吳春燕 郭曉鐘 王華

抑制KAI1誘導(dǎo)的自噬對(duì)胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞增殖及凋亡的影響

吳春燕 郭曉鐘 王華

細(xì)胞自噬是一種重要的促細(xì)胞生存途徑，同時(shí)也是一種不同于凋亡和壞死的死亡方式。KAI1是缺氧目的基因，體內(nèi)缺氧時(shí)亦可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[1]。我們前期報(bào)道了KAI1誘導(dǎo)MiaPaCa-2自噬，并增加細(xì)胞的存活[2]，本研究進(jìn)一步探討抑制KAI1誘導(dǎo)的自噬對(duì)該細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

一、材料與方法

1．CCK-8檢測細(xì)胞增殖：應(yīng)用KAI1抑制劑3-MA預(yù)處理MiaPaCa-2細(xì)胞1 h，以未處理組作為對(duì)照，應(yīng)用100 MOI的Ad5-KAI1及Ad5-null分別感染細(xì)胞，具體步驟參考我們前期報(bào)道[3]。取轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)0.5、1、2、3、4、5 d后每孔分別加入10 μl的CCK-8(Dojindo Molecular Technologies公司,日本)繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀(Thermo, Germany)測定450 nm吸光值(A450)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2．流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡：取上述各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，經(jīng)洗滌后重懸于緩沖液中，每管加入8 μl Annexin V-FITC(北京眾康志恒生物科技有限公司)，混合后加入5 μl PI，混均，避光孵育1 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀(eBioscience Dickinson)檢測細(xì)胞的凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

二、結(jié)果

1．3-MA預(yù)處理對(duì)KAI1誘導(dǎo)的MiaPaCa-2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)的影響：感染Ad5-null的MiaPaCa-2細(xì)胞，不管是否用3-MA預(yù)處理，均對(duì)細(xì)胞Beclin1表達(dá)無顯著影響。感染Ad5-KAI1細(xì)胞的Beclin1表達(dá)較感染Ad5-null細(xì)胞明顯增加(P<0.05)，感染前用3-MA預(yù)處理的細(xì)胞的Beclin1表達(dá)水平增加明顯受到抑制(P<0.05，圖1)。

2．MiaPaCa-2細(xì)胞增殖的變化：感染Ad5-null的MiaPaCa-2細(xì)胞，不管是否用3-MA預(yù)處理，均對(duì)細(xì)胞的增殖無明顯影響。感染Ad5-KAI1 48 h后，MiaPaCa-2細(xì)胞的增殖下降達(dá)29%(P<0.001)，感染前用3-MA預(yù)處理的細(xì)胞增殖下降幅度更大，達(dá)70%(P<0.001)。

3．MiaPaCa-2細(xì)胞凋亡的變化：感染Ad5-null的MiaPaCa-2細(xì)胞，不管是否用3-MA預(yù)處理的，均對(duì)細(xì)胞的凋亡無明顯影響(圖2)。感染Ad5-KAI1后6 h時(shí)細(xì)胞無明顯凋亡，12 h時(shí)凋亡明顯增加(P<0.001)，24 h時(shí)平均約60%的細(xì)胞發(fā)生凋亡，感染前用3-MA預(yù)處理的，細(xì)胞凋亡增加到約80%(P<0.001，圖2)。

圖1 各組細(xì)胞的Beclin1蛋白表達(dá)

圖2 各組細(xì)胞的凋亡圖(流式細(xì)胞儀)

討論自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用可能存在雙重關(guān)系。一方面自噬可減少腫瘤壞死和炎癥反應(yīng)，減輕代謝過程中的基因損傷，維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞生存；另一方面過度上調(diào)的自噬可以引起腫瘤細(xì)胞死亡，即“自噬性細(xì)胞死亡”，也稱之為Ⅱ型程序化細(xì)胞死亡[4-5]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，KAI1通過抑制胰腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移來抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[6-8]。KAI1亦可誘導(dǎo)人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬[2]。但尚不清楚這種由KAI1誘導(dǎo)的自噬對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用自噬阻斷劑3-MA預(yù)處理細(xì)胞，阻斷其自噬的發(fā)生，之后再感染Ad5-KAI1，使細(xì)胞表達(dá)KAI1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阻斷自噬可顯著增加KAI1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制胰腺癌細(xì)胞的生存，提示KAI1誘導(dǎo)的自噬的主要作用可能是通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)，拮抗MiaPaCa-2細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其生存，即KAI1誘導(dǎo)的自噬從本質(zhì)上講可能是胰腺癌腫瘤細(xì)胞的一種生存機(jī)制。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可通過誘導(dǎo)線粒體的自噬來保護(hù)細(xì)胞產(chǎn)生過多的氧反應(yīng)物質(zhì)和細(xì)胞死亡。本結(jié)果與其一致，即自噬可以保護(hù)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞生存。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，單純應(yīng)用KAI1治療腫瘤療效不甚理想，而KAI1誘導(dǎo)的自噬可能是導(dǎo)致KAI1對(duì)成瘤性影響甚微的原因，即體內(nèi)KAI1對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的這種抑制作用被KAI1和缺氧誘導(dǎo)的高水平自噬給部分抑制了。提示聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑和KAI1可能在胰腺癌的藥物治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.021

國家自然科學(xué)基金(81071982、30470798)

110015 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科(吳春燕、郭曉鐘)；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所(王華)

郭曉鐘，Email:Guoxiaozhong1962@163.com

2011-05-28)

(本文編輯：屠振興)