吳漢青 王博 范平 吳河水

·論著·

Toll樣受體9和低氧誘導(dǎo)因子1α在胰腺癌中的表達(dá)及其意義

吳漢青 王博 范平 吳河水

目的研究Toll樣受體9(TLR9)和低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)在胰腺癌組織中的表達(dá)，探討其臨床意義。方法采用實(shí)時(shí)定量PCR法、蛋白質(zhì)印跡法及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)30例胰腺癌組織及其相鄰癌旁組織、10例正常胰腺組織中TLR9和HIF-1α的表達(dá)，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性、與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系以及對(duì)患者生存時(shí)間的影響。結(jié)果胰腺癌TLR9 mRNA及HIF-1αmRNA表達(dá)量分別為正常胰腺組織的2.32(1. 41～3.22)倍和2.26(1.62～2.89)倍，癌旁組織表達(dá)量分別為正常胰腺組織的1.23(1.18～1.28)倍和1.36(1.17～1.55)倍，胰腺癌的表達(dá)量顯著高于癌旁組織(t=2.642,P=0.023；t=4.076,P=0.001)。胰腺癌組織TLR9和HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為73.3%(22/30)和70.0%(21/30)，癌旁組織分別為33.3%(10/30)和36.7%(11/30)，正常胰腺組織分別為20%(2/10)和10%(1/10)，呈遞減趨勢(shì)(χ2=13.99,P=0.001；χ2=13.15，P=0.001)。胰腺癌組織TLR9 mRNA與HIF-1α mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.537，P=0.003)，TLR9和HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率亦呈正相關(guān)(r=0.511，P=0.001)。胰腺癌組織TLR9和HIF-1α表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論胰腺癌組織TLR9和HIF-1α基因均高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為及患者預(yù)后差有關(guān)。

胰腺腫瘤； Toll樣受體9； 低氧誘導(dǎo)因子1α

Toll樣受體9(Toll-like receptor，TLR9)為T(mén)LR家族重要成員，能夠刺激B細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子和趨化因子，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[1]。TLR9不僅表達(dá)于免疫細(xì)胞，也表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞[2]。低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是最重要的低氧信號(hào)傳遞因子，調(diào)控一系列促進(jìn)血管生成、細(xì)胞存活、糖酵解、細(xì)胞增殖、腫瘤浸潤(rùn)的基因表達(dá)[3]。本研究檢測(cè)胰腺癌組織TLR9和HIF-1α的表達(dá)，探討它們?cè)谝认侔┌l(fā)生、發(fā)展中的作用。

資料與方法

一、臨床資料

收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科中心2008年12月至2010年8月接受手術(shù)治療并經(jīng)病理證實(shí)的30例胰腺癌組織及距腫瘤邊緣1～2 cm處的癌旁胰腺組織。10例正常胰腺組織標(biāo)本取自其他原因需行胰腺部分切除的非腫瘤患者，且經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。40例患者中男19例，女11例；年齡39～75歲，平均57歲。30例胰腺癌患者術(shù)前均未行放療及化療，術(shù)后常規(guī)化療，定期隨訪，隨訪截止日期為2011年12月31日。28例獲得完整隨訪，失訪2例。

二、TLR9、HIF-1α mRNA檢測(cè)

參照Trizol試劑盒(Sigma公司)說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA。根據(jù)GenBank人TLR9 mRNA設(shè)計(jì)引物序列。TLR9上游為5′-GCCCAAATCCCTCATATCCC-3′，下游為：5′-AACAGTTGCCGTCCATGAATAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物113 bp；HIF-1α上游為5′-TGAAGT-GTACCCTAACTAGCCG-3′，下游為5′-AATCAGCACCAAGCAGGTCATAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物158 bp。內(nèi)參β-actin上游為5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′，下游為5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物190 bp。引物由上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用ReverTra Ace(Toyobo公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)TLR9、HIF-1α mRNA。反應(yīng)程序：50℃ 2 min，95℃ 2 min，然后95℃ 15 s，58℃ 15 s， 72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。通過(guò)PCR儀(HONGSHI公司)自帶軟件獲取檢測(cè)樣本的△CT(CT目的基因-CTβ-actin),以10例正常胰腺組織的△CT均值作為對(duì)照，計(jì)算△△CT(△CT癌或癌旁組織-△CT對(duì)照組織)，通過(guò)公式2-△△CT計(jì)算mRNA擴(kuò)增倍數(shù)。

三、TLR9、HIF-1α蛋白檢測(cè)

常規(guī)提取組織蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TLR9、HIF-1α蛋白表達(dá)。兔抗人TLR9單抗1∶750稀釋，鼠抗人HIF-lα單抗(cell signaling公司)1∶500稀釋。最后ECL發(fā)光，X膠片曝光、顯影、定影。采用自動(dòng)電泳凝膠成像分析軟件(Band scan v5.0)進(jìn)行圖像掃描和分析。

對(duì)固定的組織常規(guī)包埋、切片，采用免疫組織化學(xué)試劑盒(武漢博士德公司)檢測(cè)TLR9和HIF-1α，按說(shuō)明書(shū)操作。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。由病理科醫(yī)師雙盲法閱片，根據(jù)著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量分析。無(wú)著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞<25%為1分，25%～49%為2分，≥50%為3分。兩個(gè)分值相加，0～3分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、TLR9、HIF-1α mRNA表達(dá)

正常胰腺組織TLR9、HIF-1α mRNA低表達(dá)。胰腺癌及癌旁組織TLR9 mRNA的表達(dá)量分別是正常胰腺組織的2.32(1.41～3.22)倍及1.23(1.18～1.28)倍； HIF-1α mRNA的表達(dá)量分別是正常胰腺組織的2.26(1.62～2.89)倍及1.36(1.17～1.55)倍。胰腺癌組織的表達(dá)均顯著高于癌旁組織(t=2.642，P=0.023；t=4.076,P=0.001)。胰腺癌組織TLR9 mRNA與HIF-lα mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.537，P=0.003)。

二、TLR9、HIF-1α蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法顯示，胰腺癌、癌旁組織、正常胰腺組織TLR9蛋白表達(dá)量分別為0.815±0.092、0.511±0.067、0.133±0.076；HIF-1α蛋白表達(dá)量分別為0.923±0.084、0.413±0.077、0.112±0.059。癌組織的表達(dá)量顯著高于癌旁組織及正常胰腺組織(圖1)。

圖1 TLR9及HIF-1α蛋白表達(dá)

免疫組化法顯示，TLR9蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，HIF-1α蛋白表達(dá)于胞質(zhì)和胞核。癌旁及正常胰腺組織見(jiàn)少量胰腺腺泡細(xì)胞TLR9及HIF-1α蛋白弱表達(dá) (圖2)。正常胰腺組織、胰腺癌旁組織和胰腺癌組織的TLR9陽(yáng)性表達(dá)率分別為20%(2/10)、33.3%(10/30)和73.3%(22/30)；HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率分別為10%(1/10)、36.7%(11/30)和70.0%(21/30)。從正常、癌旁到胰腺癌組織，TLR9及HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率呈遞增趨勢(shì)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為13.99、13.15，P=0.001)。在胰腺癌組織中，TLR9和HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.511，P=0.001)。

圖2TLR9(上)及HIF-1α(下)在胰腺癌組織(a)、癌旁組織(b)及正常胰腺組織(c)中的表達(dá)(免疫組化 ×200)

三、TLR9、HIF-1α表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

TLR9、HIF-1α的表達(dá)與腫瘤部位及腫瘤大小無(wú)關(guān)(P值均>0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和臨床TNM分期有關(guān)(P值均<0.05，表1)。

表1 胰腺癌組織中TLR9及HIF-1α的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

四、TLR9、HIF-1α表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系

TLR9陽(yáng)性患者平均生存期為14.5個(gè)月(95%可信區(qū)間13.7～15.4)；陰性患者平均為21.5個(gè)月(95%可信區(qū)間20.2～22.9)，顯著長(zhǎng)于陽(yáng)性患者(χ2=16.89，P<0.05，圖3)。HIF-1α陽(yáng)性患者平均生存期為14.8個(gè)月(95%可信區(qū)間13.8～15.8)；陰性患者平均為21.8個(gè)月(95%可信區(qū)間20.3～23.4)，生存期顯著長(zhǎng)于陽(yáng)性患者(χ2=17.55，P<0.05，圖3)。

圖3TLR9及HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性及陰性患者的生存曲線

討 論

1997年Medzhitov等首次發(fā)現(xiàn)了人類的第一種Toll同源變體(即TLR4)，后又發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了10種人的TLR家族蛋白，分別命名為T(mén)LR1～TLR11。TLR9特異性識(shí)別的病原體相關(guān)分子模式為細(xì)菌和病毒DNA中的CpG序列或人工合成的寡脫氧核苷酸(CpG-oligodeoxynucleotides)[2]，在介導(dǎo)外源CpG DNA激活先天免疫過(guò)程中有重要的生物學(xué)意義。TLR9除了抗感染作用，還與自身免疫紊亂及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[4-5]。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織、癌旁胰腺組織及正常組織中均有TLR9 mRNA和蛋白的表達(dá)，但癌組織的表達(dá)最高，與Droemann等[6]在肺癌中的研究結(jié)果一致。胰腺癌組織中TLR9的高表達(dá)與腫瘤分化程度、TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示TLR9參與胰腺組織的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程?；颊呱嫫诜治鼋Y(jié)果還顯示，TLR9陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于陽(yáng)性表達(dá)患者，推測(cè)胰腺癌TLR9信號(hào)通路的激活可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響患者預(yù)后。

浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的腫瘤常缺乏足夠的血供，在距離血管較遠(yuǎn)的腫瘤組織區(qū)域形成不同程度的低氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏以及代謝產(chǎn)物堆積[7]。腫瘤缺細(xì)胞感知周圍的低氧環(huán)境，調(diào)節(jié)代謝以適應(yīng)受限的氧供給，最重要的機(jī)制就是HIF-1α的活化，本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織HIF-1α mRNA和蛋白高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)，且與患者預(yù)后差有關(guān)，與Sun等[8]和Kitada等[9]研究結(jié)果一致。提示胰腺癌中存在HIF-1α的高表達(dá)，并與胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性表型相關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示，胰腺癌組織TLR9和HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)，表明TLR9信號(hào)通路和HIF-1α信號(hào)通路可能存在交叉，但具體的聯(lián)系機(jī)制目前尚不明確。最初的研究認(rèn)為，HIF-1α僅對(duì)低氧發(fā)生反應(yīng)，但最近研究發(fā)現(xiàn)它也能受到諸如癌基因激活、腫瘤抑制基因失活等的調(diào)控。而且組織微環(huán)境內(nèi)糖及氧代謝產(chǎn)物的增加也能穩(wěn)定HIF-1α，這些腫瘤組織的遺傳和生理的改變導(dǎo)致HIF-1活化[10]。因此推測(cè)在胰腺癌微環(huán)境內(nèi)，由于組織缺血壞死等因素，壞死組織和細(xì)胞釋放出熱休克蛋白以及基質(zhì)降解等產(chǎn)生多種TLR9內(nèi)源性配體，持續(xù)激活TLR9信號(hào)通路，進(jìn)而通過(guò)某種機(jī)制進(jìn)一步活化HIF-1α，共同促進(jìn)了胰腺癌的惡性進(jìn)展。

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ExpressionandsignificanceofTLR9andHIF-1αinpancreaticcancer

WUHan-qing,WANGBo,FAN-ping,WUHe-shui.

DepartmentofEmergencySurgery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

WUHan-qing,Email:wuhanqincat@163.com

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of toll-like receptor 9 (TLR9) and hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α) in pancreatic cancer.MethodsThe real-time RT-PCR technique, western blot method and immunohistochemical method were used to examine the expressions of TLR9 and HIF-1α in 30 samples of pancreatic cancer, para-cancerous tissues, and 10 samples of normal pancreatic tissues. The relationship between TLR9 and HIF-1α was determined, and the correlations between their expressions and clinicopathological parameters were measured, and the impact on survival was detected.ResultsThe levels of TLR9 mRNA and HIF-1α mRNA expression in human pancreatic cancer tissues was 2.32(1.41～3.22) and 2.26(1.62～2.89) folds as many as that in normal tissues. The levels of TLR9 mRNA and HIF-1α mRNA expression in para-cancerous tissues were 1.23(1.18～1.28) and 1.36(1.17～1.55) folds as many as that in normal tissues. The expressions in human pancreatic cancer tissues were significantly higher than those in para-cancerous tissues (t=2.642,P=0.023;t=4.076,P=0.001). The positive rates of TLR9 and HIF 1α protein were 73.3%(22/30) and 70.0%(21/30), and the corresponding values were 33.3%(10/30) and 36.7%(11/30) in para-cancerous tissues, while the corresponding values were 20%(2/10) and 10% (1/10) in normal tissues, which showed a decreasing trend (χ2=13.99,P=0.001;χ2=13.15,P=0.001). The expressions of TLR9 mRNA in human pancreatic cancer tissues was positively associated with HIF 1α mRNA (r=0.537,P=0.003). The expressions of TLR9 protein was also positively associated with HIF 1α protein (r=0.511,P=0.001). The expressions of TLR9 and HIF 1α were positively correlated with the degree of tumor differentiation, TNM staging and lymph node metastasis, but were negatively correlated with the survival.ConclusionsTLR9 and HIF-1α are over-expressed in pancreatic cancer and they are associated with malignant biological behavior and poor prognosis.

Pancreatic neoplasms; Toll-like receptor 9; Hypoxia-inducible factor 1α

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.06.008

國(guó)家自然科學(xué)基金(30200272)

430022 湖北武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院急診外科(吳漢青)，胰腺外科(王博、范平、吳河水)

吳漢青，Email:wuhanqincat@163.com

2012-08-28)

(本文編輯：呂芳萍)