晏 浩， 徐建軍△， 李文林， 朱書強， 龍 翔， 車建鵬， 陳立如

(南昌大學(xué) 1第二附屬醫(yī)院胸心外科，2 醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006)

1000-4718(2012)04-0583-06

2011-10-13

2011-12-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30960381)；江西省教育廳科研項目(No.GJJ08097)

△通訊作者 Tel:0791-86293362; E-mail:xujianjun3526@163.com

MicroRNA-30a調(diào)控Beclin-1對缺氧復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞的保護效應(yīng)*

晏 浩1， 徐建軍1△， 李文林2， 朱書強1， 龍 翔1， 車建鵬1， 陳立如1

(南昌大學(xué)1第二附屬醫(yī)院胸心外科，2醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006)

目的觀察microRNA-30a(miR-30a)在原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧中的作用，探討miR-30a保護缺血再灌注心肌的分子機制。方法重組構(gòu)建慢病毒miR-30a表達載體(LV-GFP-miR-30a)感染原代乳鼠心肌細(xì)胞，構(gòu)建缺氧復(fù)氧損傷模型。實驗分為正常培養(yǎng)組、單純?nèi)毖鯊?fù)氧組、LV-GFP加缺氧復(fù)氧組、LV-miR-30a-GFP加缺氧復(fù)氧組和3-甲基腺嘌呤(3-MA)加缺氧復(fù)氧組。Real-time PCR檢測缺氧復(fù)氧和慢病毒感染對miR-30a的表達影響，Western blotting檢測LC3和Beclin-1蛋白表達變化，TUNEL和PI染色檢測缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞死亡情況。結(jié)果(1)缺氧復(fù)氧后心肌miR-30a表達水平下調(diào)(P<0.05)；(2)慢病毒miR-30a表達載體高效感染后心肌細(xì)胞miR-30a表達水平上調(diào)(P<0.05)，心肌過表達miR-30a下調(diào)Beclin-1蛋白表達(P<0.05)；(3)心肌過表達miR-30a抑制缺氧復(fù)氧后Beclin-1表達(P<0.05)；3-MA處理減少缺氧復(fù)氧后心肌Beclin-1表達，減少缺氧復(fù)氧后LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ(P<0.05)；(4)過表達miR-30a和3-MA處理減少缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞凋亡(P<0.05)。結(jié)論心肌細(xì)胞過表達miR-30a顯著下調(diào)Beclin-1；抑制自噬可以減少缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞死亡。

缺血再灌注； 細(xì)胞凋亡； 微小RNA; 自吞噬作用

心肌梗死發(fā)生后心肌供氧供能嚴(yán)重不足，心肌細(xì)胞由于損傷方式和程度不同，表現(xiàn)出多種形式死亡：壞死、凋亡(Ⅰ型程序性死亡)和自噬性死亡(Ⅱ型程序性死亡)，而壞死、凋亡和自噬三者間又同時存在協(xié)同和拮抗關(guān)系。自噬是一個高度保守的生命過程，在真核生物和原核生物已經(jīng)確定了參與自噬的30多個自噬相關(guān)基因(Atg)。生理條件下自噬是細(xì)胞長存蛋白和細(xì)胞器代謝再循環(huán)的主要方式。而應(yīng)激時自噬為細(xì)胞生存提供應(yīng)急能量和清除有害細(xì)胞器，而過度激活自噬將導(dǎo)致自我消化而加重?fù)p傷。微小RNA(microRNA，miRNA)參與心肌缺血再灌注損傷多個環(huán)節(jié)的調(diào)控，被認(rèn)為參與沉默多個信號通路上的關(guān)鍵蛋白[1]。各種心肌病理過程中miR-30a表達均有改變，我們通過生物信息軟件TargetScan預(yù)測rno-miR-30a可能調(diào)控大鼠Beclin-1(真核基因Atg6同源基因)表達，而且Beclin-1被認(rèn)為是心肌缺血再灌注過程中的主要自噬功能基因，但其調(diào)控機制尚不清楚。本研究關(guān)注于心肌再灌注損傷中心肌自噬的作用，通過在原代心肌細(xì)胞過表達miR-30a，觀察缺氧復(fù)氧中心肌細(xì)胞經(jīng)典自噬蛋白Beclin-1蛋白表達與心肌細(xì)胞死亡的相關(guān)性，探討miR-30a保護缺血心肌的分子機制。

材 料 和 方 法

1主要試劑

Trizol reagent(Invitrogen); TUNEL顯色法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Merck),碘化丙啶 (南京凱基);3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和BrdU(Sigma)；抗體LC3(Abcam)、 Beclin-1(Cell Signaling Technology)和β-actin(Santa Cruz)及辣根過氧化物酶偶聯(lián)Ⅱ抗(北京中杉)；蛋白提取試劑盒、蛋白酶磷酸酶復(fù)合抑制劑(普利萊)；BCA蛋白定量(碧云天)；增強型化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(Thermo)；其它試劑均為市售分析純。

2方法

2.1原代細(xì)胞培養(yǎng) 取出生1～2 d的Sprague Dawley大鼠[江西中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，許可證號為SCXK(贛)2005-0001]，用75%乙醇消毒皮膚；頸椎脫臼處死乳鼠，開胸取心室肌，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大的碎塊，用0.25%胰酶PBS緩沖液在37 ℃水浴中多次振蕩消化，每次5 min，共12～18次。收集除第1次以外的上清，用含15%胎牛血清的高糖DMEM終止消化，離心取細(xì)胞沉淀，加入培養(yǎng)液，集中混勻制成細(xì)胞懸液。應(yīng)用差速貼壁法分離純化心肌細(xì)胞，并添加100 μmol/L BrdU抑制非心肌細(xì)胞增殖。

2.2重組慢病毒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 上海吉凱基因化學(xué)構(gòu)建rno-miR-30a過表達慢病毒(LV-GFP-miR-30a)及對照慢病毒(LV-GFP)，本實驗慢病毒以感染復(fù)數(shù)值為70感染原代心肌細(xì)胞，每孔中加入5 mmol/L polybrene增強感染效率，轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察 GFP 綠色熒光，估算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

2.3構(gòu)建心肌缺氧復(fù)氧模型 正常培養(yǎng)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞72 h，觀察心肌搏動頻率情況后進行缺氧復(fù)氧培養(yǎng)，37 ℃預(yù)熱配制的缺氧液和復(fù)氧液，將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞換用預(yù)充有95%N2+5%CO2的缺氧液，95%N2+5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)2 h。再將缺氧的心肌細(xì)胞換用預(yù)充95%O2+5%CO2的含糖復(fù)氧液，并在95%O2+5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)4 h，建立缺氧/復(fù)氧損傷模型[2-3]。

2.4實驗分組 根據(jù)實驗方案實驗分為5組：(1)正常培養(yǎng)組：更換正常培養(yǎng)基后在5% CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)6 h；(2)單純?nèi)毖鯊?fù)氧組：更換缺氧液缺氧培養(yǎng)2 h，再更換復(fù)氧液復(fù)氧培養(yǎng)4 h；(3)LV-GFP加缺氧復(fù)氧組：LV-GFP感染心肌細(xì)胞更換缺氧液缺氧培養(yǎng)2 h，再更換復(fù)氧液復(fù)氧培養(yǎng)4 h；(4)LV-GFP-miR-30a加缺氧復(fù)氧組：LV-GFP-miR-30a感染細(xì)胞更換缺氧液缺氧培養(yǎng)2 h，再更換復(fù)氧液復(fù)氧培養(yǎng)4 h；(5)3-MA加缺氧復(fù)氧組：更換含5 mmol/L 3-MA缺氧液缺氧培養(yǎng)2 h，再更換含5 mmol/L 3-MA復(fù)氧液復(fù)氧培養(yǎng)4 h。

2.5實時定量PCR法檢測心肌miR-30a表達變化 常規(guī)Trizol方法抽提心肌細(xì)胞總RNA， 通過Bulge-LoopTMRT Primer反轉(zhuǎn)錄，采用 SYBR Green進行qRT-PCR，引物序列采用Bulge-LoopTM-rno-miR-30a定量檢測引物和U6 snRNA為內(nèi)參照(廣州銳博生物)，反應(yīng)參數(shù): 預(yù)變性95 ℃ 20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40個循環(huán)，miR-30a和U6產(chǎn)物倍數(shù)按2-ΔΔCt計算。

2.6TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡 參照試劑盒說明書。處理后各組心肌細(xì)胞在4 ℃ 4%甲醛固定30 min，室溫孵育15 min水合，使用蛋白酶K孵育20 min透性處理樣品，再30%H2O2與甲醇室溫孵育5 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，平衡緩沖液室溫孵育30 min，接著37 ℃孵育1.5 h標(biāo)記反應(yīng)，終止緩沖液終止反應(yīng)，封閉緩沖液封閉30 min，最后甲基綠復(fù)染3 min，二甲苯封片。各組分別取5張，每張隨機取10個視野計算，褐色為凋亡陽性細(xì)胞，綠色和淺色為非凋亡細(xì)胞，計算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)(AI=凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

2.7碘化丙啶(PI)染色檢測心肌細(xì)胞死亡 PI檢測參照試劑盒說明書，各組處理后心肌細(xì)胞洗滌后加入PI避光孵育5 min，PI熒光信號呈紅色，使用CKX41倒置熒光成像系統(tǒng)(Olympus)觀察和拍照分析。

2.8Western blotting 檢測LC3和Beclin-1蛋白表達 按照總蛋白提取試劑盒說明，添加蛋白酶磷酸酶復(fù)合抑制劑，裂解液冰上充分裂解組織蛋白，高速離心沉淀總蛋白后乙醇洗滌，十二烷基磺酸鈉溶液溶解總蛋白，并按BCA法蛋白定量檢查蛋白濃度，采用8%～15%膠上樣30～40 mg蛋白，聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜2 h，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，4 ℃ Ⅰ抗孵育過夜，Beclin-1以β-actin為內(nèi)參照， LC3蛋白轉(zhuǎn)化以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值參考，洗滌后Ⅱ抗室溫孵育1 h，再次洗滌后使用增強型化學(xué)發(fā)光顯色試劑顯影，膠片(柯達)曝光，膠片圖像掃描后通過ImageJ圖像軟件分析統(tǒng)計。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞下調(diào)miR-30a表達

實時定量PCR檢測結(jié)果顯示原代心肌細(xì)胞單純?nèi)毖鯊?fù)氧后miR-30a水平是正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞的(25.4±0.7) %，P<0.05,見圖1；這表明缺氧復(fù)氧下調(diào)心肌細(xì)胞miR-30a表達。

圖1缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞miR-30a的表達

2慢病毒miR-30a轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后上調(diào)miR-30a，抑制心肌細(xì)胞Beclin-1蛋白表達

重組慢病毒感染心肌細(xì)胞后，熒光顯微鏡檢測含GFP綠色熒光原代心肌細(xì)胞超過80%，見圖2。實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，與單純LV-GFP組比較，LV-GFP-miR-30a組miR-30a上調(diào)(31.58±4.93)倍，P<0.05,見圖2。這說明LV-GFP-miR-30a轉(zhuǎn)染可以有效上調(diào)miR-30a表達。而通過Western blotting檢測，與單純LV-GFP組(0.30±0.10)比較，LV-GFP-miR-30a組顯著下調(diào)Beclin-1蛋白(0.07±0.04)，P<0.05,見圖3。

圖2慢病毒感染心肌細(xì)胞后GFP和miR-30a的表達

圖3慢病毒miR-30a感染心肌細(xì)胞后Beclin-1蛋白的表達

3缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞Beclin-1和LC3的表達變化

原代心肌細(xì)胞感染和藥物處理后行缺氧復(fù)氧損傷，通過Western blotting 檢測各組Beclin-1表達差異，相比單純?nèi)毖鯊?fù)氧組和LV-GFP加缺氧復(fù)氧組，LV-GFP-miR-30a加缺氧復(fù)氧組和3-MA加缺氧復(fù)氧組均下調(diào)Beclin-1(P<0.05),見圖4。 LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ是自噬標(biāo)志過程。比較各組LC3-Ⅱ表達差異發(fā)現(xiàn)，相比LV-GFP加缺氧復(fù)氧組，LV-GFP-miR-30a加缺氧復(fù)氧組和3-MA加缺氧復(fù)氧組明顯減少LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ(P<0.05),見圖5。

圖4缺氧復(fù)氧后各組Beclin-1蛋白的表達

4miR-30a可以抑制缺氧復(fù)氧后細(xì)胞死亡

缺氧處理心肌進行TUNEL顯色法細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，相比單純?nèi)毖鯊?fù)氧組(57.7%±6.7%)和 LV-GFP加缺氧復(fù)氧組(65.5%±7.2%)，LV-GFP-miR-30a加缺氧復(fù)氧組(36.5%±3.1%)和3-MA加缺氧復(fù)氧組(41.6%±3.1%)均明顯減少凋亡(P<0.05),見圖6。各組原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后直接進行PI染色，PI穿過破損細(xì)胞膜染紅細(xì)胞核，所以紅染細(xì)胞代表晚期細(xì)胞凋亡和其它死亡類型細(xì)胞，見圖7。我們觀察到在LV-GFP-miR-30a加缺氧復(fù)氧組和3-MA加缺氧復(fù)氧組紅染明顯少于缺氧復(fù)氧組和LV-GFP加缺氧復(fù)氧組。由于原代心肌形態(tài)特殊性，還無法進行定量。

圖5缺氧復(fù)氧后各組LC3蛋白的表達

圖6缺氧復(fù)氧后各組心肌細(xì)胞凋亡情況

Figure 7. Cell death after H/R (PI staining,×60).1: normal group; 2: H/R group; 3: LV-GFP plus H/R group; 4: LV-GFP-miR-30a plus H/R group; 5: 3-MA plus H/R group.

圖7缺氧復(fù)氧后各組細(xì)胞PI染色情況

Figure 8. Potential mechanism of miR-30a action.

圖8miR-30a在缺血再灌注損傷中的潛在機制

討 論

自噬是細(xì)胞的代謝機制，被認(rèn)為與神經(jīng)退變、腫瘤發(fā)生、老化、糖尿病等疾病密切相關(guān)。文獻報道m(xù)iR-30a調(diào)控多株人腫瘤細(xì)胞的Beclin-1基因，下調(diào)經(jīng)典的自噬過程，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞代謝過程[4]。miR-30a表達增加也被認(rèn)為與腫瘤疾病診斷預(yù)后有密切關(guān)系[5-6]。最新研究提示老化干細(xì)胞出現(xiàn)miR-30a表達下降，也提示Beclin-1可能參與干細(xì)胞老化過程[7]。

在心臟，自噬也是新陳代謝和應(yīng)急供能的主要細(xì)胞機制，自噬體系缺乏或突變，往往導(dǎo)致各種心肌病和心肌肥大[8-9]，而且人心衰時miR-30a也下調(diào)明顯[10]。心肌缺血再灌注過程中，缺氧階段啟動低程度自噬被認(rèn)為是應(yīng)急供能而保護心肌，這一過程表現(xiàn)以激活A(yù)MPKa為主導(dǎo)的自噬，而再灌注階段通過激活JNK導(dǎo)致過表達Beclin-1，而大量激發(fā)自噬導(dǎo)致降解過度，加重心肌損傷[11]。而在缺血性心肌病患者發(fā)現(xiàn)心肌miR-30a水平明顯下調(diào)[12]，我們在缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)miR-30a下調(diào)，推測其與再灌注中Beclin-1表達增加可能存在因果關(guān)系；而且我們在乳鼠心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)過表達miR-30a心肌在生理條件和缺氧復(fù)氧條件下都有Beclin-1蛋白下調(diào)，進一步驗證了miR-30a和Beclin-1靶向關(guān)系。由于miR-30a具有高度生物保守性，在多個物種人、大鼠、小鼠表達相同，而且在上述物種的Beclin-1基因上均有相同靶序列，所以在大鼠上的實驗結(jié)果對于人類缺血性心臟疾病更具有重要指導(dǎo)意義，見圖8。

同樣作為程序性死亡方式，自噬和凋亡間也存在拮抗和協(xié)同關(guān)系。一方面，低自噬水平激活作為保護機制，清除有害物質(zhì)，減少細(xì)胞凋亡；大量自噬導(dǎo)致細(xì)胞自我消化的自噬性死亡。凋亡啟動過程中激活的caspases可以剪切自噬基Beclin-1，剪切后形成的C端Beclin-1(Beclin-1C)可以結(jié)合線粒體，并促進細(xì)胞色素C(cytochrome C， Cyt C)釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。多個研究均發(fā)現(xiàn)自噬蛋白被凋亡相關(guān)基因剪切促進凋亡[14]。另一方面，生理條件下抗凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合Beclin-1，抑制Beclin-1自噬活性；缺血再灌注階段，激活的JNK促進Bcl-2磷酸化，而釋放Bcl-2結(jié)合的Beclin-1，這也可能是再灌注期Beclin-1主導(dǎo)自噬增加的原因[15]。我們實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-30a可下調(diào)Beclin-1，既減少自噬上游蛋白表達，阻斷過度自噬流，又減少誘發(fā)凋亡的Beclin-1C形成，可能同時減少2種類型的細(xì)胞程序性死亡。通過自噬阻斷劑3-MA阻斷過度自噬流也可以減少缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，也提示Beclin-1參與的自噬誘導(dǎo)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞死亡，其可能機制見圖8。使用PI染色發(fā)現(xiàn)miR-30a組缺氧復(fù)氧后染色較少，PI染色包括各種膜通透性改變死亡方式，包括晚期凋亡和壞死。最近文獻也認(rèn)為自噬體晚期成熟障礙加重心肌壞死[16]，但一般自噬流下游自噬體降解阻斷是主要原因，而我們的實驗結(jié)果認(rèn)為減少自噬上游自噬體過度表達可以有效減少壞死。

近年來，心肌缺血再灌注損傷中miRNA調(diào)控機制一直是研究熱點，miRNA通過結(jié)合互補mRNA，沉默或者降解mRNA。而miR-30a在心肌的這種轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控Beclin-1被認(rèn)為是一種迅速而高效的瞬間調(diào)控方式，對于缺血心肌病的診療有重要意義。但是還要考慮到miRNA可能的“一箭多靶”效應(yīng)，我們對于miR-30a在心肌缺血中的保護作用還需深入研究其它靶基因的作用。

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ProctectiveeffectofmicroRNA-30aonregulatingbeclin-1expressioninhypoxia-reoxygenatedneonatalratcardiomyocytes

YAN Hao1, XU Jian-jun1, LI Wen-lin2, ZHU Shu-qiang1, LONG Xiang1, CHE Jian-peng1, CHEN Li-ru1

(1DepartmentofCardiacSurgery,TheSecondAffiliatedHospital,2MedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:xujianjun3526@163.com)

AIM: To explore the potential mechanism of microRNA-30a (miR-30a) overexpression in neonatal rat cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation (H/R).METHODSThe miR-30a overexpression was induced in primary neonatal rat cardiomyocytes by lentivirus transfection. The cardiomyocytes were divided into 5 groups: normal group, H/R group, LV-GFP+H/R group, LV-GFP-miR-30a+H/R group and 3-methyladenine(3-MA)+H/R group. The expression level of miR-30a after lentivirus transfection and H/R was determined by real-time PCR, while the protein levels of LC3 and Beclin-1 after H/R and lentivirus transfection were detected by Western blotting. The cardiomyocyte death after H/R were measured by TUNEL and PI staining.RESULTSCompared with LV-GFP group, significant down-regulation of Beclin-1 protein level was observed in cardiomyocytes with miR-30a overexpression, while the protein levels of Beclin-1 and LC3 in the cardiomyocytes with miR-30a overexpression were down-regulated after H/R, and apoptosis of these cells were significantly decreased after H/R.CONCLUSIONThe protein level of Beclin-1 is down-regulated in cardiomyocytes with miR-30a overexpression. Inhibition of autophagy decreases the cardiomyocyte death after H/R.

Ischemia-reperfusion; Apoptosis; MicroRNA; Autophagy

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.002