李育敏， 朱雪姣， 谷景義， 費 嘉

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)04-0625-06

2011-10-08

2012-02-24

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81170496)；暨南大學(xué)科研培育與創(chuàng)新基金(前瞻性與基礎(chǔ))研究項目(No.21609406)

△通訊作者 Tel: 020-85220256; E-mail: efeijia@163.com

siRNA沉默RALA基因影響人白血病K562細胞增殖和凋亡*

李育敏， 朱雪姣， 谷景義， 費 嘉△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 廣東 廣州 510632)

目的研究小干擾RNA(siRNA)抑制v-ral 猴白血病病毒癌基因同系物A(RALA)基因表達對人慢性粒細胞性白血病K562細胞增殖和凋亡的影響。方法利用LipofectamineTM2000將化學(xué)合成的RALA siRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的K562細胞，四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測RALA siRNA對K562細胞增殖的影響；臺盼藍拒染法檢測RALA siRNA對K562細胞存活率的影響；real-time PCR檢測RALA mRNA表達水平；Western blotting檢測RALA蛋白表達水平；annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測RALA siRNA對K562細胞凋亡的影響；Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果RALA siRNA可明顯抑制K562細胞內(nèi)RALA mRNA和蛋白的表達(P<0.05)；與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染RALA siRNA的K562細胞增殖明顯受到抑制(P<0.05)；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染RALA siRNA的K562細胞凋亡較陰性對照組顯著增加(P<0.05)；Hoechst 33258染色見轉(zhuǎn)染RALA siRNA的K562細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化。結(jié)論癌基因RALA在白血病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。siRNA下調(diào)RALA mRNA和蛋白的表達，可抑制人白血病K562細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，提示RALA可能是白血病治療的新靶點。

v-ral猴白血病病毒癌基因同系物A; 小干擾RNA; 白血病; 細胞增殖; 細胞凋亡

慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)是慢性骨髓增生性疾病中最常見的一種，屬于造血干細胞惡性增殖性疾病，以粒系增生為主。90% CML病人都存在BCR-ABL融合蛋白[1]。近年來的研究表明BCR-ABLl融合蛋白與Ras信號通路之間存在著密切的關(guān)系，Ras超家族成員如Rac、CDC42等在BCR/ABL融合蛋白下游作用通路中扮演著重要角色，提示Ras信號通路與CML發(fā)病機制密切相關(guān)[2-4]。v-ral猴白血病病毒癌基因同系物A(v-ral simian leukemia viral oncogene homolog A，RALA)是Ral(Ras-like)家族的一員，其翻譯的蛋白質(zhì)類似于ras基因翻譯的連接于三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate, GTP)上的連接蛋白，這種蛋白可以與細胞膜上的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。研究表明Ral家族成員與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在肺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等腫瘤中都發(fā)現(xiàn)Ral家族基因的活化、突變和表達改變[5-7]。RALA作為一種癌基因，參與多種腫瘤細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲等一系列進程[8-10]。而RALA是否參與CML的發(fā)生發(fā)展尚待研究。RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象自發(fā)現(xiàn)以來，已成功應(yīng)用于線蟲、果蠅、植物、真菌和哺乳動物等生物的多個研究領(lǐng)域中[11]。本實驗采用RNAi技術(shù)抑制癌基因RALA的表達，觀察其對人CML細胞株K562細胞增殖和凋亡的影響，研究RALA在K562細胞增殖和凋亡過程中的作用機制，為研究CML新的治療靶點提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

人慢性粒細胞白血病K562細胞株購于中國科學(xué)院上海細胞庫。RALA siRNA和隨機序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成，-20 ℃保存。RALA siRNA正義鏈引物5′-CGUGGAAACAUCUGCUAAATT-3′, 反義鏈引物5′-UUUAGCAGAUGUUUCCACGTA-3′；隨機序列(scramble, SCR)正義鏈引物5′-UUCUCCGAACGUGUC ACGUTT-3′， 反義鏈引物5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3′。DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco。Opti-MEM培養(yǎng)基購自Invitrogen。LipofectamineTM2000 購自Invitrogen。MTT、臺盼藍、二甲基亞砜(DMSO)和Hoechst 33258試劑均購自Sigma。Trizol試劑和real-time PCR試劑購自北京天根生化科技有限公司。RIPA細胞裂解液購自上海申能博彩生物科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。鼠抗β-actin多抗購自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗RALA多抗購自Abcam。ECL試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

2方法

2.1細胞培養(yǎng) 將K562細胞接種于含體積分數(shù)10%的胎牛血清、無抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱，飽和濕度下培養(yǎng)。每2～3 d換液傳代。實驗選用對數(shù)生長期、0.2%臺盼藍拒染率>95%的細胞。

2.2MTT法測細胞增殖抑制率 實驗分RALA siRNA組、隨機對照組(隨機序列組，陰性對照)和空白對照組，每組設(shè)4個復(fù)孔。RALA siRNA組和隨機對照組的核酸終濃度為25、50、75、100、125 nmol/L。取對數(shù)生長期細胞，各組細胞以1×108/L的密度接種于96孔板，每孔50 μL，轉(zhuǎn)染體積100 μL(轉(zhuǎn)染方法參照LipofectamineTM2000說明書)，空白對照組加入與藥物等體積的無血清Opti-MEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6 h后，加入100 μL含20%血清DMEM/F12培養(yǎng)基，使終體積200 μL。48 h后每孔加入MTT液20 μL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，1 000 r/min離心10 min，棄上清，每孔加入150 μL DMSO。振蕩使結(jié)晶充分溶解，在多功能酶標儀上測定吸光度A570,間接反映存活細胞量。實驗重復(fù)3次，計算增殖抑制率。增殖抑制率(%)=[1-(A實驗組/A對照組)]×100%。

2.3臺盼藍拒染法檢測不同時段的細胞生長狀況 實驗分組及轉(zhuǎn)染處理同前，RALA siRNA組和隨機對照組的核酸終濃度為100 nmol/L。于24、48、72 h臺盼藍拒染法檢測各組活細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次，取均值。

2.4Real-time PCR檢測細胞內(nèi)RALA mRNA的相對表達水平 實驗分組同前。取對數(shù)生長期細胞，各組細胞以1.5×108/L的密度接種于24孔板，每孔400 μL，轉(zhuǎn)染終體積500 μL。6 h后加入500 μL 20%血清培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RALA siRNA組和隨機對照組的核酸終濃度為100 nmol/L。于48 h收集細胞，總RNA抽提按Trizol試劑說明書進行,提取的總RNA用紫外分光光度儀(UVP)測A260/A280進行RNA純度及濃度計算, 利用SYBR GreenⅠreal-time PCR檢測K562細胞內(nèi)RALA mRNA的表達水平，以GAPDH為內(nèi)參照。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃持續(xù)1 h, 95 ℃持續(xù)5 min。Real-time PCR條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30s，RALA 56 ℃或GAPDH 57.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重復(fù)循環(huán)40次, 融解曲線分析60 ℃～95 ℃。PCR所用引物自行設(shè)計，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，RALA上游引物5′-ATCGGAAGAAGGTAGTGC-3′，下游引物5′-AAATCTGCTCC CTGAAGT-3′；GAPDH上游引物5′-CAACGGATTTGGTCGTATT-3′，下游引物5′-CACAGTCTTCTGGGTGGC-3′。RALA和GAPDH的擴增片段長度分別為182 bp和541 bp。RALA mRNA的相對表達水平用ΔCt和2-ΔΔCt計算。

2.5Western blotting檢測細胞內(nèi)RALA蛋白的相對表達水平 實驗分組及轉(zhuǎn)染方法同前。轉(zhuǎn)染48 h后，離心收集細胞，按細胞裂解液(RIPA)說明書提取細胞蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果對各蛋白質(zhì)樣本進行校正。加入樣品溶解液和樣品，置沸水中煮 5 min。不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%聚丙烯酰胺分離膠和5%聚丙烯酰胺濃縮膠)，電壓80 V，進入分離膠后改為120 V，40 min。將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，半干式轉(zhuǎn)膜15 V，18 min；TBST洗膜5 min。5%牛血清白蛋白封閉緩沖液室溫封閉1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。4 ℃過夜孵育Ⅰ抗。TBST洗膜3次，每次5 min。37 ℃孵育Ⅱ抗1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加入ECL，顯影、定影、掃描。BI-2000型圖像分析軟件分析RALA和β-actin的積分吸光度，以β-actin作為內(nèi)參照計算RALA蛋白的相對表達水平。

2.6Annexin V/PI雙染檢測RALA siRNA對細胞凋亡的影響 實驗分組及轉(zhuǎn)染處理同前，轉(zhuǎn)染后48 h離心收集各組細胞，預(yù)冷PBS洗滌細胞3次，1 mL結(jié)合緩沖液洗細胞1次，離心去上清，加入200 μL結(jié)合緩沖液，重懸細胞后，分別加入10 μL annexin V和5 μL PI，輕輕混勻，避光反應(yīng)30 min，立即上機檢測。Annexin V(+)、PI(-)的細胞為早期凋亡細胞。Annexin V(+)、PI(+)的細胞為晚期凋亡細胞和壞死細胞。

2.7Hoechst 33258染色觀察凋亡細胞形態(tài)學(xué)變化 實驗分組及轉(zhuǎn)染處理同前，轉(zhuǎn)染后48 h離心收集各組細胞，預(yù)冷PBS洗滌細胞3次，留少許上清，用微量加樣器吸取細胞在潔凈載玻片上涂片，室溫自然干燥，甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液固定10 min，Hoechst 33258 染色工作液(10 mg/L)避光染色2 min，流水沖洗5 min，熒光顯微鏡觀察并拍照。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1MTT法檢測RALAsiRNA對K562細胞增殖影響的量效效應(yīng)

RALA siRNA轉(zhuǎn)染K562細胞48 h后，表現(xiàn)出對細胞增殖的抑制作用。25、50、75、100和125 nmol/L RALA siRNA組與對照組相比，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。100 nmol/L RALA siRNA對細胞增殖的抑制作用最佳，達125 nmol/L濃度時，出現(xiàn)對細胞的非特異性抑制作用。隨著濃度的增加，RALA siRNA對細胞增殖的抑制作用越明顯，呈劑量依賴關(guān)系，見圖1。

圖1RALAsiRNA抑制K562細胞增殖的量效關(guān)系

2臺盼藍拒染法檢測RALAsiRNA對K562細胞存活率影響的時間效應(yīng)

100 nmol/L的RALA siRNA作用于K562細胞后24 h開始表現(xiàn)出抑制細胞存活率的效應(yīng)，持續(xù)至72 h，與對照組相比有顯著差異(P<0.05),見圖2。

圖2RALAsiRNA對K562細胞存活率的影響

3Real-timePCR檢測RALAsiRNA對K562細胞內(nèi)RALAmRNA的表達水平影響

Real-time PCR結(jié)果顯示：RALA siRNA轉(zhuǎn)染K562細胞48 h后，與對照組相比，RALA siRNA組RALA mRNA的表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3Real-timePCR檢測K562細胞RALAmRNA的表達

4Westernblotting檢測RALAsiRNA對K562細胞內(nèi)RALA蛋白表達的影響

RALA siRNA轉(zhuǎn)染K562細胞48 h后，Western blotting檢測RALA蛋白的表達。結(jié)果顯示，與對照組相比，RALA siRNA組RALA蛋白的表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

5AnnexinV/PI雙染檢測RALAsiRNA對K562細胞凋亡的影響

空白對照組和隨機對照組細胞早期凋亡率分別為2.54%±0.87%和2.85%±1.04%，RALA siRNA組細胞出現(xiàn)早期凋亡細胞群，早期凋亡率為7.74%±0.72%，與隨機對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，見圖5。

圖4Westernblotting檢測K562細胞RALA蛋白的表達

6Hoechst33258染色觀察K562細胞形態(tài)學(xué)變化

隨機對照組細胞與空白對照組相比未見明顯形態(tài)學(xué)差異，RALA siRNA組細胞可見核固縮、邊聚、裂解和凋亡小體形成等形態(tài)學(xué)變化，見圖6。

圖5AnnexinV/PI雙染檢測RALAsiRNA對K562細胞凋亡的影響

Figure 6. The morphological character of K562 cells transfected with RALA siRNA(Hoechst 33258 staining,×40)

圖6K562細胞形態(tài)學(xué)變化

討 論

CML是一種起源于多能造血干細胞的惡性增殖性疾病，約占成年人白血病的20%～30%，在我國白血病中發(fā)病率僅次于急性淋巴細胞性白血病和急性髓系白血病而居第3位，成為威脅人民健康的一種常見惡性腫瘤。目前治療CML的常規(guī)化療藥物如馬利蘭和羥基脲等缺乏腫瘤特異性，常引起較大的毒副作用。異基因造血干細胞移植是當(dāng)今唯一能治愈CML的方法，但受年齡、供者、病程、經(jīng)濟條件和移植相關(guān)病等多種因素限制，僅少數(shù)患者有條件接受。近年來基因靶向藥物——甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)已成為CML治療的一線藥物，但隨之產(chǎn)生的耐藥性往往導(dǎo)致治療失敗，而且其價格極為昂貴。因此，尋求腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵“靶標”以及與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的基因，開發(fā)新的靶向藥物，仍是腫瘤基因治療研究的重要方向。

RALA蛋白的功能依賴于活化型與失活型Ral之間的循環(huán)轉(zhuǎn)化能力，即Ral磷酸化和去磷酸化的能力，受Ral特異的鳥嘌呤核苷酸交換因子(Ral-specific guanyl nucleotide exchange factor，RalGEF)調(diào)節(jié)。RalGEF是Ras致細胞癌變的關(guān)鍵因素，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9, 12-13]。慢性粒細胞性白血病的Ph染色體形成BCR-ABL融合基因，產(chǎn)生一種具有酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，從而促發(fā)CML。近年來研究表明Ras信號通路在BCR-ABL融合蛋白下游基因調(diào)控作用中扮演著重要角色，與CML發(fā)病機制密切相關(guān)[2-4]。本實驗設(shè)計合成RALA siRNA，轉(zhuǎn)染人慢性粒細胞性白血病細胞株K562細胞，結(jié)果顯示RALA siRNA顯著下調(diào)K562細胞內(nèi)RALA mRNA和蛋白的表達，抑制細胞增殖(P<0.05)。轉(zhuǎn)染RALA siRNA的K562細胞早期凋亡率較隨機對照組增高(P<0.05)，可見核固縮、邊聚、裂解、凋亡小體形成等凋亡形態(tài)學(xué)變化。這表明在K562細胞中癌基因RALA的表達水平與細胞增殖和凋亡密切相關(guān)，RALA可能是白血病基因治療的新靶點。

研究表明，癌基因RALA通過調(diào)控一系列下游分子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制。Ral相互作用蛋白(Ral-interacting protein, RLIP)76[又稱RALA結(jié)合蛋白1(RALA-binding protein 1，RALBP1)]是 RALA的效應(yīng)分子[14]。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又稱腫瘤壞死因子超家族成員10(tumor necrosis factor superfamily, member 10, TNFSF10)，參與RALA-RLIP途徑，抑制抗凋亡蛋白caspase-8(CASP8)和CASP8與Fas相關(guān)死亡域蛋白樣凋亡調(diào)控因子(CASP8 and FADD-like apoptosis regulator, CFLAR)的翻譯[15]。c-Jun 氨基端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1, JNK1)[又稱絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)]和核因子(nuclear factor κB，NF-κB)也參與調(diào)節(jié)RLIP[16-19]。RLIP的表達降低使腫瘤細胞生長和存活受抑制[20-21]。CD24也是RALA的下游效應(yīng)分子，CD24參與調(diào)節(jié)細胞凋亡[22]。Ras 1激酶抑制因子連接體增強子(connector enhancer of kinase suppressor of Ras 1, CNK1)與RALA相互干擾，CNK1促進凋亡[23]。研究提示，抑制PI3K/Akt信號通路可抑制腫瘤細胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[24]。散射因子(scatter factor，SF)是一種肝細胞生長因子，它在腫瘤細胞內(nèi)大量堆積，對抗DNA損傷劑引起的細胞毒性和凋亡，從而對腫瘤細胞起到保護作用。SF與受體(c-Met) 結(jié)合，通過 PI3K → c-Akt → PAK1(p21-activated kinase 1) → NF-κB通路發(fā)揮SF介導(dǎo)的細胞保護和抗凋亡機制，RALA參與調(diào)節(jié)SF的這種功能[25]，而PI3K/Akt通路激活可抑制細胞凋亡[26]，因此RALA可能通過該途徑參與調(diào)節(jié)細胞凋亡。最近研究表明，RALA參與調(diào)節(jié)細胞有絲分裂過程中線粒體的分布，從而影響細胞的分裂和增殖[27]。在本實驗中，我們還沒有對RALA影響細胞增殖和凋亡的下游分子機制進行深入的研究。我們推測在K562細胞中，RALA也可能通過調(diào)控這些下游分子來影響腫瘤細胞的增殖和凋亡。這些已經(jīng)取得的研究成果為我們今后的研究工作指明了方向。作為Ral家族成員的RALA與BCR-ABL融合蛋白的關(guān)系將是我們下一步深入探討的問題。

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KnockdownofRALAbysiRNAinhibitscellproliferationandinducesapoptosisinhumanleukemicK562cells

LI Yu-min, ZHU Xue-jiao, GU Jing-yi, FEI Jia

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:efeijia@163.com)

AIM: To investigate the effect of siRNA-induced knockdown of v-ral simian leukemia viral oncogene homolog A(RALA) on proliferation and apoptosis of chronic myelogenous leukemia(CML) K562 cells.METHODSThe chemically synthesized siRNA targeting toRALAgene was transfected into K562 cells using LipofectamineTM2000. The proliferation and viability of K562 cells were detected by MTT assay and trypan blue dye exclusion. The expression levels of RALA mRNA and protein were determined by quantitative real-time PCR and Western blotting,respectively. The cell apoptosis was analyzed using flow cytometry by double staining with annexin V and propidium iodide, and the apoptotic morphological changes were detected by Hoechst 33258 staining.RESULTSRALA siRNA significantly down-regulatedRALAmRNA and protein expression in K562 cells(P<0.05). The proliferation of K562 cells inRALAsiRNA group was inhibited compared with control group(P<0.05). The apoptotic rate was much higher inRALAsiRNA group than that in negative control group(P<0.05). The apoptotic morphological changes were observed in the nuclei of K562 cells transfected with RALA siRNA.CONCLUSIONThe siRNA-mediated knockdown ofRALAresults in inhibition of proliferation and induction of apoptosis in K562 cells, indicating thatRALAmight be used as a potential therapeutic target in chronic myelogenous leukemia.

v-ral simian leukemia viral oncogene homolog A; siRNA; Leukemia; Cell proliferation; Apoptosis

R342.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.009