張麗麗， 呂敏麗， 張慧英△， 王黎敏， 田小霞，賈建桃， 冀菁荃， 來麗娜， 宋麗華， 韓德五， JI Cheng

(長治醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室，3機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，4藥理學(xué)教研室，山西 長治 046000；山西醫(yī)科大學(xué) 2第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，5肝病研究所，山西 太原 030001； 6美國南加州大學(xué)Keck醫(yī)學(xué)院肝病研究中心，加利福尼亞州 洛杉磯 90089)

1000-4718(2012)04-0577-06

2011-03-09

2012-02-01

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81070339)；山西省國際科技合作計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2010081068)；山西省回國留學(xué)人員科研基金資助項(xiàng)目(No.2008-88)；山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金資助項(xiàng)目(No.2010-09)

△通訊作者 Tel:0355-3151441; E-mail:zhanghy2001@163.com

·論著·

GRP78在肝硬化大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥引發(fā)心臟病變中的作用*

張麗麗1， 呂敏麗2， 張慧英1△， 王黎敏3， 田小霞1，賈建桃1， 冀菁荃1， 來麗娜4， 宋麗華4， 韓德五5， JI Cheng6

(長治醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室，3機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，4藥理學(xué)教研室，山西 長治 046000；山西醫(yī)科大學(xué)2第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，5肝病研究所，山西 太原 030001；6美國南加州大學(xué)Keck醫(yī)學(xué)院肝病研究中心，加利福尼亞州 洛杉磯 90089)

目的探討葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)在肝硬化大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥引發(fā)心臟病變中的作用。方法51只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為肝硬化模型4周組、6周組、8周組和同期正常對照組。于第8周檢測大鼠心功能；檢測各組心肌組織勻漿中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和丙二醛(MDA)水平；甲苯胺藍(lán)染色和van Giesan染色分別觀察心肌細(xì)胞數(shù)量的變化和計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)；免疫組化法檢測心肌組織GRP78和缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果隨肝硬化病程進(jìn)展：(1)肝硬化8周組大鼠左室舒張末期壓(LVEDP)及左室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±LV dp/dtmax)均較對照組降低(P<0.05)；(2)心肌組織中TNF-α、MDA、CVF、GRP78蛋白和HIF-1α蛋白水平均逐漸升高并顯著高于正常對照組(P<0.05)；(3)甲苯胺藍(lán)染色顯示模型各組心肌細(xì)胞數(shù)量逐漸減少并顯著低于正常對照組(P<0.05)；(4)血漿中內(nèi)毒素水平分別與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、同型半胱氨酸(Hcy)、TNF-α、GRP78和MDA呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；(5)GRP78蛋白分別與HIF-1α、Hcy、MDA、ALT和CVF呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論肝硬化大鼠伴發(fā)的腸源性內(nèi)毒素血癥通過直接或間接作用引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和GRP78表達(dá)增加，后者可能是引起心肌重構(gòu)、導(dǎo)致心臟功能變化的關(guān)鍵分子。

肝硬化； 腸源性內(nèi)毒素血癥； 糖調(diào)節(jié)蛋白78； 心肌重構(gòu)

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(78 kD glucose-regulated protein,GRP78)又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein,BiP)，是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶[1]。在發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，GRP78可以啟動未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)信號級聯(lián)，重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的平衡，減輕各種應(yīng)激原對細(xì)胞的損害作用，使細(xì)胞能夠在變化了的環(huán)境中較好地生存下來,因而通常把GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白[2]。但在持續(xù)而又嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，GRP78又可通過誘導(dǎo)caspase-12、CHOP等促凋亡因子的表達(dá)和活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與組織損傷[3]。

由于肝臟代謝功能改變以及腸源性內(nèi)毒素血癥(intestinal endotoxemia,IETM)形成，各種急、慢性肝功能不全往往不同程度地導(dǎo)致肝外組織的損傷，包括心、肺、腦、腎等。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者的心臟常發(fā)生左房腔變大、壁變薄，左室腔擴(kuò)大、壁肥厚等結(jié)構(gòu)的改變；Valeriano等[4]利用二維多普勒超聲對肝硬化患者心臟功能進(jìn)行的評價表明，患者的收縮及舒張功能均發(fā)生障礙。迄今為止，這些變化發(fā)生的病理生理機(jī)制仍不清楚。Han[5]提出的“腸源性內(nèi)毒素血癥學(xué)說”中已經(jīng)明確闡述腸源性內(nèi)毒素血癥除了對肝臟本身形成“二次打擊”致使原有疾病加重以外，在肝硬化的各種并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮決定性作用。由此我們推測肝硬化時形成的IETM很可能是導(dǎo)致心臟病理改變的關(guān)鍵因素。心肌細(xì)胞具有豐富的肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)，內(nèi)毒素可以通過直接或間接途徑引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在復(fù)合致病因素誘導(dǎo)的動物肝硬化及其并發(fā)癥肝肺綜合征發(fā)病中發(fā)揮重要的作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵分子GRP78表達(dá)也顯著增高[7-8]。因此我們推測GRP78可能在腸源性內(nèi)毒素血癥引發(fā)肝硬化合并的心臟病理變化中起作用。本項(xiàng)研究以復(fù)合致病因素誘導(dǎo)的肝硬化大鼠為研究對象，旨在探討GRP78在腸源性內(nèi)毒素血癥引發(fā)肝硬化合并心臟病理改變中的作用，為臨床預(yù)防和治療肝硬化所致的心臟并發(fā)癥提供新思路和新途徑。

材 料 和 方 法

1材料

1.1試劑 CCl4(分析純)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；膽固醇購自天津市化學(xué)試劑公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)活性測定試劑盒和丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；內(nèi)毒素顯色基質(zhì)鱟試劑盒購自廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)有限公司；TNF-α放射免疫分析藥盒購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司；同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)ELISA檢測試劑盒購自上海門碟塔試劑公司；GRP78兔抗鼠抗體、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)兔抗鼠抗體、免疫組化染色SP試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；市售品牌白酒；市售玉米面和豬油。

1.2模型建立 清潔級成年雄性Wistar大鼠，體重200～240 g。正常對照組動物飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來水，采用復(fù)合致病因素法復(fù)制大鼠肝硬化模型[9]。

2方法

2.1心功能檢測 大鼠飼養(yǎng)8周后，經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉(3 mL/kg)，經(jīng)右側(cè)頸總動脈逆行插管至左心室腔內(nèi)，使用多媒體生物信號記錄儀系統(tǒng)，分別測量左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)及左室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±LV dp/dtmax)。

2.2心肌組織勻漿中指標(biāo)檢測 采用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)制備10%組織勻漿，TBA法檢測勻漿中TNF-α和MDA含量，蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。

2.3心肌組織病理學(xué)觀察

2.3.1苦味酸-酸性品紅(van Giesan,VG)染色進(jìn)行心肌膠原特異染色 石蠟包埋的心肌組織標(biāo)本切片行VG染色，心肌細(xì)胞呈黃色，膠原呈紅色。光學(xué)顯微鏡下觀察心肌間質(zhì)膠原纖維化變化并采用HPIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)測量心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF)，計(jì)算方法：CVF(%)=膠原面積/圖像總面積×100%,每張切片隨機(jī)選擇10個視野取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.3.2甲苯胺藍(lán)染色法觀察心肌細(xì)胞數(shù)量的變化 切片脫蠟至水，甲苯胺藍(lán)染色20 min，常規(guī)脫水透明。光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞數(shù)量變化，每張切片隨機(jī)取10個視野取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.4免疫組化法觀察GRP78和HIF-1α蛋白表達(dá)情況 取心肌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫下15 min滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水沖洗后枸櫞酸緩沖液熱修復(fù)抗原，PBS沖洗，滴加血清封閉液室溫下封閉20 min，分別滴加兔源性抗GRP78(1∶100)多克隆抗體及兔源性抗HIF-1α(1∶300)濕盒內(nèi)4 ℃過夜，PBS沖洗后滴加生物素化山羊抗兔IgG室溫下20 min，PBS沖洗，滴加鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)室溫下20 min，PBS沖洗后以DAB顯色劑進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光鏡下觀察結(jié)果，陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，與背景同色為陰性。應(yīng)用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像彩色分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每張切片隨機(jī)選取10個高倍鏡視野(×400)，分別計(jì)算陽性染色指數(shù)(positive index, PI)。PI(%)=染色陽性細(xì)胞數(shù)/視野中總細(xì)胞數(shù)×100%，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1肝硬化大鼠心臟功能的變化

心臟功能的檢測是通過反映心臟收縮和舒張功能的LVSP、LVEDP以及反映左室內(nèi)壓變化速率的±dp/dtmax來判斷。從結(jié)果可知，肝硬化8周組大鼠LVEDP和±dp/dtmax均顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠心臟功能的變化

*P<0.05vscontrol.

2心肌組織勻漿中TNF-α和MDA含量變化

肝硬化模型各組大鼠心肌組織勻漿TNF-α含量隨病程進(jìn)展逐漸升高并顯著高于正常對照組(P<0.05)，8周組與6周組相比有顯著差異(P<0.05)。MDA濃度隨病程進(jìn)展亦明顯升高(P<0.05)，模型各組間變化8周組 > 6周組 > 4周組(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠心肌組織勻漿TNF-α和MDA含量的變化

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsliver cirrhosis (4-week);△P<0.05vsliver cirrhosis (6-week).

3甲苯胺藍(lán)染色觀察心肌細(xì)胞數(shù)量變化

甲苯胺藍(lán)染色可見：正常對照組心肌細(xì)胞形態(tài)正常。肝硬化4周組心肌細(xì)胞出現(xiàn)灶狀病理改變，表現(xiàn)為輕度水腫，細(xì)胞間隙變小，邊界稍模糊；6周組心肌細(xì)胞嚴(yán)重水腫，形態(tài)大小不一；8周組呈現(xiàn)細(xì)胞大片溶解壞死，肌纖維斷裂明顯，邊界模糊。各組病變區(qū)域均可見程度不等的炎癥細(xì)胞浸潤，見圖1。使用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析軟件進(jìn)行心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞數(shù)量隨病程進(jìn)展逐漸下降，分別為4周組245.41±3.10、6周組113.84±2.77和8周組40.17±2.67，均顯著低于正常對照組(816.76±7.17)(P<0.05，n=10)，且模型8周組細(xì)胞數(shù)量顯著低于6周組(P<0.05)。

Figure 1. Comparison of the myocardial cell number(toluidine blue staining,×400). A：control；B：liver cirrhosis at the 4th week；C：liver cirrhosis at the 6th week；D：liver cirrhosis at the 8th week.

圖1肝硬化大鼠心肌細(xì)胞數(shù)量變化

4VG染色結(jié)果

VG染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察:正常心肌間質(zhì)膠原較少，模型4周組大鼠心肌細(xì)胞周圍可見少量被染成紅色的膠原纖維；6周組間質(zhì)膠原含量明顯增加，壞死的心肌細(xì)胞周圍有大量縱橫交錯的膠原纖維，排列紊亂。8周組可清晰顯示心肌纖維膠原分布于心肌壞死灶周圍，向心肌細(xì)胞間質(zhì)呈放射狀分布，見圖2。模型組的CVF分別為：4周組(5.83±0.93)%、6周組(7.47±1.04)%、8周組(12.56±2.88)%，均顯著高于正常對照組[(2.11±0.52)%](P<0.05，n=10)；模型8周組和6周組比較有顯著差異(P<0.05)。

Figure 2. Comparison of collagen in myocardial interstitium(van Giesan staining,×400).A：control；B：liver cirrhosis at the 4th week；C：liver cirrhosis at the 6th week；D：liver cirrhosis at the 8th week.

圖2肝硬化大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維化情況

5肝硬化大鼠心肌組織GRP78蛋白表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示：對照組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見少量、分布均勻的淺棕色顆粒。模型組隨病程進(jìn)展染色加深、數(shù)量增多，細(xì)胞漿內(nèi)可見濃密的深棕色顆粒，見圖3。GRP78蛋白陽性染色指數(shù)分別為4周組(0.048±0.004)%、6周組(0.070±0.020)%和8周組(0.080±0.013)%，均顯著高于正常對照組[(0.031±0.006)%](P<0.05，n=10)，且模型8周組與6周組均高于4周組(P<0.05)。

Figure 3. The expression of GRP78 protein in myocardial tissues(×400).A：control；B：liver cirrhosis at the 4th week；C：liver cirrhosis at the 6th week；D：liver cirrhosis at the 8th week.

圖3肝硬化大鼠心肌組織GRP78蛋白表達(dá)變化

6肝硬化大鼠心肌組織HIF-1α蛋白表達(dá)

HIF-1α蛋白是一種核蛋白，在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：棕色或棕褐色顆粒主要顯現(xiàn)在心肌細(xì)胞核上，呈彌散或顆粒狀或二者混合分布。著色較強(qiáng)的心肌細(xì)胞核中可見豐富的陽性反應(yīng)顆粒，核周圍胞漿內(nèi)亦有少量陽性表達(dá)，見圖4。陽性染色指數(shù)結(jié)果為：模型4周組(2.087±0.597)%、6周組(5.840±0.803)%和8周組(12.310±0.994)%，均顯著高于正常對照組[(0.929±0.171)%](P<0.05，n=10)，且模型8周組與6周組比較有顯著差異(P<0.05)。

Figure 4. The expression of HIF-1α protein in myocardial tissues(×400).A：control；B：liver cirrhosis at the 4th week；C：liver cirrhosis at the 6th week；D：liver cirrhosis at the 8th week.

圖4肝硬化大鼠心肌組織HIF-1α蛋白表達(dá)變化

7相關(guān)性分析

相關(guān)性分析可見：(1)血漿內(nèi)毒素分別與心肌組織勻漿MDA(r=0.768，P<0.05)和GRP78蛋白陽性染色指數(shù)(r=0.861，P<0.01)呈正相關(guān)；(2)GRP78蛋白陽性染色指數(shù)分別與血漿Hcy(r=0.649，P<0.05)、ALT(r=0.691，P<0.05)、心肌勻漿MDA(r=0.794，P<0.01)、CVF(r=0.826，P<0.01)和HIF-1α蛋白陽性染色指數(shù)(r=0.618，P<0.05)呈正相關(guān)。

討 論

本研究采用復(fù)合致病因素法誘導(dǎo)大鼠肝硬化，與臨床多種病因?qū)е碌母斡不辔呛希菍ζ浒l(fā)病原因以及并發(fā)癥研究的理想模型。心功能檢測發(fā)現(xiàn)肝硬化8周組大鼠心肌舒張功能出現(xiàn)明顯異常，與臨床患者的改變相吻合。同時我們觀察到在肝硬化發(fā)病過程中，隨病程進(jìn)展心肌細(xì)胞水腫、脂肪樣變性、點(diǎn)灶狀壞死、心肌細(xì)胞數(shù)量減少、心肌纖維化漸趨明顯，說明肝硬化動物合并發(fā)生了心臟的病理改變。

肝臟功能障礙損傷腸屏障功能，致使腸道細(xì)菌易位及內(nèi)毒素入血形成菌血癥和腸源性內(nèi)毒素血癥(IETM)。前述研究我們已經(jīng)證實(shí)腸源性內(nèi)毒素血癥在肝性腦病[10]、肝腎綜合征[11]和肝肺綜合征[12]發(fā)病中發(fā)揮重要作用。鑒于臨床上肝硬化患者心臟功能發(fā)生的各種病理變化，因而有理由推測腸源性內(nèi)毒素血癥在其中也起一定作用。內(nèi)毒素可以直接或間接引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6-7]。

氧化應(yīng)激是內(nèi)毒素引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的中間環(huán)節(jié)[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含有大量脂質(zhì)而且功能活躍，很容易受到ROS的攻擊，從而使其發(fā)生脂質(zhì)過氧化，進(jìn)一步激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，嚴(yán)重時導(dǎo)致細(xì)胞功能受損[13]。也有學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化并超過其自身處理能力時，可能會首先攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)使其結(jié)構(gòu)和功能受損，從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脂質(zhì)過氧化，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，繼而通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的級聯(lián)反應(yīng)，包括活化NF-κB信號通路引起心肌損傷[14]。我們認(rèn)為，腸源性內(nèi)毒素血癥發(fā)生以后，心肌組織中內(nèi)毒素含量的增高，可以吸引和趨化大量炎癥細(xì)胞的聚集，產(chǎn)生氧化應(yīng)激進(jìn)而通過某種機(jī)制激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。丙二醛是脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物，可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，同時間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。本項(xiàng)研究中肝硬化動物心肌組織丙二醛含量隨病程進(jìn)展不斷升高，且較正常對照組升高顯著(P<0.05)，證實(shí)心肌組織發(fā)生了明顯的脂質(zhì)過氧化。提示腸源性內(nèi)毒素血癥引起氧化應(yīng)激進(jìn)而激發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激很可能在肝硬化并發(fā)的心臟病理變化中發(fā)揮重要作用。

肝臟代謝功能障礙可能是肝硬化合并心臟病理改變發(fā)生的重要基礎(chǔ)。當(dāng)肝臟功能受損時，物質(zhì)代謝障礙勢必會影響到甲硫氨酸代謝，導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥(HHcy)的發(fā)生。Ji等[15]發(fā)現(xiàn)乙醇可以引起肝內(nèi)脂肪聚集、肝損傷和明顯的HHcy，同時伴有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)基因的高表達(dá)，證實(shí)了HHcy是重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激原，也是肝臟病變持續(xù)與發(fā)展的重要機(jī)制之一。同型半胱氨酸含有活潑的自由巰基，可改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微環(huán)境紊亂，影響蛋白質(zhì)的折疊使其不能順利地從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體,繼而滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路。在我們建立的肝硬化模型中動物也存在高同型半胱氨酸血癥，所以有理由推測其在肝硬化并發(fā)的心臟病變中也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的重要應(yīng)激原之一。

肝臟疾病往往合并肝肺綜合征，而且發(fā)生時間較早，缺氧是其重要病理改變。缺氧激活的HIF-1α是維持細(xì)胞和全身氧穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，是缺氧發(fā)生的重要標(biāo)志分子，也是缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1α可上調(diào)糖酵解相關(guān)的己糖激酶、醛縮酶、烯醇化酶基因表達(dá)，有利于細(xì)胞在缺氧環(huán)境下通過增強(qiáng)糖酵解途徑產(chǎn)生能量、提供組織利用以維持正常的功能。已有研究表明：心肌缺血早期即有HIF-1α表達(dá)，是引發(fā)各種應(yīng)激蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在缺血、缺氧的適應(yīng)反應(yīng)中起核心作用，被認(rèn)為是內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的始動因子和共同途徑。但是HIF-1α作用是兩面性的，其過度持續(xù)表達(dá)，則反而可以使乳酸生成過多，造成心肌細(xì)胞酸中毒，引起損傷。我們發(fā)現(xiàn)，隨肝硬化病程進(jìn)展，(1)心肌細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，同時間質(zhì)纖維含量逐漸增加；(2)心肌組織中HIF-1α與GRP78蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)。我們認(rèn)為，肝硬化早期合并發(fā)生的肝肺綜合征所致缺氧誘導(dǎo)表達(dá)的HIF-1α可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和其關(guān)鍵分子GRP78的高表達(dá)，繼而發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)，對心肌細(xì)胞的缺氧起保護(hù)作用；但隨著病情加重，嚴(yán)重而持續(xù)的缺氧所導(dǎo)致的HIF-1α過度表達(dá)則會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的嚴(yán)重反應(yīng)，通過GRP78啟動凋亡，引起心肌細(xì)胞的一系列損傷。因此認(rèn)為缺氧可能是導(dǎo)致肝硬化合并心臟病理變化的又一重要因素。

綜上所述，在肝硬化發(fā)病過程中，多種因素參與了心臟病理改變的發(fā)生，導(dǎo)致心肌工作細(xì)胞數(shù)量減少、間質(zhì)纖維化、心肌重塑，心臟功能逐漸衰退，極其容易在各種誘發(fā)因素下發(fā)生心力衰竭，危及患者生命，GRP78可能是在其中起關(guān)鍵作用的分子。因而針對GRP78對肝硬化合并心臟病變的深入研究，有利于揭示其發(fā)病機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療提供新思路和新策略。

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RoleofGRP78inalterationofmyocardiuminducedbyintestinalendotoxemiaincirrhoticrats

ZHANG Li-li1, LV Min-li2, ZHANG Hui-ying1, WANG Li-min3, TIAN Xiao-xia1, JIA Jian-tao1, JI Jing-quan1, LAI Li-na4, SONG Li-hua4, HAN De-wu5, JI Cheng6

(1DepartmentofPathophysiology,3FunctionalIntegrativeLaboratory,4DepartmentofPharmacology,ChangzhiMedicalCollege,Changzhi046000,China;2NeurologyDepartmentofTheFirstAffiliatedClinicalMedicalCollege,5InstituteofHepatology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;6ResearchCenterforLiverDisease,KeckSchoolofMedicine,UniversityofSouthernCalifornia,LosAngeles,CA90089,USA.E-mail:zhanghy2001@163.com)

AIM: To explore the role of glucose-regulated protein 78 (GRP78) in the alteration of myocardium induced by intestinal endotoxemia in cirrhotic rats.METHODSFifty-one male Wistar rats were randomly divided into liver cirrhosis groups of 4-week, 6-week and 8-week, and normal control groups at corresponding time points. The cardiac functions of the 8-week rats were measured. Tumor necrosis factor α(TNF-α) and malondialdehyde(MDA) in myocardial tissues were detected. The number of myocardial cells and the collagen volume fraction (CVF) were determined with toluidine blue and van Giesan staining, respectively. The expression of GRP78 and hypoxia-inducible facotr 1α(HIF-1α) was analyzed by the method of immnunohistochemistry.RESULTSCompared with normal control group at corresponding time point, left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP) and ±LV dp/dtmaxin 8-week group were significantly decreased (P<0.05). The levels of TNF-α, MDA and CVF, the protein expression of GRP78 and HIF-1α in the myocardial tissues were significantly increased in every model group (P<0.05), and the number of myocardial cells was gradually decreased (P<0.05). Elevated levels of endotoxin in plasma were positively correlated with the levels of alanine aminotransferase (ALT),homocysteine (Hcy) and TNF-α in plasma, the levels of TNF-α, MDA and CVF, and protein levels of GRP78 and HIF-1α in the myocardial tissues (P<0.05). Elevated protein expression of GRP78 in the myocardial tissues was positively correlated with the levels of ALT, Hcy in plasma and MDA, CVF, HIF-1α protein in the myocardial tissues (P<0.05).CONCLUSIONIntestinal endotoxemia induced by liver cirrhosis may directly or indirectly lead to endoplasmic reticulum stress and overexpression of GRP78. GRP78 may be a key molecule in the pathogenesis of myocardial remodeling and functional alteration induced by liver cirrhosis.

Liver cirrhosis; Intestinal endotoxemia; Glucose-regulated protein 78; Myocardial remodeling

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.001