎng)細胞，和提取的人PBMC進行聯合培養(yǎng)，不僅培養(yǎng)周期短，培養(yǎng)效率高，而且對多種腫瘤包括肝癌細胞有明顯殺傷作用[17]。

本研究對人白血病細胞株K562[缺乏對NK細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)高度敏感的MHC-I類分子]，以及人癌細胞株BEL-7402、HepG2和SMMC-7721進行體外殺傷實驗并在上述肝癌細胞BALB/c-nu/nu動物模型進行抑瘤實驗，結果顯示激活的NK細胞對不同的肝癌細胞株均有殺傷或抑瘤作用，但其作用有明顯差異，BEL7402最好，HepG2次之，SMMC7721最差。進一步流式細胞測定腫瘤細胞表面MIC表達，顯示BEL-7402(48.7%)、 HepG2(32.8%)和SMMC-7721(0.9%)依次降低。因此，從初步結果看NK細胞殺傷肝癌的能力和肝癌細胞MIC呈正相關。然而，應該認識到，NK細胞和肝癌細胞的作用機制非常復雜，MIC的表達可能僅是其中的一方面。

[1] Llovet JM, Burroughs A, Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet, 2003, 362(9399): 1907-1917.

[2] Yoo HY, Patt CH, Geschwind JF, et al. The outcome of liver transplantation in patients with hepatocellular carcinoma in the United States between 1988 and 2001: 5-year survival has improved significantly with time[J].J Clin Oncol,2003,21(23):4329-4335.

[3] Allgaier HP, Deibert P, Olschewski M, et al. Survival benefit of patients with inoperable hepatocellular carcinoma treated by a combination of transarterial chemoembolization and percutaneous ethanol injection- a single-center analysis including 132 patients[J]. Int J Cancer,1998, 79(6):601-605.

[4] Takayasu K, Wakao F, Moriyama N, et al. Postresection recurrence of hepatocellular carcinoma treated by arterial embolization: analysis of prognostic factors[J] Hepatology, 1992，16(4): 906-911.

[5] Farag SS, VanDeusen JB, Fehniger TA, et al. Biology and clinical impact of human natural killer cells[J]. Int J Hematol,2003, 78(1): 7-17.

[6] Wada Y, Nakashima O, Kutami R, et al. Clinicopathological study on hepatocellular carcinoma with lymphocytic infiltration[J]. Hepatology,1998,27(2): 407-414.

[7] Cai L, Zhang Z, Zhou L, et al. Functional impairment in circulating and intrahepatic NK cells and relative mechanism in hepatocellular carcinoma patients[J]. Clin Immunol,2008,129(3):428-437.

[8] Korangy F, H?chst B, Manns MP, et al. Immune responses in hepatocellular carcinoma[J]. Dig Dis,2010,28(1):150-154.

[9] Miyagi T, Takehara T, Tatsumi T, et al. CD1d-mediated stimulation of natural killer T cells selectively activates hepatic naturalkiller cells to eliminate experimentally disseminated hepatoma cells in murine liver[J]. Int J Cancer,2003,106(1):81-89.

[10]Taketomi A, Shimada M, Shirabe K,et al. Natural killer cell activity in patients with hepatocellular carcinoma: a new prognostic indicator after hepatectomy[J]. Cancer, 1998, 83(1):58-63.

[11]Du X, Bai Z, Zhang J, et al. Prolonged survival of human hepatocarcinoma cells in the liver of newborn C57BL/6 mice and resulting cellular xenorejection, especially the activation of hepatic natural killer T cells[J]. Pathobiology,2010,77(3):115-128.

[12]Harada H, Saijo K, Watanabe S, et al. Selective expansion of human natural killer cells from peripheral blood mononuclear cells by the cell line, HFWT[J]. Jpn J Cancer Res, 2002, 93(3):313-319.

[13]Wisse E, Luo D, Vermijlen D, et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells[J]. Semin Liver Dis, 1997, 17(4): 265-286.

[14]龍?zhí)熘?李國林,呂麗虹,等.大鼠肝臟NK細胞的分離、純化與超微結構特征[J]. 中國病理生理雜志, 2009,25(6):1240-1243.

[15]Takayama T, Sekine T, Makuuchi M, et al. Adoptive immunotherapy to lower postsurgical recurrence rates of hepatocellular carcinoma: a randomised trial[J]. Lancet, 2000, 356(9232): 802-807.

[16]Miller JS, Soignier Y, Panoskaltsis-Mortari A, et al. Successful adoptive transfer andinvivoexpansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer[J]. Blood, 2005,105(8):3051-3057.

[17]Ishikawa E, Tsuboi K, Saijo K, et al. Autologous natural killer cell therapy for human recurrent malignant glioma[J]. Anticancer Res, 2004,24(3b): 1861-1871.

ActivatedNKcellsagainsthumanhepatocellularcarcinomacelllinesinvitroandinvivo

LI Jian-jun1, CHEN Shi-ping1,GU Mo-fa2, YANG Wei-min3, LI Yong-qiang1, WANG Qi-jing1, HE Jia1, PAN Ke1, ZHAO Jing-jing1, XIA Jian-chuan1

(1BiotherapyCenter,2DepartmentofRadiationOncology,StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthChina,CancerCenter,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China;3DepartmentofObstetricsandGynaecology,HuangpuCampus,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China.E-mail:xiajch@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To evaluate the role of natural killer(NK) cells against a variety of human hepatocellular carcinoma (HCC) cell linesinvitroandinvivo, and to investigate the expression of MHC class I chain-related protein (MIC protein) in these HCC cell lines.METHODSPeripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from 50 mL peripheral blood donored by a healthy volunteer and cultured in the NK cell kit followed by amplification and cytokine activation. The release of lactate dehydrogenase (LDH) was detected by lysis experiment. Animal experiments were performed following vaccination with HCC cell lines (BEL7402, HepG2 and SMMC7721) in BALB/c-nu/nu mice. The diameters of the tumors were measured and the growth curves of difference cell lines were delineated. Three weeks later, these mice were sacrificed and the weight of the transplanted tumors was also detected. Furthermore, the expression of MIC protein was determined.RESULTSThe obvious differences of lysis effects of NK cells on different cell lines were observed, in which the lysis effect of NK cells on K562 cells was the strongest, the effect on BEL7402 cells was in the middle and the effect on SMMC7721 cells was the weakest. In animal experiments, NK cells also showed obvious and different restraining effects on a variety of HCC cell line-transplanted tumors in nude mice. The tumor inhibitory rates of NK cells were 43.5% in BEL-7402 cell-transplanted tumor, 40.7% in HepG2 cell-transplanted tumor and 36.0% in SMMC-7721 cell-transplanted tumor. The protein expression of MIC was 48.7%, 32.8% and 0.9% in the 3 cell lines,respectively.CONCLUSIONThe lysis effects of NK cells on a variety of human HCC cell lines are different. The expression of MIC in the tumor cells may play distinct role in evaluating these differences.

Natural killer cells; Liver neoplasms; MHC class I chain-related protein

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.011