顏 玲， 黃德彬， 劉錦紅, 周慶華

(1湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000； 2荊楚理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434000)

1000-4718(2012)09-1610-08

2012-03-30

2012-07-06

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2008ABA197)

△通訊作者 Tel: 0718-8437479；E-mail：hdb66910@163.com

黃芪多糖對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)中HSP70、PKB和P53蛋白表達(dá)的影響*

顏 玲1△， 黃德彬1， 劉錦紅1, 周慶華2

(1湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2荊楚理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434000)

目的探究黃芪多糖(AP)改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能和阻止腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制。方法將120只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(SOG)、模型組(MG-1 d、3 d、7 d)、低劑量AP治療組(L-APTG-1 d、3 d、7 d)和高劑量AP治療組(H-APTG-1 d、3 d、7 d)。MG和APTG阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈形成缺血性腦損傷后，L-APTG和H-APTG分別腹腔注射AP 5 mg·kg-1和15 mg·kg-1。于1 d、3 d和7 d分別腦血流再灌注，神經(jīng)功能缺損評(píng)分后處死取材，電鏡觀察神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變化，流式細(xì)胞術(shù)分析神經(jīng)元凋亡，免疫組化和Western blotting法檢測(cè)腦皮質(zhì)神經(jīng)元熱休克蛋白70(HSP70)、蛋白激酶B和P53蛋白表達(dá)。結(jié)果H-APTG神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡數(shù)顯著低于MG和L-APTG(P<0.05)；電鏡下神經(jīng)元結(jié)構(gòu)(核糖體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核仁、高爾基復(fù)合體、線粒體等)優(yōu)于MG和L-APTG；在1 d、3 d和7 d，H-APTG腦皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70和PKB蛋白表達(dá)顯著高于L-APTG，后者又顯著高于MG(P<0.05)；H-APTG P53蛋白表達(dá)顯著低于L-APTG，后者又顯著低于MG(P<0.05)。結(jié)論AP能改善腦缺血再灌注神經(jīng)功能損傷和抑制神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制與促進(jìn)腦皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70和PKB蛋白表達(dá)，抑制P53蛋白表達(dá)有關(guān)。

腦缺血再灌注; 黃芪多糖; 大腦皮質(zhì); 熱休克蛋白70; 蛋白激酶β; 抑癌蛋白P53

腦缺血可導(dǎo)致持續(xù)缺血缺氧，繼而引起原發(fā)缺血性損傷和繼發(fā)缺血再灌注性損傷，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞不可逆的壞死與凋亡[1]。臨床表現(xiàn)為難以恢復(fù)的腦損傷后遺癥。目前對(duì)其治療方法主要是通過(guò)促進(jìn)缺血區(qū)腦組織供血、保護(hù)腦組織和加速腦組織重建等。但這些仍未有充分的證據(jù)證實(shí)其有效性。黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide，AP)有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化和延緩衰老作用[1]。我們?cè)芯堪l(fā)現(xiàn)AP能調(diào)控海馬部分神經(jīng)遞質(zhì)和c-fos mRNA表達(dá)[1]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AP能顯著減少腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡，穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)其超微結(jié)構(gòu)，與增加熱休克蛋白70(heat-shock protein 70，HSP70)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)蛋白表達(dá)有關(guān)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 經(jīng)過(guò)行為學(xué)篩選合格的封閉群雄性Wistar大鼠120只(180～220 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.2器材與試劑 石蠟包埋機(jī)(EG1150-H)、切片機(jī)(RM2245)和顯微鏡(DM2000)均為L(zhǎng)eica產(chǎn)品。Pharmacia Gene Quant II型 RNA/DNA 檢測(cè)儀(Pharmacia Gene Quant Pro)。S-450D超聲波細(xì)胞破碎儀(PhD國(guó)際科技有限公司)。TP600型PCR基因擴(kuò)增儀(TaKaRa)。3K30型低溫高速離心機(jī)(Sigma)。F200酶標(biāo)儀(帝肯)。流式細(xì)胞儀(ELITEESP， Coulte)。臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Heraus)。電泳儀及電泳槽(江蘇儀器廠)。超低溫冰箱(SANYO)。倒置熒光顯微鏡(Leica)。Du-7500 紫外分光光度計(jì)(Beckman)。H-600透射電鏡(日立)。BH-2光學(xué)顯微鏡(Olympus)。全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)思博名科學(xué)器材公司)。AP(Sigma-Aldrich)。氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC，Sigma-Aldrich)。水合氯醛(上海金貿(mào)泰化工有限公司)。RNA酶A(RNase A，Sigma)。SP免疫組化檢測(cè)試劑盒(博士德生物工程有限公司)。

2方法

2.1動(dòng)物處理與神經(jīng)功能分級(jí)[2-3]10%水合氯醛(350 mg·kg-1，ip)麻醉仰臥位固定，右腹股溝切開(kāi)暴露股動(dòng)脈插管采血(作對(duì)照分析)后備用。頸正中縱行切口(1～1.5 cm)逐層分離，充分暴露右頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。選取90只大鼠作為右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞模型(right middle cerebral artery occlusion，RMCAO)，在頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，同時(shí)結(jié)扎勁總動(dòng)脈近心端，以動(dòng)脈夾阻流遠(yuǎn)心端，并于近心端與遠(yuǎn)心端之間預(yù)置一縫合絲線后，在勁總動(dòng)脈上剪一“V”字形切口。用Longa和Nagasawa線栓法[3]，以酒精燈燒灼單股尼龍絲線(直徑0.235 mm，長(zhǎng)2 cm)，使其前端光滑呈圓球狀并消毒后，將絲線栓球面端插入“V”字形切口，將頸內(nèi)動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾松開(kāi)，順勢(shì)將絲線栓由勁總動(dòng)脈緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至大腦中動(dòng)脈起始部，略有阻力感即停止(插入線栓長(zhǎng)度自頸外與頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處至大腦中動(dòng)脈起始部約為18 mm±1 mm)，阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈血供[4]。隨即扎緊預(yù)置在勁總動(dòng)脈上的縫合絲線(防止線栓滑脫和出血)，將各組織復(fù)位，逐層縫合。棄用術(shù)中呼吸困難、出血過(guò)多的大鼠。另30只大鼠作為假手術(shù)組(sham operation group,SOG)僅僅只將栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈6 mm，而未達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部。各組動(dòng)物室溫均保持在25 ℃左右，維持正常肛溫為(37±0.5)℃。分別于動(dòng)物意識(shí)恢復(fù)后30 min，藥物治療1 d、3 d、7 d斷頭取血前12 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)功能障礙；1分：左前爪外展不充分；2分：左轉(zhuǎn)圈式行走;3分：左傾倒式行走;4分：無(wú)法自主行走伴有意識(shí)障礙。

2.2動(dòng)物分組及治療 RMCAO中篩選出1～3分合格大鼠共72只，隨機(jī)分成3組模型組(MG-1 d、3 d、7 d，n=8)、3組低劑量AP治療組(L-APTG-1 d、3 d、7 d，n=8)和3組高劑量AP治療組(H-APTG-1 d、3 d、7 d，n=8)。SOG中篩選出1～3分合格大鼠共27只，隨機(jī)分成3組假手術(shù)組(SOG-1 d、3 d、7 d，n=9)。L-APTG和H-APTG術(shù)后分別每天2次 AP 5 mg·kg-1和15 mg·kg-1(ip,以生理鹽水稀釋成2 mL)，直至處死取材。SOG和MG術(shù)后每天2次注射等容量生理鹽水(ip)。

2.3HE染色與透射電鏡觀察 分別于術(shù)后1 d、3 d和7 d，最后1次腹腔注射藥物后，禁食12 h斷頭取血，使頭置于冰塊上開(kāi)顱取出腦，迅速置于墊有冰盤的濾紙上，以生理鹽水沖洗3～5次后，剝離出大腦皮層，左側(cè)大腦皮層組織作為對(duì)照切片。生理鹽水沖洗3～5次，分別取出部分大腦皮層額葉、頂葉、枕葉以及視交叉。用LKBⅢ型超薄切片機(jī)從前至后連續(xù)冠狀切片各3張(5～8 μm)，放入4%多聚甲醛固定液中固定24 h后，石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。取出相應(yīng)腦皮質(zhì)組織以2%戊二醛溶液固定24 h后，PBS(0.1 mol/L)漂洗，1%鋨酸固定(1.5 h)，用丙酮和乙醇逐級(jí)脫水，環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹(shù)脂(Epon 812)等比混合浸透和包埋，超薄切片機(jī)切片(50～70 nm)，醋酸鈾和檸檬酸鉛后染色電鏡下觀察和拍片。

2.4細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 于各時(shí)點(diǎn)分別取出少量大腦額頂葉皮質(zhì)(60 mg)于冰盤上用眼科剪剪碎，將碎片組織置于300目銅網(wǎng)，以PBS液沖洗3次，制成單細(xì)胞懸液(網(wǎng)搓法)，加入PBS(0.1 mol/L)稀釋成10 mL，反復(fù)30次吹打后，沉淀10 min，再經(jīng)10 min離心(3 000 r/min)，棄去上清液，加冷卻的乙醇5 mL (75%)混勻，于4 ℃冰箱靜置12 h后， 經(jīng)10 min離心(3 000 r/min)，第2次棄上清液。加入PBS(0.1 mol/L)5 mL稀釋混均，再次離心10 min，棄上清液。吸取沉淀物，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×109·L-1，吸取取細(xì)胞懸液1 mL加入1.6 mL RNase (1 g·L-1)，置入水浴箱中，孵育30 min(37 ℃)后離心 10 min，吸取沉淀物加到PBS 0.4 mL中稀釋，加200 μL PI染色液染色30 min(4 ℃，通光)。上流式細(xì)胞儀，繪制DNA含量圖，以G1峰前亞二倍體峰(Ap)百分比作為細(xì)胞凋亡率(功率300 mW，離子激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm)。其染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件處理。剩下腦皮質(zhì)組織分別迅速放入5 mL的清潔塑料離心管，置于冰箱備用(-85 ℃)，分別檢測(cè)腦皮質(zhì)勻漿HSP70、PKB和P53蛋白表達(dá)。

2.5腦皮質(zhì)HSP70、PKB和P53蛋白表達(dá)的測(cè)定

2.5.1免疫組化測(cè)定 玻片以3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane，APES)掛膠和撈片后，上烤片機(jī)1 h(60 ℃)，經(jīng)過(guò)一系列的固定、脫水、透明、包埋和切片后，于載玻片上(經(jīng)過(guò)防脫片劑處理)放入烤箱(24 h，60 ℃)，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。石蠟切片脫蠟水化?%H2O2室溫孵育15 min，分別以蒸餾水和PBS各沖洗3次(每次5 min)，中低火微波修復(fù)抗原(15 min)，冷卻至室溫。以PBS沖洗3次，滴入Ⅰ抗工作液(HSP70、PKB和P53濃度分別為1∶100、1∶20和1∶50)。置于4 ℃冰箱24 h，以PBS沖洗3次后，滴入山羊抗兔IgG抗體，室溫下經(jīng)過(guò)20 min孵育，以PBS沖洗3次，DAB 底物工作液滴于切片上，顯微鏡下控制顯色，自來(lái)水終止顯色反應(yīng)。乙醇梯度脫水，用二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片后觀察。將棕黃色的細(xì)胞核或細(xì)胞漿定為陽(yáng)性細(xì)胞。光鏡放大400倍，選擇5個(gè)不重疊的缺血梗死灶周邊區(qū)皮質(zhì)視野作為計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，記錄每100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的平均值。

2.5.2Western blotting測(cè)定 將樣品放入4 ℃預(yù)冷處理后的勻漿器，以PBS勻漿至清澈后去除上清液，加入裂解緩沖液裂解約40 min后，離心15 min(12 000 r/min)取上清分裝。以BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。于提取的蛋白樣品中加入等體積2×loading buffer混勻。變性處理(100 ℃沸水中煮3 min)后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?2% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，HSP70、PKB和P53蛋白分別按每孔蛋白上樣量為50 μg、30 μg和20 μg，以積層膠80 V、分離膠120 V恒壓分別電泳，待溴酚藍(lán)移至膠底部后終止電泳。以甲醇將PVDF膜激活1 min后轉(zhuǎn)膜，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h(4 ℃)，將凝膠上蛋白質(zhì)移至PVDF膜上。待轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，以TBST脫脂奶粉(5%)封閉液封閉PVDF膜2 h后，加入相應(yīng)兔抗HSP70、PKB和P53多克隆抗體(1∶1 000) 、β-actin (1∶600) 4 ℃過(guò)夜。用5%TBST洗滌3次(15 min×1次，10 min×2次)，Ⅱ抗以生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2 000)孵育1 h，再以5%TBST洗3次(每次5 min)，經(jīng)ECL 發(fā)光試劑盒顯影，X射線底片曝光。以β-actin為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次后，將蛋白印跡顯影圖像掃描。用Quantity One軟件半定量分析，用相應(yīng)蛋白灰度值與內(nèi)參照β-actin灰度值比值表示各組樣品相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1AP對(duì)RMCAO大鼠神經(jīng)功能缺損的影響

除SOG外，各大鼠麻醉清醒后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀。表現(xiàn)為：左側(cè)肢體無(wú)力，行走時(shí)左傾斜或左轉(zhuǎn)圈，少數(shù)出現(xiàn)意識(shí)障礙，不能行走；右側(cè)眼裂變窄，瞳孔縮小(Horner’s征陽(yáng)性)；提尾時(shí)左前肢活動(dòng)障礙，左前爪不能全伸展，有的后肢屈曲。隨給藥時(shí)間的變化，大鼠神經(jīng)功能缺損也隨之變化。術(shù)后1 d、3 d和7 d，H-APTG神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著低于其它各組(P<0.05或P<0.01)；術(shù)后3 d和7 d，L-APTG神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著低于MG(P<0.05)，表明AP對(duì)腦缺血再灌注引起的腦神經(jīng)功能缺損有改善作用，而且呈劑量依賴性，見(jiàn)表1。

表1AP對(duì)RMCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

Groupn30min1d3d7dSOG90000MG82．53±0．522．48±0．362．36±0．541．97±0．18L-APTG82．68±0．682．29±0．532．07±0．61?1．46±0．24?H-APTG82．57±0．492．12±0．39?1．62±0．43?△1．03±0．17?△

*P<0.05vsMG and SOG；△P<0.05vsL-APTG.

2術(shù)后7dAP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)病理學(xué)變化的影響

2.1HE染色觀察結(jié)果 術(shù)后7 d，MG大腦皮質(zhì)神經(jīng)纖維仍有大量空泡，部分變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞被吸收，很多細(xì)胞著色變淺，排列紊亂，部分細(xì)胞膜與周圍融合，多數(shù)細(xì)胞核固縮，核仁幾乎全部消失，梗死灶的外周可見(jiàn)大量凋亡的細(xì)胞和皺縮的細(xì)胞漿，細(xì)胞核明顯固縮集邊；與MG相比，L-APTG病理改變明顯減輕，大腦皮質(zhì)僅見(jiàn)少量散在的神經(jīng)纖維空泡，明顯少于MG，其散亂的細(xì)胞排列、水腫的組織、暗淡的著色、縮小的細(xì)胞以及固縮的細(xì)胞核數(shù)量顯著少于MG，而多于H-APTG，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Effects ofAstragaluspolysaccharide on histopathological changes of cerebral cortex in rats (HE staining，×200).

圖1AP對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)病理學(xué)改變的影響

2.2透射電鏡觀察結(jié)果 術(shù)后7 d，MG大腦皮質(zhì)細(xì)胞膜模糊，細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量空泡；細(xì)胞核皺縮成馬蹄形或分葉狀，所有染色質(zhì)凝聚成各種形態(tài)，附于核膜外周，染色加深；細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器明顯變形、減少或消失，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)模糊或缺失；可見(jiàn)氣球樣腫脹的線粒體，嵴少甚至缺失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)幾乎消失，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)模糊不清或不連續(xù)，甚至消失；L-APTG大腦皮質(zhì)細(xì)胞膜大多模糊不清，細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)部分空泡；部分細(xì)胞核皺縮，多數(shù)染色質(zhì)凝聚成多種形態(tài)，染色較MG變淺；細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器部分變形或減少，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不明顯而且較模糊；可見(jiàn)輕微腫脹的線粒體，嵴少散在；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)尚存，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)稍模糊。H-APTG大腦皮質(zhì)細(xì)胞膜較清晰，細(xì)胞漿內(nèi)未見(jiàn)空泡；胞漿輕微濃縮，細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜和核膜均完整；少數(shù)細(xì)胞核皺縮，僅見(jiàn)細(xì)胞核少數(shù)常染色質(zhì)固縮不規(guī)則，疏松，罕見(jiàn)染色質(zhì)凝聚，染色深度接近SOG；細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器近乎完整清晰，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較明顯；線粒體無(wú)明顯腫脹，呈圓或卵圓形，嵴多而清晰，近于SOG；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和質(zhì)膜結(jié)構(gòu)較完整，核糖體腫脹不明顯，少數(shù)溶解；胞漿蛋白與核蛋白成分較SOG略為松散，見(jiàn)圖2。

Figure 2. Effects ofAstragaluspolysaccharide on neuronal ultrastructure of cerebral cortical neurons after right middle cerebral artery occlusion in rats (transmission electron microscopy，×16 500).

圖2AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

3AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，各時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率SOG顯著低于其它各組(P<0.05)；術(shù)后1 d，MG與L-APTG相當(dāng)(P>0.05)，而H-APTG顯著低于MG(P<0.05)；術(shù)后3 d和7 d，L-APTG顯著低于MG(P<0.05)，而H-APTG又顯著低于L-APTG和MG(P<0.05)，顯示AP有明顯抗RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡作用，而且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì)，見(jiàn)圖3、表2。

Figure 3. Effects ofAstragaluspolysaccharide on apoptotic rate of cerebral cortical neurons after right middle cerebral artery occlusion in rats.

圖3AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率的影響

表2AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率的影響

Groupn1d3d7dSOG91．78±0．031．96±0．061．84±0．08MG89．73±0．49?8．83±0．63?8．18±0．71?L-APTG88．97±0．67?6．56±0．33?▲5．08±0．45?▲H-APTG87．84±0．35?▲5．01±0．51?△▲2．64±0．63?△▲

*P<0.05vsSOG；△P<0.05vsL-APTG；▲P<0.05vsMG.

4AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70表達(dá)的影響

在各時(shí)點(diǎn)，SOG的HSP70表達(dá)無(wú)顯著變化，其它各組在術(shù)后HSP70表達(dá)先升高，然后逐漸減低；在各個(gè)時(shí)點(diǎn)，SOG顯著低于其它各組(P<0.05)，L-APTG和H-APTG顯著高于MG，而H-APTG又顯著高于L-APTG(P<0.05)，表明AP呈劑量依賴性促進(jìn)或維持HSP70的表達(dá)，見(jiàn)圖4、表3。

Figure 4. Effects ofAstragaluspolysaccharide on HSP70 expression in cerebral cortical neurons after right middle cerebral artery occlusion in rats (SABC，×400).

圖4AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70表達(dá)的影響

表3AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70表達(dá)的影響

Groupn1d3d7dSOG92．23±0．612．17±0．462．72±0．65MG827．34±3．56?22．86±4．74?19．89±2．57?L-APTG834．78±5．32?27．53±3．42?▲25．63±4．57?H-APTG839．76±4．36?△▲36．74±5．69?△▲34．51±3．74?△▲

*P<0.05vsSOG；△P<0.05vsL-APTG；▲P<0.05vsMG.

5AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元PKB蛋白表達(dá)的影響

PKB蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，在各時(shí)點(diǎn)，SOG無(wú)顯著變化，顯著低于其它各組(P<0.05)；隨時(shí)間推移，MG、L-APTG與H-APTG的PKB蛋白表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)小幅度增加，3組之間有顯著差異，顯示MG

圖5AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元PKB蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. Effects ofAstragaluspolysaccharide on PKB protein expression in cerebral cortical neurons after right middle cerebral artery occlusion in rats(SABC，×400).

圖6AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元PKB蛋白表達(dá)的影響

6AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元P53蛋白表達(dá)的影響

在各時(shí)點(diǎn)，SOG P53蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化，顯著低于其它各組(P<0.05)；隨時(shí)間推移，MG、L-APTG與H-APTG P53蛋白表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)降低，3組之間差異顯著，為MG>L-APTG>H-APTG(P<0.05)。免疫組化切片染色也顯示相似結(jié)果。這表明腦缺血再灌注導(dǎo)致大鼠腦損傷，AP能抑制大腦皮質(zhì)神經(jīng)元P53蛋白表達(dá)，且劑量越大，這種抑制作用越強(qiáng)，見(jiàn)圖7、8。

圖7AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元P53蛋白表達(dá)的影響

Figure 8. Effects ofAstragaluspolysaccharide on P53 protein expression in cerebral cortical neurons after right middle cerebral artery occlusion in rats(SABC，×400).

圖8AP對(duì)RMCAO大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元P53蛋白表達(dá)的影響

討 論

大腦皮質(zhì)神經(jīng)元對(duì)缺血缺氧性損害很敏感，若腦缺血使得腦能量代謝障礙，直接導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)外離子的平衡失調(diào)，大量Na+、Ca2+積聚于神經(jīng)元內(nèi)，引起神經(jīng)元水腫，甚至破裂[5-6]，隨即發(fā)生皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡。當(dāng)缺血損傷消除后，損傷神經(jīng)元逐漸修復(fù)與再生，其修復(fù)與再生過(guò)程伴隨相關(guān)蛋白的表達(dá)(c-Fos，Bcl-2，P53，PKB，HSP70)而調(diào)控著神經(jīng)元的修復(fù)與再生[7]。使用有效藥物干預(yù)這些相關(guān)蛋白的表達(dá)，是促進(jìn)損傷神經(jīng)元修復(fù)與再生的基礎(chǔ)。AP是從中藥黃芪(Astragalusmongholicus)中提取的多糖類物質(zhì)，有保護(hù)腦組織、延緩衰老、抗氧化、改善細(xì)胞代謝以及調(diào)節(jié)免疫等多重藥理作用[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)下列因素發(fā)揮對(duì)腦的保護(hù)作用，表現(xiàn)為呈劑量依賴性降低缺血再灌注導(dǎo)致的腦損傷大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，減輕神經(jīng)組織的水腫，阻止神經(jīng)元胞核的固縮，降低神經(jīng)元的凋亡率，延緩神經(jīng)元胞漿的濃縮進(jìn)程，阻止神經(jīng)元胞核的皺縮和線粒體的腫脹，維持神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的完整性，降低神經(jīng)元凋亡率。其作用機(jī)制可能與下列因素有關(guān)。

1誘導(dǎo)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70表達(dá)，阻止神經(jīng)元自殺途徑的開(kāi)啟，增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)缺血再灌注的耐受性，減少神經(jīng)元凋亡

中樞神經(jīng)的HSP70是抗凋亡蛋白，通過(guò)熱休克反應(yīng)能保護(hù)或減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷[9]。其主要功能是：直接保護(hù)神經(jīng)元，啟動(dòng)產(chǎn)生其它保護(hù)機(jī)制；增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)應(yīng)激原的耐受性；應(yīng)激狀態(tài)下維持神經(jīng)元內(nèi)蛋白的自穩(wěn)，結(jié)合變性蛋白，防止變性蛋白進(jìn)一步折疊而失去功能；轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)新合成蛋白質(zhì)，迅速清除和恢復(fù)受損蛋白質(zhì)，以維持細(xì)胞的正常生存；調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞周期；充當(dāng)分子伴侶，參與調(diào)節(jié)免疫[10]。腦缺血可引起熱休克反應(yīng)，增強(qiáng)HSP70表達(dá)，阻止神經(jīng)元開(kāi)啟自殺途徑，減輕神經(jīng)元凋亡[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，HSP70抑制劑能加速腦缺血后神經(jīng)元的凋亡進(jìn)程[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在腦缺血后1 d、3 d和7 d，假手術(shù)組HSP70表達(dá)顯著低于其它各組(P<0.05)，低劑量和高劑量AP治療組顯著高于模型對(duì)照組，而高劑量AP治療組又顯著高于低劑量AP治療組(P<0.05)，表明AP呈劑量依賴性促進(jìn)或維持HSP70的表達(dá)。這有助于保護(hù)缺血引起的神經(jīng)元損傷，增加腦組織的修復(fù)與再生能力，提示AP增強(qiáng)腦缺血神經(jīng)功能的機(jī)制，與誘導(dǎo)神經(jīng)元HSP70的表達(dá)而保護(hù)神經(jīng)元、阻止神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

2激活腦皮質(zhì)神經(jīng)元PKB蛋白表達(dá)，阻止神經(jīng)元凋亡，增強(qiáng)神經(jīng)元的生存功能

PKB(Akt)是存在于神經(jīng)細(xì)胞的一種蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，其Thr308和Ser473位點(diǎn)能在PI3K作用下磷酸化而激活，隨即發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡、促細(xì)胞生存等多種生物效應(yīng)[7]。研究已經(jīng)證實(shí)，激活的PKB作用于多種底物(forkhead轉(zhuǎn)錄因子、eNOS、GsK-3、BAD、CREB、caspase-9等)或下游環(huán)節(jié)而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生存[8]。短暫腦缺血早期，相對(duì)損傷較輕部位(大腦皮質(zhì))磷酸化的PKB表達(dá)也相對(duì)增加，這種腦缺血早期的特殊保護(hù)反應(yīng)，與促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活有關(guān)[1,10]。有研究發(fā)現(xiàn)，短暫全腦缺血早期階段，缺血損傷相對(duì)較輕的部位(如大腦皮質(zhì)區(qū))磷酸化PKB表達(dá)增高[9]。沙土鼠全腦缺血再灌注模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，磷酸化的PKB核表達(dá)明顯增加，表明PKB的激活與增強(qiáng)腦缺血的耐受性有關(guān)[3,9]。以上事實(shí)說(shuō)明，腦缺血早期PKB的激活是機(jī)體對(duì)腦缺血的一種保護(hù)性反映，與促進(jìn)細(xì)胞存活有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在腦缺血后1 d、3 d和7 d，假手術(shù)組PKB蛋白表達(dá)少于模型對(duì)照組(P<0.05)，表明腦缺血可以誘導(dǎo)PKB蛋白表達(dá)。低劑量和高劑量AP治療組PKB蛋白表達(dá)顯著高于模型對(duì)照組，而高劑量AP治療組又顯著高于低劑量AP治療組(P<0.05)，表明AP呈劑量依賴性加快并維持腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元PKB蛋白高水平表達(dá)。這提示AP抗腦缺血再灌注神經(jīng)損傷的機(jī)制與促進(jìn)PKB蛋白的表達(dá)和細(xì)胞存活有關(guān)。

3抑制腦皮質(zhì)神經(jīng)元P53蛋白表達(dá)，從而阻止其下游基因介導(dǎo)的凋亡基因的表達(dá)

腦缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)受凋亡基因p53的調(diào)控，是誘導(dǎo)腦缺血再灌注神經(jīng)元凋亡的主要因素[8-9]。P53在正常組織中的表達(dá)極低，這對(duì)阻止基因突變和穩(wěn)定染色體DNA具有重要意義[9-10]。如果DNA受到外來(lái)影響(輻射、缺氧、缺血等)，作為轉(zhuǎn)錄因子的P53可誘導(dǎo)下游基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期停滯[9]。有研究證實(shí)，腦缺血可增加P53表達(dá)，P53表達(dá)抑制劑具有保護(hù)腦組織作用[8]。P53還能減少Bcl-2蛋白(抗細(xì)胞凋亡蛋白)表達(dá)，增強(qiáng)Bax蛋白(促細(xì)胞凋亡蛋白)表達(dá)，并調(diào)節(jié) Bax、caspase等系列下游基因而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10]。因此，p53基因具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在腦缺血后1 d、3 d和7 d，假手術(shù)組P53蛋白表達(dá)低于其它各組(P<0.05)，模型對(duì)照組顯著高于低劑量AP治療組，而低劑量AP治療組又顯著高于高劑量AP治療組(P<0.05)，表明AP呈劑量依賴性抑制腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元P53蛋白的表達(dá)。這提示AP抗腦缺血再灌注神經(jīng)損傷的機(jī)制與抑制P53蛋白表達(dá)相關(guān)。

[1] 顏 玲，黃德斌．黃芪多糖對(duì)缺血腦損傷大鼠海馬神經(jīng)遞質(zhì)及c-fos mRNA表達(dá)的影響[J]．中國(guó)病理生理雜志，2012，28(2)：263-268．

[2] Jin R, Jiang XY,Ma X, et al．Effect of gamma-hydroxybutyric acid receptor on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats [J]．Acta Pharm Sin，2007，42(8)：838-842．

[3] 李 花，鄧常清，陳北陽(yáng)，等.三七總皂苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注后Caspase表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(2)：189-193．

[4] 黃德斌，董 志. 尼莫地平對(duì)缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008,24(5)：640-643.

[5] Hou XY，Zhang GY，Yan JZ, et al．Activation of NMDA receptors and L-type voltage-gated calcium channels mediates enhanced formation of fyn-PSD95-NR2A complex after transient brain ischemia[J]．Brain Res，2002，955(1-2)：123-132．

[6] 湯 諹，李樹(shù)清，李 凡,等．缺血后適應(yīng)對(duì)樹(shù)鼩海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的機(jī)制研究[J]．中國(guó)病理生理雜志，2011，27(3)：560-565.

[7] Chung YH，Shin CM，Kim MJ, et al．Enhanced expression of L-type Ca2+channels in reactive astrocytes after ischemic injury in rats[J]．Neurosci Lett，2001，302(2-3)：93-96．

[8] 焦俊霞，高維娟，錢 濤，等.黃芪有效成分對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元cyt-c、CcO表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(2)：211-215.

[9] 焦俊霞，高維娟，李玉明,等．黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J]．中國(guó)病理生理雜志，2011，27(5)：905-910．

[10]蘇 方，張 培，姜治偉，等．海馬神經(jīng)元缺血/再灌注后自噬的表達(dá)及其作用[J]．中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2011，27 (2)：187-190．

EffectsofAstragaluspolysaccharideonexpressionofHSP70,PKBandP53inratcerebralcortexwithcerebralischemiaandreperfusion

YAN Ling1, HUANG De-bin1, LIU Jin-hong1, ZHOU Qing-hua2

(1MedicalCollegeofHubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,China;2MedicalCollegeofJingchuUniversityofTechnology,Jingzhou434000,China.E-mail:hdb66910@163.com)

AIM: To explore the molecular effects ofAstragaluspolysaccharide (AP) on improving nervous functions and preventing neuronal apoptosis in rat cerebral cortex with cerebral ischemia and reperfusion.METHODSOne hundred and twenty male Wister rats were randomly divided into sham operation group (SOG), model groups (MG-1 d, 3 d and 7 d), low-dose AP treatment groups (L-APTG-1 d, 3 d and 7 d), and high-dose AP treatment groups (H-APTG-1 d, 3 d and 7 d). The right middle cerebral artery of the rats in MG and AGTG was intercepted by operation to induce ischemic brain injury. The rats in L-APTG and H-APTG were treated with AP at the doses of 5 mg/kg and 15 mg/kg by intraperitoneal injection, respectively. On the 1st day, 3rd day and 7th day after operation, those animals were sacrificed to collect the brain specimens for the study after cerebral blood flow reperfusion and determination of neurological deficit scores. The structural changes of the neurons were observed under electron microscope. Apoptosis was analyzed by flow cytometry. The protein levels of heat-shock protein 70 (HSP70), protein kinase B (PKB) and P53 in cerebral corical neurons were determined by immunohistochemical staining and Western blotting.RESULTSThe neurological deficit scores and the apoptotic rate of cerebral cortical neurons in H-APTG were significantly lower than those in MG and L-APTG (P<0.05). The structures of the neurons in H-APTG, such as ribosome endoplasmic reticulum, nucleolus, Golgi complex, mitochondria, etc, were better than those in MG and L-APTG. On the 1st day, 3rd day and 7th day, the protein levels of HSP70 and PKB in cerebral cortical neurons in H-APTG were significantly higher than those in L-APTG, which were significantly higher than those in MG (P<0.05). However, the P53 protein level in H-APTG was significantly lower than that in L-APTG, which was significantly lower than that in MG (P<0.05).CONCLUSIONAP improves nervous functions and inhibits neuronal apoptosis during ischemia and reperfusion. The molecular mechanisms are associated with variations of protein expression in cerebral cortical neurons, such as promotion of HSP70 and PKB and inhibition of P53.

Brain ischemia reperfusion;Astragaluspolysaccharide; Cerebral cortex; Heat-shock protein 70; Protein kinase B; Tumor suppressor protein P53

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.013