韓 冰， 謝汝佳， 洪 琴， 張成俊， 楊 勤， 程明亮

(貴陽醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，貴州 貴陽 550004)

1000-4718(2012)09-1639-05

2012-03-23

2012-07-25

貴州省科技國際合作項目(No.黔科合G字【2011】7013號)

△通訊作者 Tel:0851-6908578;E-mail:hanbing791203@163.com

肝纖維化病理過程中ZEB1和ZEB2的動態(tài)表達(dá)變化及意義*

韓 冰△， 謝汝佳， 洪 琴， 張成俊， 楊 勤， 程明亮

(貴陽醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，貴州 貴陽 550004)

目的觀察慢性肝損傷致肝纖維化過程中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)調(diào)節(jié)蛋白鋅指E盒結(jié)合同源盒蛋白(ZEB)1和ZEB2的動態(tài)表達(dá)變化并探討其調(diào)節(jié)機(jī)制。方法雄性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為正常對照組、2周、4周、6周和8周模型組，每組各8只，模型組按3 mL/kg體重的劑量皮下注射60%CCl4，每隔3 d注射1次，處死大鼠后測定肝臟指數(shù)、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性,觀察肝組織病理改變；免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中ZEB1、ZEB2、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)情況；real-time RT-PCR方法檢測肝臟組織中ZEB1及ZEB2 mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果模型各組大鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性顯著高于正常對照組(P<0.01)，8周模型組肝纖維化明顯；隨著肝臟損傷逐漸加重，纖維化程度加深，E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著降低，α-SMA蛋白表達(dá)顯著升高，ZEB1和ZEB2蛋白和mRNA表達(dá)量也逐漸增加，8周模型組肝組織中ZEB1和ZEB2蛋白(46.42±14.36和57.71±13.32)與mRNA(189.00±47.39和277.28±48.55)表達(dá)較正常組顯著增加(P<0.01)。結(jié)論ZEB1和ZEB2蛋白及mRNA表達(dá)量隨纖維化程度的加重而增加，提示EMT可能通過ZEB1和ZEB2參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

肝纖維化； 慢性肝損傷； 鋅指E盒結(jié)合同源盒蛋白

鋅指E盒結(jié)合同源盒蛋白(zinc finger E-box binding homeobox protein，ZEB)是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，包含2個成員ZEB1和ZEB2，ZEB2又稱Smad相互作用蛋白1(Smad-interacting protein 1，SIP1)，由于都具有相同鋅指結(jié)構(gòu)而能與含有CACCT的E-box序列和CACCT(G)的E-box相似序列結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。目前已知ZEB1和ZEB2能與上皮細(xì)胞內(nèi)的E鈣黏蛋白(E-cadherin)基因的啟動子序列中的E-box(CACCTC/G)序列結(jié)合而抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生[1]。EMT是指原本緊密排列的上皮細(xì)胞在某種因素的作用下轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞的過程。近年的研究發(fā)現(xiàn)，EMT除與肺纖維化和腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制有關(guān)外[2-3]，還參與了肝纖維化發(fā)生發(fā)展。但目前有關(guān)EMT通過其調(diào)控因子ZEB1和ZEB2參與調(diào)控慢性肝損傷及肝纖維化發(fā)病機(jī)制的研究鮮有報道。因此，本研究通過大鼠慢性肝損傷致肝纖維化模型，觀察慢性肝損傷發(fā)生致肝纖維化形成過程中，肝組織中ZEB1、ZEB2、E-cadherin和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的動態(tài)表達(dá)變化，探討慢性肝損傷及肝纖維化發(fā)病過程中肝臟EMT變化特點及其通過ZEB1和ZEB2調(diào)控其發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物與主要試劑 清潔級雄性Wistar大鼠40只,體重(200±20)g,購自貴陽醫(yī)學(xué)院動物實驗中心， ZEB1、ZEB2、E-cadherin和α-SMA多克隆抗體購自北京博奧森生物試劑公司；免疫組化EnvisionⅡ抗檢測試劑盒購自Gene；TRIzol購自Invitrogen，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas，SYBR Green購自Applied Biosystems，ZEB1和ZEB2的引物由TaKaRa公司代為設(shè)計合成。

1.2模型制備與分組 實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成4組，每組8只，按3 mL/kg體重的劑量皮下注射60%CCl4，每隔3 d注射1次，同時正常飼料喂養(yǎng)，分別于喂養(yǎng)2周、4周、6周、8周后處死；另設(shè)正常對照組，共8只大鼠，給予正常飼料喂養(yǎng)，按3 mL/kg體重的劑量皮下注射生理鹽水每隔3d注射1次，分別于2周、4周、6周、8周各處死2只；所有處死大鼠收集血液及肝臟標(biāo)本待測相關(guān)指標(biāo)。

2方法

2.1計算肝臟指數(shù) 肝臟指數(shù)=肝臟重量(mg)/體重(g)。

2.2血清生化指標(biāo)檢測 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測采用Siemens Advia 1650全自動生化分析儀測定。

2.3病理學(xué)觀察 取同一部位肝葉，常規(guī)石蠟包埋切片，行HE及Van Gieson(VG)染色，光鏡下觀察肝臟病理變化，參照纖維化分級法[4]進(jìn)行膠原纖維增生程度半定量分析。

2.4肝組織ZEB1、ZEB2、E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)檢測 采用Envision兩步法按照試劑盒說明操作。陰性對照以PBS液代替I抗。結(jié)果判定：ZEB1、ZEB2和α-SMA光鏡下觀察胞漿染成棕黃色的細(xì)胞為陽性，E-cadherin光鏡下觀察胞核染成棕黃色的細(xì)胞為陽性。400倍下觀察不少于5個高倍鏡視野，記數(shù)陽性細(xì)胞個數(shù)并計算陽性細(xì)胞所占百分比(使用Olympus Image-Pro Plus圖像分析軟件系統(tǒng)完成：采集400倍視野下5張圖片，然后通過軟件統(tǒng)計每張圖片上的陽性細(xì)胞數(shù)并計算陽性百分率)。

2.5肝組織ZEB1和ZEB2 mRNA表達(dá)量檢測 采用實時熒光定量RT-PCR的方法檢測，用TRIzol提取大鼠肝臟的總RNA，隨后采用紫外分光光度法進(jìn)行質(zhì)量控制及確定濃度。各取1μg總RNA為逆轉(zhuǎn)錄模板，使用ZEB1、ZEB2特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為:25 ℃ 10 min； 48 ℃ 60 min； 95 ℃ 5 min。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40 個循環(huán)。PCR 反應(yīng)在實時定量PCR 儀進(jìn)行檢測， 以β-actin作為內(nèi)參照，2-ΔΔCt為目的基因的相對表達(dá)強(qiáng)度,所有樣本均重復(fù)3孔。具體引物序列如下：β-actin上游引物5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’；ZEB1 上游引物5’-TGGCAAGACAACGTGAAAGA-3’，下游引物5’-AACTGGGAAAATGCATCTGG-3’；ZEB2 上游引物 5’-TAGCCGGTCCAGAAGAAATG-3’，下游引物5’-GGCCATCTCTTTCCTCCAGT-3’。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1各組大鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性的變化

模型組2周組大鼠肝臟指數(shù)均高于正常組大鼠(P<0.05)；4周組、6周組和8周組大鼠肝臟指數(shù)均顯著高于正常組大鼠(P<0.01)；模型各組大鼠血清AST和ALT活性均較正常組大鼠顯著增加(P<0.01)，見表1。

表1各組大鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性

GroupLiverindex(mg/g)ALT(U/L)AST(U/L)Normal3．10±0．1652．00±11．26121．00±19．032-weekmodel4．10±0．14?549．00±30．26?? 550．00±36．25??4-weekmodel4．21±0．70??727．00±249．70?? 616．00±209．98??6-weekmodel4．98±0．36??920．00±303．33?? 879．00±248．56??8-weekmodel5．43±0．90??1260．00±579．25?? 1167．00±318．18??

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group.

2肝臟病理變化

各組大鼠肝組織經(jīng)HE及VG染色，光鏡下可見正常組大鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，無膠原纖維增生；模型2周組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不一脂肪滴，部分氣球樣變，呈脂性肝炎表現(xiàn)；模型4周組大鼠肝細(xì)胞脂肪樣變明顯，可見部分空泡樣變，以微泡型為主，少數(shù)細(xì)胞為大泡型改變，少量匯管區(qū)可見纖維結(jié)締組織輕度增生；模型6周組大鼠肝細(xì)胞以大泡型脂肪變明顯，匯管區(qū)可見較多纖維結(jié)締組織增生，少量炎性細(xì)胞浸潤，假小葉形成不明顯；模型8周組大鼠肝細(xì)胞脂肪樣變嚴(yán)重，呈廣泛大泡型改變，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織大量增生，內(nèi)有較多炎性細(xì)胞浸潤，膠原纖維形成纖維間隔，可見假小葉形成。病理學(xué)半定量結(jié)果顯示，模型2周組病理改變與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，模型4周組病理學(xué)改變與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型6周和8周組病理學(xué)改變與正常組相比有明顯差異(P<0.01)，說明纖維化變明顯，見圖1、表2。

Figure 1. HE staining of rat hepatic tissues in each group (×400).A：normal group; B:2-week model group; C: 4-week model group; D: 6-week model group; E:8-week model group.

圖1各組大鼠肝組織HE染色結(jié)果

表2 各組大鼠肝纖維化程度分級

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group.

3肝組織E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)的變化

正常對照組大鼠肝組織未見α-SMA蛋白陽性表達(dá)，而E-cadherin蛋白則廣泛表達(dá)于正常對照組大鼠肝細(xì)胞，光鏡下可見細(xì)胞核染色棕黃；α-SMA蛋白隨著模型組大鼠肝臟肝損傷程度的加重及肝纖維化的發(fā)生而表達(dá)逐漸增加，在模型4周、6周、8周組大鼠肝組織中α-SMA蛋白表達(dá)于部分肝細(xì)胞及大量纖維間隔，較空白對照組表達(dá)明顯增加(P<0.01)；E-cadherin蛋白在肝細(xì)胞胞核內(nèi)隨著肝損傷及纖維化程度的加重而表達(dá)明顯減少，模型6周和8周組E-cadherin蛋白僅在組織部分結(jié)構(gòu)相對完好區(qū)域的部分肝細(xì)胞內(nèi)見少量表達(dá)，較正常對照組顯著降低(P<0.01)，見圖2、表3。

Figure 2. Expression of α-SMA and E-cadherin in rat hepatic tissue of each group.A：normal group(α-SMA); B:4-week model group (α-SMA); C: 8-week model group (α-SMA); D: normal group (E-cadherin); E: 4-week model group (E-cadherin); F: 8-week model group (E-cadherin).

圖2各組大鼠肝組織α-SMA和E-cadherin免疫組化結(jié)果

表3各組大鼠肝臟中α-SMA和E-cadherin的表達(dá)

Groupα-SMAE-cadherinNormal1．72±0．0690．48±4．922-weekmodel2．17±0．1886．28±6．354-weekmodel7．88±0．25??82．11±7．286-weekmodel19．78±4．28??24．37±3．25??8-weekmodel37．84±7．04??19．52±4．25??

**P<0.01vsnormal group.

4各組大鼠肝組織ZEB1和ZEB2蛋白及mRNA表達(dá)變化

正常對照組ZEB1/ZEB2蛋白表達(dá)較少，模型2周和4周組ZEB1和ZEB2蛋白及mRNA表達(dá)量較

正常對照組有所升高，但無顯著差異；而模型6周和8周組大鼠肝組織中可見ZEB1/ZEB2蛋白廣泛在小葉內(nèi)氣球樣變的肝細(xì)胞及纖維化的肝細(xì)胞胞漿中，呈強(qiáng)陽性表達(dá)，色棕黃色，mRNA表達(dá)量也相應(yīng)升高，與正常對照組表達(dá)量存在顯著差異(P<0.01)，見圖3、表4。

Figure 3. Expression of ZEB1/ZEB2 in rat hepatic tissue of each group. A：normal group; B: 8-week model group (ZEB1); C: 8-week model group (ZEB2).

圖3各組大鼠肝組織ZEB1和ZEB2免疫組化結(jié)果

表4 各組大鼠肝臟中ZEB1/ZEB2蛋白和mRNA的表達(dá)

**P<0.01vsnormal group.

討 論

EMT是指上皮實質(zhì)細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，也就是上皮細(xì)胞失去其上皮表型特征而逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞表型特征的過程[5]。纖維化被認(rèn)為是器官受到慢性損傷時的一種創(chuàng)傷愈合過程，在正常生理情況，如果損傷愈合，由于炎癥逐漸減弱，EMT也會隨之停止，從而完成修復(fù)過程；但是如果炎癥不斷刺激，使EMT持續(xù)存在，則可生成過量肌成纖維細(xì)胞(MFLC)，產(chǎn)生過多細(xì)胞外基質(zhì)，便會導(dǎo)致器官纖維化[5-6]。本研究通過CCl4復(fù)制慢性肝損傷致肝纖維化模型，觀察病程演變過程中EMT動態(tài)變化。通過對上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin及間質(zhì)標(biāo)志蛋白α-SMA在各組大鼠肝臟組織中動態(tài)變化的觀察，發(fā)現(xiàn)隨著肝損傷及肝纖維化程度的加重，E-cadherin呈表達(dá)逐漸減少趨勢，α-SMA表達(dá)則呈明顯增加趨勢，特別是模型8周組大鼠肝臟組織中E-cadherin及α-SMA表達(dá)皆與正常對照組有顯著差異。因此實驗結(jié)果表明在肝纖維化形成過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)逐漸減少而間質(zhì)細(xì)胞特征蛋白表達(dá)逐漸增多，提示EMT參與了慢性肝損傷及肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程，并且隨著損傷程度的加重EMT的作用也相應(yīng)加強(qiáng)。

雖然有研究表明，人轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)和Wnt等信號蛋白可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，但是其介導(dǎo)EMT在纖維化中的作用卻不甚明了，考慮和具體的組織器官及其所處的微環(huán)境有關(guān)[7-8]。在肝纖維化研究中發(fā)現(xiàn)，靜息肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的過程類似EMT[9]。有學(xué)者研究了不同來源的肌成纖維細(xì)胞樣肝星狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們均共同表達(dá)間質(zhì)及上皮祖細(xì)胞標(biāo)志[10]。除了肝星狀細(xì)胞之外，成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的EMT以及骨髓來源的干細(xì)胞也發(fā)揮了重要作用[9]。Dooley等[11]研究表明肝細(xì)胞可被TGF-β1/Smad信號通路激活發(fā)生EMT，并表達(dá)I型膠原蛋白，提示肝細(xì)胞的EMT與肝纖維化密切相關(guān)。雖然目前肝纖維化中EMT的正向調(diào)控機(jī)制尚不清楚，但是由于E-cadherin表達(dá)的下降和缺失是EMT最重要的生物學(xué)特征，因此通過調(diào)解E-cadherin表達(dá)而參與EMT的調(diào)節(jié)機(jī)制成為研究熱點。ZEB1和ZEB2能通過與E-cadherin基因啟動子上的CACCT(G)序列結(jié)合抑制其表達(dá)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去其表型特征轉(zhuǎn)化成為間質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致EMT的發(fā)生[12]。ZEB1可抑制多種重要的上皮分化和細(xì)胞黏附因子，包括細(xì)胞極性基因Crumbs3(Crb3)、HUGL2(human lethal giant larvae homologue 2)和Pals1(protein associated with Lin seven 1)相關(guān)的緊密連接蛋白，從而抑制E-cadherin，誘發(fā)EMT[13]。本研究在觀察慢性肝損傷致肝纖維化過程中EMT動態(tài)變化的同時，還觀察了在各組大鼠肝臟組織中ZEB1、ZEB2蛋白及mRNA表達(dá)量的變化，結(jié)果提示ZEB1、ZEB2在蛋白和基因水平隨著慢性肝損傷的發(fā)生及肝纖維化的形成，表達(dá)量也相應(yīng)增加，表達(dá)變化趨勢與E-cadherin的變化趨勢相反，進(jìn)一步驗證ZEB家族可通過抑制E-cadherin的表達(dá)而促進(jìn)EMT的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期的研究已發(fā)現(xiàn)CCl4可引發(fā)大鼠肝細(xì)胞TGF-β/Smad信號通路的激活，而ZEB家族已被證實與如TGF-β/ Smad、MAPK等多條參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的信號通路存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系，因此我們推測在肝纖維化發(fā)生過程中，肝細(xì)胞EMT發(fā)生的可能機(jī)制是TGF-β/Smad信號通路激活ZEB1和ZEB2表達(dá)，ZEB1和ZEB2進(jìn)一步抑制肝細(xì)胞表達(dá)E-cadherin，促進(jìn)肝細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞特征蛋白α-SMA等，同時轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的肌成纖維細(xì)胞表達(dá)大量的細(xì)胞外基質(zhì)如Ⅰ型膠原蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積最終導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生。因此探明ZEB家族蛋白在肝纖維化發(fā)生機(jī)制中的作用，對闡明EMT與肝纖維化發(fā)生發(fā)展及相互調(diào)節(jié)關(guān)系有重要作用，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制正在后續(xù)研究中。

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DynamicchangesofZEB1andZEB2duringdevelopmentofliverfibrosisinducedbychronicliverinjuryinrats

HAN Bing, XIE Ru-jia, HONG Qin, ZHANG Cheng-jun, YANG Qin, CHENG Ming-liang

(DepartmentofPathophysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China.E-mail:hanbing791203@163.com)

AIM: To observe the dynamic changes of zinc finger E-box binding homeobox 1 (ZEB1) and zinc finger E-box binding homeobox 2 (ZEB2) during the development of liver fibrosis induced by chronic liver injury in rats.METHODSForty male Wistar rats weighing 180～220 g were divided intonormal control group and 4 model groups. The rats in model groups were induced by hypodermic injection of CCl4at a dose of 3 mL/kg and once per 3 days for 2 weeks, 4 weeks, 6 weeks and 8 weeks, respectively. The liver index and serum levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were analyzed. The liver fibrosis was observed under microscope. Additionally, the expression of ZEB1, ZEB2, E-cadherin and α-smooth muscle actin(α-SMA) SMA at protein level was determined by immunohistochemistry. The mRNA expression of ZEB1 and ZEB2 was detected by real-time RT-PCR.RESULTSThe liver index and the serum levels of ALT and AST in the 4 model groups were obviously higher than those in normal control group. The apparent liver fibrosis was observed in 8-week model group. The protein levels of α-SMA (37.84±7.04), ZEB1 (46.42±14.36) and ZEB2(57.71±13.32), and mRNA expression of ZEB1 (189.00±47.39) and ZEB2 (277.28±48.55) in the livers of 8-week model rats were obviously higher than those in the control rats (P<0.01). The protein level of E-cadherin in the liver of 8-week model rats was obviously lower than that in the control rats (P<0.01).CONCLUSIONIn the process of liver fibrosis induced by CCl4, the obvious changes of ZEB1/ZEB2 may play an important role in chronic liver injury and liver fibrosis.

Liver fibrosis; Chronic liver injury; Zinc finger E-box binding homeobox protein

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.018