郭 鳳， 羅小勇

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護學(xué)院/山東省農(nóng)作物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東青島 266109)

郭 鳳，羅小勇. 牡丹葉及其不同溶劑提取物對生菜等幼苗生長的抑制效應(yīng)[J]. 雜草科學(xué)，2012，30(3)：21-26.

牡丹葉及其不同溶劑提取物對生菜等幼苗 生長的抑制效應(yīng)

郭 鳳， 羅小勇

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護學(xué)院/山東省農(nóng)作物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東青島 266109)

為了進(jìn)一步明確牡丹葉及其不同溶劑提取物的化感活性大小，于室內(nèi)采用瓊脂混粉法測定了牡丹葉粉末在不同濃度下對生菜、小麥、黃瓜、稗、夏至草、播娘蒿和獨行菜等7種受體植物幼苗生長的影響。結(jié)果表明，雖然在低濃度下牡丹葉粉末對各受體植物幼苗生長的影響差異較大，但在高濃度時均表現(xiàn)出了較高的抑制作用，且對胚根(或種子根)的抑制效果明顯高于對胚軸或胚芽鞘的抑制。計算對各受體植物胚根或種子根、胚軸或胚芽鞘的有效中濃度(EC50)，生菜為0.93～5.25 g/L、小麥為1.20～4.65 g/L)、黃瓜為3.58～>10.0 g/L、稗為0.64～3.36 g/L、夏至草為1.09～5.27 g/L、播娘蒿為1.02～9.65 g/L、獨行菜為0.79～6.84 g/L，以稗的敏感性最高，黃瓜最低。繼而探索了牡丹葉乙醇、甲醇和蒸餾水3種溶劑提取物對生菜幼苗生長的抑制效果，發(fā)現(xiàn)乙醇提取物的活性最高，提取濃度以80%(V/V)為宜。

牡丹葉；抑制效應(yīng)；瓊脂混粉法；溶劑；提取物

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為芍藥科芍藥屬牡丹組落葉灌木，是重要的觀賞植物和藥用植物。其根皮為常用中藥材，內(nèi)含的丹皮酚具有抗血栓形成、抗動脈硬化、降血壓、保護腦組織等多種藥理作用[1]?；ò旮缓喾印㈩慄S酮與花色苷，具抗氧化活性和自由基清除能力[2]。牡丹籽提取物Ⅱ(脂溶性成分)對枯草桿菌、沙門氏菌、根霉菌和黑曲霉菌均有一定的抑制作用。提取物Ⅲ(水溶性成分)對枯草桿菌、沙門氏菌和巴氏桿菌均有一定抑菌作用[3]。葉中所含有的黃酮類化合物對大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和沙門氏菌(Salmonella)3種細(xì)菌均有較強的抑制作用[4]。黃酮類化合物還具有抗氧化、清除自由基、消炎、調(diào)節(jié)血脂、抗癌、抗HIV等廣泛的生物活性[5]。羅小勇采用瓊脂混粉法測定了牡丹不同器官粉末對生菜、黃瓜、反枝莧、苘麻、小麥和稗6種受體植物幼苗生長的影響，發(fā)現(xiàn)除莖器官外，其他各器官的粉末在10 g/L的添加濃度下，對各受體植物幼苗的生長均具有明顯的抑制作用，且對胚根或種子根的抑制效果明顯高于對胚軸或胚芽鞘的抑制。各器官中以根和葉的效果最好，花、果實和葉柄次之，莖最低[6]。除此之外，尚未見其他有關(guān)牡丹對植物幼苗具有抑制效應(yīng)的報道。本研究選擇活性最高的葉器官進(jìn)一步測定了其粉末在不同濃度下對生菜、小麥、稗、黃瓜、夏至草、播娘蒿和獨行菜等7種受體植物幼苗生長的影響，并探索了其不同溶劑提取物的抑制活性大小，以期為進(jìn)一步開展植物源活性物質(zhì)的提取分離及開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

牡丹葉于2011年5月采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。將其置陰涼處干燥后，用電動萬能粉碎機(FW100型，轉(zhuǎn)速24 000 r/min，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn))粉碎1～2 min，取過40目鐵篩的粉末于低溫冰箱(1 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 受體植物

生菜(Lactucasativavar.ramosaHort，抗熱綠湖黑核西生菜特選種388，蔡興利國際有限公司生產(chǎn)，美國)、小麥(TriticumaestivumL.，煙農(nóng)24號)、黃瓜(CucumissativusL.，青研85F12)、稗[Echinochloaarusgalli(L.) Beauv.]、夏至草[Lagopsissupine(Steph.) IK.-Gal.ex Knorr.]、播娘蒿[DescurainiaSophia(L.) Schur.]和獨行菜(LepidiumapetalumWilld.)。雜草種子均采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。

1.3 試驗方法

1.3.1 牡丹葉中活性物質(zhì)的提取 稱取30 g牡丹葉粉末3份置于3個500 mL三角瓶中，分別加入99.5%甲醇溶液、99.7%乙醇溶液和蒸餾水各 300 mL，充分搖勻使之全部潤濕后置室溫(20 ℃)下浸提，每隔3 h攪拌1次，2 d后過濾，收集濾液。而后按同樣方法再提取2次。合并3次濾液，真空抽濾(Whatman，No2.)后于45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到浸膏。水提取液置于45 ℃水浴鍋內(nèi)自然風(fēng)干。針對乙醇溶劑還進(jìn)行了0、20%、40%、60%、80%和100%不同溶劑濃度的提取試驗。

1.3.2 牡丹葉及其提取物的生物活性測定 采用羅小勇提出的瓊脂混粉法[6-10]進(jìn)行。將受體植物種子經(jīng)0.2%次氯酸鈉溶液浸泡15 min后，用自來水沖洗數(shù)次并置流水下浸泡吸水3～5 h(根據(jù)室內(nèi)溫度調(diào)整時間)，而后用蒸餾水洗滌數(shù)次，均勻擺放于帶蓋方盤內(nèi)的吸水紙上，滴加蒸餾水至種子不漂浮，遮光置于全智能人工氣候箱(HP1000GS-B型，武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司生產(chǎn))內(nèi)發(fā)芽，24～72 h后胚根或幼根的長度將達(dá)到3～5 mm。

稱取0.5 g瓊脂粉末分別置于250 mL三角瓶內(nèi)后加入94.5～99.5 mL蒸餾水(根據(jù)所加樣品的濃度調(diào)整水量)，放入微波爐內(nèi)加熱至完全溶解后靜置，待冷卻至60 ℃時分別加入事先稱好的牡丹葉粉末或不同溶劑提取物，然后分別均勻倒入3個小塑料杯內(nèi)，冷凝，配制成含有不同濃度供試材料的0.5%瓊脂凝膠，以未加供試材料的0.5%瓊脂凝膠為對照處理。其中，葉粉末的供試濃度梯度分別為0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 g/L，牡丹葉提取物的供試濃度梯度分別為0、0.05、0.25、0.5、2.5、5.0 g/L。

移植時先用尖嘴鑷子在已凝固的瓊脂表面插5個小孔，而后分別夾取胚根長度基本一致的已發(fā)芽指示植物種子，將胚根垂直由小口輕輕植入瓊脂凝膠中。每杯5粒，重復(fù)3次。而后將所有杯子用錫紙封口并置于已消毒的小紙箱內(nèi)，為防止光照對化合物及植物幼根生長的影響，將小紙箱放入人工氣候箱遮光培養(yǎng)3～4 d。人工氣候箱的設(shè)置條件為：14 h(25 ℃)光照和10 h(20 ℃)黑暗的自動循環(huán)，箱內(nèi)的相對濕度為60%。待處理結(jié)束后用電子游標(biāo)卡尺分別測量受體植物幼苗胚根(種子根)和胚軸(胚芽鞘)的長度。

按下式計算胚根(種子根)和胚軸(胚芽鞘)的實際生長量，應(yīng)用EXCEL軟件，以生長量為基數(shù)，分別計算不同濃度的牡丹葉粉末處理之后對指示植物胚根(種子根)和胚軸(胚芽鞘)生長的抑制率以及樣本的誤差。同時應(yīng)用SPSS軟件計算出有效中濃度(EC50)，并以LSD法對獲得的抑制率進(jìn)行差異顯著性分析。

生長量 = 處理后的胚根(胚軸)長 - 處理前的胚根(胚軸)長

抑制率(%)=(對照生長量-處理生長量)/對照生長量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度牡丹葉粉末對7種受體植物幼苗生長的影響

2.1.1 不同濃度牡丹葉粉末對雙子葉植物幼苗生長的影響 表1所示為不同濃度牡丹葉粉末對雙子葉植物幼苗生長的影響?？梢姡档と~粉末對所有受體植物胚根和胚軸生長的抑制率隨著供試濃度的增加而增大，且對胚根生長的抑制作用明顯高于對胚軸的抑制。其中，對生菜而言，在0.625 g/L的最低供試濃度下，幼苗胚根的生長就已經(jīng)受到一定的抑制，抑制率為29.3%，而對胚軸的生長幾乎沒有影響。此后，隨著供試濃度的增加，對胚根/胚軸生長的抑制率依次提高，在1.25、2.5、5.0、10.0 g/L濃度下對二者的抑制率分別達(dá)到69.3%/21.6%、81.6%/31.3%、92.5%/45.7%和96.7%/67.4%，其中，除了兩個高濃度對胚根的抑制及兩個低濃度對胚軸的抑制差異不顯著外，其余均達(dá)顯著水平。計算對二者的EC50分別為 0.93、5.25 g/L。但對黃瓜幼苗胚根和胚軸生長的影響，0.625 g/L的最低供試濃度下影響均不明顯，抑制率分別僅為6.3%和4.8%。此后，隨著供試濃度的增加，對胚根和胚軸生長的抑制率依次提高，在1.25、2.5、5.0、10.0 g/L 濃度下對二者的抑制率分別達(dá)到26.4%和12.9%、33.7%和16.3%、61.9%和23.1%、79.0%和29.0%，其中，對胚根的抑制除了兩個低濃度之間差異不顯著外，其余均達(dá)顯著水平，對胚軸的抑制除3個高濃度之間、2個低濃度之間及1.25 g/L和 2.5 g/L 兩濃度之間均不顯著外，其余均達(dá)顯著水平。計算對二者的EC50分別為3.58 g/L和>10.0 g/L。

表1 不同濃度牡丹葉粉末對雙子葉植物幼苗生長的影響Table 1 Effects of Paeonia suffruticosa leaf powder under differentconcentrations on growth of dicotyledonous plant seedlings

注：表中數(shù)據(jù)為抑制率±標(biāo)準(zhǔn)誤差(3次重復(fù))；英文小寫字母表示各濃度間對每種受體植物胚根(種子根)和胚軸(胚芽鞘)生長抑制作用的差異顯著性分析，字母不同表示在0.05水平上差異顯著。下同。

夏至草幼苗胚根和胚軸的生長在0.625 g/L的最低供試濃度下均受到一定的抑制，抑制率分別為17.7%和14.4%。在1.25、2.5、5.0、10.0 g/L濃度下則分別提高到66.4%和20.3%、85.8%和27.7%、95.1%和47.4%、97.4%和68.3%，其中，除了兩個高濃度對胚根的抑制差異不顯著，以及0.625、1.25 g/L兩濃度之間對胚軸的抑制差異不顯著外，其余均達(dá)顯著水平。計算對二者的EC50分別為1.09、5.27 g/L。

播娘蒿在0.625 g/L的最低供試濃度下，其幼苗胚根和胚軸的生長不但沒有受到抑制，反而顯示出一定的促進(jìn)作用。但在1.25 g/L的供試濃度下，胚根的生長受到顯著的抑制，抑制率達(dá)67.9%，對胚軸生長的影響則較輕微。此后，隨著供試濃度的增加，對胚根和胚軸生長的抑制率依次提高，在 2.5、5.0、10.0 g/L濃度下對二者的抑制率分別達(dá)到87.3%和8.4%、96.3%和25.3%、97.1%和51.0%，其中，除了兩個高濃度及兩個低濃度對胚根的抑制差異不顯著，以及1.25 g/L濃度處理與空白對照對胚軸的抑制差異不顯著外，其余均達(dá)顯著水平。計算對二者的EC50分別為1.02 g/L 和9.65 g/L。

獨行菜在0.625 g/L的最低供試濃度下，只有胚根的生長受到明顯的抑制，抑制率為31.4%，而胚軸的生長則受到輕微的促進(jìn)。此后，隨著供試濃度的增加，對胚根和胚軸生長的抑制率依次提高，在1.25、2.5、5.0、10.0 g/L濃度下對二者的抑制率分別達(dá)到77.2%和9.9%、94.2%和31.9%、96.8%和45.5%、98.7%和55.2%，其中，3個高濃度下對胚根的抑制差異不顯著，對胚軸的抑制差異在2個高濃度和3個低濃度下均不顯著，其余均達(dá)顯著水平。計算對二者的EC50分別為0.79 g/L和6.84 g/L。

2.1.2 不同濃度牡丹葉粉末對單子葉植物幼苗生長的影響 以小麥和稗為單子葉受體植物測定了牡丹葉粉末在不同濃度下對幼苗生長的影響，其結(jié)果見表2?？梢?，與上述雙子葉受體植物一樣，它們的幼苗生長也受到了顯著的抑制，抑制作用隨供試濃度的增加也明顯提高，且對種子根的抑制作用明顯高于對胚芽鞘的抑制。

小麥在0.625 g/L的最低供試濃度下，只有種子根的生長受到明顯抑制，抑制率為28.0%。此后，隨著供試濃度的增加，對胚芽鞘的生長也顯示出明顯的抑制，在1.25、2.5、5.0、10.0 g/L濃度下對種子根和胚芽鞘的抑制率分別達(dá)到55.3%和29.1%、74.1%和42.7%、81.2%和52.3%、87.4%和60.8%，除兩個低濃度對胚芽鞘的抑制差異不顯著外，其余均達(dá)顯著水平。計算對二者的EC50分別為1.20 g/L和4.65 g/L。

稗幼苗種子根和胚芽鞘的生長在0.625 g/L的最低供試濃度下均受到顯著的抑制，抑制率分別為39.0%和20.6%。此后，隨著供試濃度的增加，對二者生長的抑制率依次提高，在1.25 g/L、2.5 g/L、5.0 g/L和10.0 g/L濃度下抑制率分別達(dá)80.6%和39.4%、88.3%和50.3%、91.2%和56.4%、96.5%和62.6%，除2.5 g/L和5.0 g/L兩濃度之間對種子根的抑制差異不顯著外，其余均達(dá)顯著水平。計算對二者的EC50分別為0.64 g/L和3.36 g/L。

表2 不同濃度牡丹葉粉末對單子葉植物幼苗生長的影響Table 2 Effects of Paeonia suffruticosa leaf powder under differentconcentrations on growth of monocotyledons plant seedlings

2.2 牡丹葉不同溶劑提取物對生菜幼苗生長的影響

表3所示為牡丹葉不同溶劑提取物對生菜幼苗生長的影響?？梢?，盡管在低濃度下，各溶劑提取物對生菜幼苗生長的影響有所差異，但在高濃度下，均顯示出較高的抑制作用，尤其是乙醇和甲醇提取物。在2.5 g/L和5.0 g/L濃度下，3種溶劑提取物對生菜幼苗胚根和胚軸的抑制率，乙醇為94.2%和54.4%、97.2%和69.3%，甲醇為94.5%和49.1%、97.0%和61.3%，蒸餾水為77.2%和11.3%、89.5%和29.3%。計算EC50分別為0.25 g/L和1.56 g/L、0.44 g/L和2.74 g/L、0.82 g/L和>5.0 g/L。

2.3 牡丹葉不同濃度乙醇溶液提取物對生菜幼苗生長的影響

根據(jù)上述結(jié)果，選擇提取物活性最高的乙醇作為提取溶劑進(jìn)行了不同提取濃度試驗，其結(jié)果見圖1?？梢姡?0%、40%、60%、80%和100%乙醇溶液處理牡丹葉片粉末所得到的提取物對生菜幼苗胚根生長的抑制率均較高，依次為92.5%、97.6%、98.0%、99.1%和97.7%，而對胚軸的抑制率相對較低，依次分別為31.2%、47.3%、53.7%、63.5%和69.7%。

表3 牡丹葉不同溶劑提取物對生菜幼苗生長的影響Table3 Effects of Paeonia suffruticosa leaf extracts bydifferent solvents on growth of Lactuca sativa seedlings

3 結(jié)論與討論

許多研究表明，植物在生長過程中會產(chǎn)生許多具有植物化感活性的物質(zhì)，當(dāng)這些物質(zhì)通過淋溶、揮發(fā)、根系分泌或殘株分解進(jìn)入周圍環(huán)境后，會對其他植物或自身的生長產(chǎn)生影響。但不同植物間、同一植物的不同器官間化感作用的大小有著較大的差異[11-12]。牡丹也不例外，各器官在10 g/L的處理濃度下，對生菜、小麥等多種受體植物幼苗的生長都表現(xiàn)出較高的抑制活性，即化感活性，且以根和葉的效果最好[6]，這是國內(nèi)外牡丹對植物幼苗生長具有抑制活性的首次報道。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步測定了其葉器官粉末在不同濃度下對生菜、小麥、黃瓜、稗草、夏至草、播娘蒿和獨行菜等7種受體植物幼苗生長的影響，發(fā)現(xiàn)不同受體植物的敏感性存在較大差異，呈現(xiàn)出一定的選擇性。其中，以稗的敏感性最強，抑制其種子根和胚芽鞘生長所需的有效中濃度(EC50)分別只有0.64 g/L和3.36 g/L，而黃瓜的敏感性最低，抑制其幼苗胚根和胚軸生長所需的EC50分別為3.58 g/L和>10.0 g/L，其他植物的敏感性則介于稗與黃瓜之間。稗、播娘蒿、獨行菜、夏至草都是常見的農(nóng)田雜草，其中，稗和播娘蒿更是危害小麥等多種作物的惡性雜草，牡丹葉對幾種雜草所表現(xiàn)出的高抑制活性說明該器官中可能含有可供除草劑開發(fā)的活性物質(zhì)。為了進(jìn)一步提取分離這些高活性物質(zhì)，本研究以提取物對植物幼苗生長的抑制活性大小為指標(biāo)，探索了不同溶劑提取物的抑制效果，發(fā)現(xiàn)乙醇和甲醇提取物對生菜幼苗生長的抑制活性高于蒸餾水提取物的抑制效果，而兩種有機溶劑之間以乙醇的抑制效果較高。因而，選擇乙醇為提取溶劑，進(jìn)一步測定了其最佳提取濃度，發(fā)現(xiàn)在10.0 g/L的供試濃度下，以80%乙醇溶液提取物對生菜幼苗生長的抑制活性最高。這些結(jié)果為牡丹葉中活性物質(zhì)的進(jìn)一步提取分離提供了重要依據(jù)。盡管科學(xué)家們已從牡丹葉中分離得到一些黃酮類化合物[4]，從根中分離到芍藥苷、苯甲酰芍藥甙、羥基芍藥苷、丹皮酚、丹皮酚苷、丹皮酚新苷、丹皮酚原苷、牡丹皮酸A和B、苯甲酸、沒食子酸糖苷、二羥基苯乙酮、β-谷甾醇、樺木酸、齊墩果酸、懈黃素以及β-谷甾醇-β-D-糖甙等物質(zhì)[13-14]，但它們是否對植物幼苗生長有一定的抑制效應(yīng)還有待于進(jìn)一步研究。

牡丹同其他植物一樣，連年在同一地塊種植也會導(dǎo)致重茬障礙，表現(xiàn)在生長勢逐年衰弱、病害多發(fā)且不易防治、植株早衰、死棵現(xiàn)象嚴(yán)重等方面[15]。究其原因，除了與種植田塊的土壤特性、病原菌增多、營養(yǎng)失衡等有關(guān)外，還可能與其分泌的植物化感物質(zhì)有關(guān)[6，15]。本研究結(jié)果進(jìn)一步支撐了這一觀點。

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InhibitoryEffectsofPaeoniasuffruticosaLeavesandtheExtractsbyDifferentSolventsonSeedlingGrowthofLactucasativaandSomeOtherPlants

GUO Feng, LUO Xiao-yong

(School of Agriculture and Plant Protection, Qingdao Agricultural University/Key Lab of Integrated Control of Crop Diseases and Insect Pests of Shandong Province, Qingdao 266109, China)

In order to further understand the allelopathic activities ofPaeoniasuffruticosaleaves, indoor test was carried out via agar mixed powder(PPA) method to detect effects ofPaeoniasuffruticosaleaf powder under different concentrations on seedling growth of 7 receptor plants includingLactucasativaL. var.ramosaHort.,TriticumaestivumL.,CucumissativusL.,EchinochloacrusgalliL.,Lagopsissupine(Steph.) Ik.-Gal.ex Knorr.,DescuminiaSophiaL. andLepidiumapetalumWilld. Results showed that influence ofPaeoniasuffruticosaleaf powder at low concentration on seedling growth of each receptor plant was quite different, but relatively high inhibition effects could be were observed at high concentration, and particularly inhibition effects on radicles (or seminal roots) were significantly higher than that of hypocotyls or coleoptiles. The EC50an effective dose for half lethal value corresponding to radicles (or seminal roots), and hypocotyls (or coleoptiles) respectively for each receptor plant,calculated as follows.L.sativa0.93-5.25 g/L,T.aestivum1.20-4.65 g/L,C.sativus3.58->10.0 g/L,E.crusgalli0.64-3.36 g/L,L.supine1.09-5.27 g/L,D.Sophia1.02-9.65 g/L,L.apetalum0.79-6.84 g/L. Among them,E.crusgalliandC.sativuspresented the highest and the lowest susceptibility to peony leaves respectively. Meanwhile, effect of peony leaves extract derived from different solvent (ethanol, methanol and distilled water) on seedling growth ofL.sativawas tested respectively with a result that ethanol extract presented the highest inhibition activity on receptor plant seedling growth, and the optimum ethanol concentration for extraction was 80%(V/V).

Paeoniasuffruticosaleaves; inhibitory effects; PPA method; solvents; extract

Q945.7

A

1003-935X(2012)03-0021-06

2012-06-06

山東省“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項經(jīng)費；山東省青島市科技計劃基礎(chǔ)研究項目[編號：11-2-4-5-(5)-jch]。

郭 鳳(1986—)，女，碩士研究生，從事植物源除草活性物質(zhì)研究。E-mail：guofeng86860902@163.com。

羅小勇，博士，副教授，從事除草劑毒理及植物源除草活性物質(zhì)研究。Tel：(0532)88030472；E-mail：luo-xiaoyong@163.com。