李 曙， 張根葆,2 △， 洪 云， 陸曉華

(皖南醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室， 2蛇毒研究所， 3弋磯山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，4機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，安徽 蕪湖 241002)

1000-4718(2012)04-0595-06

2011-11-23

2012-02-24

安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(No.KJ2010B461)；安徽省教育廳自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目 (No.KJ2011266)；皖南醫(yī)學(xué)院中青年課題(No.WK200918)

△通訊作者 Tel：0553-3932435；E-mail: zgb858@163.com

蛇毒PCA改善冠脈微血栓大鼠血液流變學(xué)的機(jī)制研究*

李 曙1， 張根葆1,2 △， 洪 云3， 陸曉華4

(皖南醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室，2蛇毒研究所，3弋磯山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，4機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，安徽 蕪湖 241002)

目的探討皖南產(chǎn)蝮蛇毒(AHV)蛋白C激活物(PCA)改善冠脈微血栓(CAM)大鼠血液流變學(xué)的作用機(jī)制。方法Sprague-Dawley大鼠50只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、CAM組、低、中、高劑量PCA[CAM+PCA(0.5 mg/kg)、CAM+PCA (2 mg/kg)、CAM+PCA (8 mg/kg)]干預(yù)組，每組10只。通過從主動(dòng)脈根部直接向左心室注入月桂酸鈉1.0 mg/kg(濃度10 g/L)以建立大鼠冠脈微血栓模型，采用血栓彈力儀系統(tǒng)(TEG)描計(jì)血栓彈力圖，測(cè)定各組血漿中內(nèi)皮素-1(ET-1)、P-選擇素(P-selectin)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的水平；Western blotting檢測(cè)心肌組織中P-selectin和腫瘤壞死因子α(TNF-α)蛋白表達(dá)；光鏡觀察心肌組織學(xué)改變。結(jié)果與模型組比較，PCA大劑量干預(yù)組凝血時(shí)間和血凝塊形成時(shí)間延長(zhǎng)，Alpha角度、最大幅度和血凝指數(shù)值減小(P<0.05)，血漿CK-MB、LDH、AST、ET-1和P-selectin的水平降低(P<0.05)，心肌組織P-selectin和TNF-α的蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。病理觀察顯示中、高劑量PCA干預(yù)組大鼠冠脈未形成微血栓。結(jié)論蝮蛇毒PCA組分可以限制冠脈微血栓的形成，降低血漿ET-1和P-selectin的含量，抑制心肌組織P-selectin和TNF-α表達(dá)，改善微血栓后血液流變學(xué)變化，有效保護(hù)心肌細(xì)胞。

蝮蛇毒; 蛋白C激活物； 微血栓； 血液流變學(xué)

血栓性疾病是一組因各種原因致使血液在血管內(nèi)或心臟中，由流動(dòng)的液體變?yōu)槟痰墓腆w，致使血流發(fā)生不同程度的受阻后所形成的綜合病癥[1-2]。蛇毒作為一種天然的藥用資源，含有多種活性成分，是目前治療心腦血管疾病較為有效的生物制劑。近些年來，本課題組從皖南地區(qū)五步蛇、蝮蛇和眼鏡蛇粗毒中分離純化了蛋白C激活物(protein C activator, PCA)，實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)該生物活性物質(zhì)可影響凝血過程，影響血小板黏附、聚集和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，具有高效低毒的抗凝、溶栓效應(yīng)，這對(duì)于臨床血栓性疾病的防治以及改善血液高凝狀態(tài)具有重要意義。但PCA是否通過抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)防止內(nèi)皮損傷和血栓形成目前尚未見報(bào)道。本文采用月桂酸鈉復(fù)制大鼠冠脈微血栓(coronary artery microthrombosis,CAM)模型，探討PCA對(duì)實(shí)驗(yàn)性冠脈微血栓的影響，為今后進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1藥物與試劑

蛇毒PCA由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供；SDS-PAGE凝膠電泳試劑(Sigma)；P-選擇素(P-selectin)、TNF-α、羊抗大鼠多克隆抗體、馬抗山羊 IgG抗體、β-actin (Santa Cruz)，月桂酸鈉(上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司)，肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)活性測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1) 測(cè)定試劑盒(北京尚柏生物科技有限公司)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2主要儀器

TEG?5000型血栓彈力儀系統(tǒng)(Haemoscope Corporation)；DYY-10C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(KTAprime，GE)；DW-2000型動(dòng)物人工呼吸機(jī)(上海嘉鵬科技有限公司)；Model 680型酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；7060 型全自動(dòng)生化分析儀(日立)；Western blotting：Bio-Rad MiniGel系統(tǒng)。

3動(dòng)物分組與給藥

健康雄性Sprague-Dawley大鼠50只,體重200～250 g，由皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組 (sham operation,sham)、CAM模型組、低、中、高劑量PCA干預(yù)組(0.5 mg/kg、2 mg/kg、

8 mg/kg),每組10只。模型復(fù)制10 min后，各PCA組舌靜脈注射PCA；CAM組注射同體積生理鹽水；sham組不復(fù)制微血栓模型，僅注射同體積生理鹽水。

4大鼠冠脈微血栓模型制備

參考葉明芳等[3]方法加以改進(jìn)，取SD雄性大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)后，仰臥固定，常規(guī)頸部手術(shù)，氣管插管，呼吸機(jī)輔助通氣，左前外側(cè)中心切口進(jìn)胸，分離主動(dòng)脈并用血管夾夾閉主動(dòng)脈后，迅速以微量注射器從主動(dòng)脈根部注入月桂酸鈉1.0 mg/kg(濃度10 g/L)；夾閉20 s后，松開血管夾，心跳穩(wěn)定后逐層關(guān)胸。

5大鼠血液流變學(xué)監(jiān)測(cè)

各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均于3 h后頸總動(dòng)脈取1 mL血液置于3.8%枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝劑5 mL試管中，實(shí)驗(yàn)所用玻璃試管均經(jīng)硅化處理。血樣加入專業(yè)測(cè)試杯，激活劑為Kolin。用TEG?5000型血栓彈力圖-凝血彈性描記儀系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱TEG)對(duì)血樣各參數(shù)：凝血時(shí)間(R)；血凝塊形成時(shí)間(K)；Alpha角度；最大幅度(maximum amplitude,MA)；凝血指數(shù)(coagulation index,CI)等進(jìn)行檢測(cè)。

6大鼠血液生化及分子生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

采用7060 型全自動(dòng)生化分析儀連續(xù)檢測(cè)法測(cè)定血漿中CK-MB、LDH和AST活性。采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法原理定量測(cè)定ET-1和P-選擇素水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

7Westernblotting檢測(cè)

術(shù)后12 h處死動(dòng)物，取約1 g心肌，加組織裂解液，勻漿、超聲、離心(12 000×g離心5 min)，取上清液150 μg用10% SDS-PAGE電泳后半干式轉(zhuǎn)膜至 PVDF膜, 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。P-selectin、TNF-αⅠ抗(1∶250稀釋 )室溫過夜, 加辣根過氧化物酶標(biāo)記的馬抗山羊IgG抗體 (1∶5 000稀釋 )室溫反應(yīng) 1.5 h, 洗膜后DAB顯色,膜置濾紙上干燥, 以β- actin為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量分析。

8組織形態(tài)學(xué)觀察

取左心室乳頭肌經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察微血栓形成及心肌形態(tài)學(xué)變化。

9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠血栓彈力圖影響

CAM組較sham組，R值和K值明顯降低(P<0.05)，表明CAM組血液處于高凝狀態(tài)；除CAM+PCA(0.5 mg/kg)組外，其它組與CAM組比較，R值、K值和CI明顯增加(P<0.05)，高劑量(8 mg/kg)組與sham組比較無明顯差異(P>0.05)，表明血液高凝狀態(tài)有所緩解，見圖1、表1。

Figure 1. Thrombelastogram performance in the blood of different rats.A:TEG parameters;B: sham；C: CAM；D: CAM+PCA (8 mg/kg).

圖1不同組大鼠血液血栓彈力圖表現(xiàn)

表1 蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠血栓彈力圖的影響

*P<0.05vssham;#P<0.05,##P<0.01vsCAM.

2蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠血漿中心肌酶水平的影響

CAM組大鼠血漿中AST、LDH和CK-MB活性均較sham組顯著升高(P<0.05)； PCA中劑量組和高劑量組大鼠血漿中AST、LDH和CK-MB活性較CAM組顯著降低(P<0.05)； PCA低劑量組大鼠血漿中AST、LDH和CK-MB活性與CAM組無明顯差異(P>0.05)。這提示中、高劑量蛇毒PCA對(duì)冠脈微血栓造成的心肌細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用，見表2。

表2 PCA對(duì)各組大鼠血漿中AST、LDH和CK-MB水平的影響

*P<0.05vssham;#P<0.05,##P<0.01vsCAM.

3蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠血漿中P-selectin和ET-1含量的影響

CAM組大鼠血漿中P-selectin和ET-1含量較sham組顯著升高(P<0.01)； PCA中劑量組和高劑量組大鼠血漿中P-selectin和ET-1的含量較CAM組顯著降低(P<0.05)；PCA低劑量組大鼠血漿中P-selectin和ET-1的含量與CAM組無明顯差異(P>0.05),見表3。

4蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠冠脈微血栓形成的影響

CAM組和PCA低劑量組心肌病理切片顯示：微血管腔內(nèi)有微血栓形成、炎癥細(xì)胞附壁、心肌腫脹。Sham組、PCA中劑量組和高劑量組心肌病理切片顯示：微血管腔內(nèi)有大量紅細(xì)胞、無炎癥細(xì)胞附壁、無心肌腫脹,見圖2。上述結(jié)果表明，蝮蛇毒PCA能有效抗凝、溶栓及保護(hù)心肌細(xì)胞。

表3PCA對(duì)各組大鼠血漿中P-選擇素和ET-1含量的影響

GroupP-selectin(μg/L)ET-1(ng/L)Sham11.23±1.21174.11±15.91CAM37.01±2.01*227.41±21.11*CAM+PCA(0.5mg/kg)35.89±2.14229.07±20.57CAM+PCA(2mg/kg)20.29±2.09#210.57±16.33#CAM+PCA(8mg/kg)16.09±2.34##183.68±11.02##

*P<0.05vssham;#P<0.05,##P<0.01vsCAM.

Figure 2. Comparison of myocardium in different groups of rats(HE staining,×400). A: sham; B: CAM; C: CAM+PCA(0.5 mg/kg); D: CAM+PCA(2 mg/kg); E: CAM+PCA(8 mg/kg).

圖2不同組大鼠心肌病理切片比較

5蝮蛇毒PCA組分對(duì)心肌中TNF-α和P-選擇素含量的影響

與sham組比較，CAM組大鼠心肌中TNF-α和P-selectin含量明顯增加(P<0.05)。PCA中、高劑量組大鼠心肌TNF-α和P-selectin含量較CAM組明顯降低(P<0.05)，見圖3。

討 論

冠狀動(dòng)脈血栓性疾病是心室重構(gòu)和心力衰竭的常見原因，其中微血栓的形成是造成冠脈微循環(huán)障礙的主要因素。實(shí)驗(yàn)中月桂酸鈉制造的外周動(dòng)脈血栓模型依靠月桂酸鈉有強(qiáng)烈的內(nèi)皮損傷作用，可造成內(nèi)皮的脫落，甚至穿孔；觸發(fā)炎癥性介質(zhì)如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、黏附分子等的釋放，觸發(fā)血小板活化[4-5]。聚集成血小板血栓并阻塞遠(yuǎn)端血管而形成冠狀動(dòng)脈微血栓。

蛇毒是從毒蛇毒腺中分泌出來的一種液體，其成份十分復(fù)雜，主要含有多種酶、蛋白質(zhì)和多肽等生物活性大分子。眾多研究已經(jīng)表明，從蛇毒粗毒中提取的活性分子具有非常廣泛的藥理學(xué)作用，部分已應(yīng)用于臨床止血、抗凝、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等領(lǐng)域。近年來我室從蝮蛇毒中提取的蛋白C激活物被實(shí)驗(yàn)證明可影響凝血過程、影響血小板黏附、聚集和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，具有高效低毒的抗凝、溶栓效應(yīng)[6-7]。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PCA組大鼠心肌酶較模型組有明顯改善，表明經(jīng)PCA治療，大鼠心肌損傷減輕。在血栓彈力儀監(jiān)測(cè)模型組及PCA干預(yù)組時(shí)，發(fā)現(xiàn)PCA干預(yù)組的R值、K值較模型組明顯增大，CI減??；同時(shí)病理切片顯示，PCA干預(yù)組的心肌細(xì)胞形態(tài)正常，組織間水腫和炎癥反應(yīng)較輕，微血管內(nèi)未形成微血栓，而模型組的心肌細(xì)胞水腫和炎癥反應(yīng)明顯，微血管內(nèi)有微血栓形成，也可看到微小梗死病灶，通過檢測(cè)內(nèi)皮損傷物ET-1也顯示PCA干預(yù)后的大鼠血漿中ET-1含量明顯低于模型組，提示PCA可能通過抑制血栓的形成而改善血液流變學(xué)對(duì)心肌起保護(hù)作用。

圖3各組大鼠心肌中TNF-α和P-selectin的含量

研究提示，炎癥網(wǎng)絡(luò)機(jī)制在血栓的形成起著重要作用。TNF-α是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，能促進(jìn)炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等黏附至內(nèi)皮細(xì)胞。選擇素家族是重要的黏附分子，TNF-α能迅速刺激這類黏附分子的合成和表達(dá)。其中P-選擇素是存在于內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade(WP)小體和血小板a顆粒中的一種糖蛋白。當(dāng)血管內(nèi)皮損傷及TNF-α刺激時(shí)，儲(chǔ)存于內(nèi)皮細(xì)胞WP小體內(nèi)的P選擇素可通過出胞作用迅速轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜上[8]，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞減速并沿血管壁滾動(dòng)[9]。Juliana 等[10]在腫瘤壞死因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，在敲除內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素大鼠模型中, TNF-α誘導(dǎo)的白細(xì)胞聚集、黏附現(xiàn)象較野生鼠中的減輕，因此血管內(nèi)炎性反應(yīng)是通過TNF-α介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放P-selectin而啟動(dòng)，并導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂, 進(jìn)一步促進(jìn)血小板活化[11]。Mami等[12]和Ishikawa 等[13]研究顯示血小板的聚集、黏附需要以白細(xì)胞向內(nèi)皮遷移、黏附為前提，因此內(nèi)皮細(xì)胞Ps 參與介導(dǎo)血小板在管腔內(nèi)的聚集和黏附。

本研究中以蝮蛇毒PCA干預(yù)月桂酸鈉損傷的CAM模型，Western blotting結(jié)果顯示，大鼠心肌中P-選擇素和TNF-α的表達(dá)較模型組明顯降低，與病理結(jié)果相符。提示PCA可能通過調(diào)控TNF-α和P-selectin表達(dá)抑制白細(xì)胞及血小板的聚集、黏附，減輕血栓的形成，從而改善冠脈微血栓后的血液流變學(xué)變化。

綜上所述，我室提取的蝮蛇毒PCA活性物質(zhì)能明顯抑制微血栓形成，減少心肌酶釋放，改變血液的高凝狀態(tài)，對(duì)缺血心肌和血管內(nèi)皮有改善和保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制炎癥反應(yīng)和血小板活化，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，也可能是通過減輕微血管栓塞改善心肌損傷。因此，明確蝮蛇毒PCA調(diào)節(jié)血液流變學(xué)改變的主要途徑，是我們進(jìn)一步研究的方向[14-17]。

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AgkistrodonhalysvenomPCAimproveshemorheologyinratswithcoronaryarterymicrothrombosis

LI Shu1, ZHANG Gen-bao1,2, HONG Yun3, LU Xiao-hua4

(1DepartmentofPathophysiology,2InstituteofSnakeVenom,3DepartmentofUltrasonography,YijishanHospital,4ExperimentalCenterforFunctionalSubjects,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China.E-mail:zgb858@163.com)

AIM: To explore the effect of protein C activator (PCA) from WannanAgkistrodonhalysvenom on hemorheology in the rats with coronary artery microthrombosis(CAM).METHODSFifty SD rats were randomly divided into sham operation group, CAM group, low dose (0.5 mg/kg), medium dose (2 mg/kg ) and high dose (8 mg/kg) of PCA treatment groups. The model of CAM was induced by injecting sodium laurate at dose of 1.0 mg/kg with the concentration of 10 g/L from aortic root to left ventricle. Thrombelastogram was obtained by thromboelastography instrument system. The content of endothelin-1(ET-1) and P-selectin, and the activity of creatine kinase-MB (CK-MB),lactate dehydrogenase (LDH) and aspartate aminotransferase (AST) in plasma were determined by ELISA. The protein expression of myocardial P-selectin and TNF-α was detected by Western blotting. The structural changes of the myocardial cells and interstitial tissues were observed under microscope.RESULTSCompared with CAM group, clotting time and clot formation time significantly prolonged in high-dose PCA group. The alpha angle, maximum amplitude, coagulation index, and the levels of ET-1, P-selectin, CK-MB, LDH and AST in plasma were decreased. The protein expression levels of P-selectin and TNF-α in myocardial tissues were down-regulated (P<0.05). Cardiac histological observation showed that coronary microthrombi in medium-dose and high-dose PCA groups were not found.CONCLUSIONAgkistrodonhalysvenom PCA inhibits the formation of coronary microthrombi, down-regulates the expression of P-selectin and TNF-α, improves the abnormal hemorheology after microthrombi, and effectively protects myocardial cells.

Agkistrodonhalysvenom; Protein C activator; Microthrombus; Hemorheology

R543.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.004