李雷 劉軍 宛新建 陸倫根 鄭萍 董育瑋 黃春蘭 王興鵬 袁耀宗

·論著·

Vasostatin基因?qū)σ认侔﹥?nèi)皮細(xì)胞遷移的影響

李雷 劉軍 宛新建 陸倫根 鄭萍 董育瑋 黃春蘭 王興鵬 袁耀宗

目的觀察Vasostatin基因表達(dá)對胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。方法應(yīng)用不同濃度的載有Vasostatin基因的腺病毒(Ad-vasostatin)感染胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞，以Ad-lacZ感染及磷酸鹽緩沖液(PBS)作為對照組。應(yīng)用損傷修復(fù)、Transwell小室、小管形成3種不同方法觀察胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的變化及其與感染病毒的量效關(guān)系。結(jié)果培養(yǎng)48 h后，PBS組與Ad-lacZ組的劃痕損傷區(qū)域幾乎完全恢復(fù)；而Ad-vasostatin組的劃痕損傷區(qū)域無明顯恢復(fù)。以MOI 1、2、5感染細(xì)胞，Ad-lacZ組的遷移率分別為(84.7±2.6)%、(80.7±1.7)%和(81.3±4.0)%；Ad-vasostatin組為(77.7±2.1)%、(67.3±2.1)%和(38.8±2.1)%，Ad-vasostatin呈劑量依賴性抑制細(xì)胞遷移率，MOI=5時的細(xì)胞遷移率大幅度降低(F=180.88，P<0.05)。以MOI 1、5、10感染時，Ad-lacZ組的小管形成數(shù)分別為(118±6)、(120±6)、(82±5)個；Ad-vasostatin組為(65±4)、(21±4)、(4±1)個，Ad-vasostatin呈劑量依賴性抑制胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成，在MOI=10時已很難形成管狀結(jié)構(gòu)(F=300.85，P<0.05)。結(jié)論Vasostatin基因能顯著抑制胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞的體外遷移能力，且呈劑量依賴性。

胰腺腫瘤； 細(xì)胞運(yùn)動； 內(nèi)皮細(xì)胞； 血管生成抑制劑

血管生成是一個多步驟的復(fù)雜過程,其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是血管生成的關(guān)鍵步驟[1]。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導(dǎo)的Vasostatin 基因?qū)θ艘认侔┞闶笠浦擦錾L具有抑制作用，并可顯著抑制體內(nèi)、外血管生成與裸鼠移植瘤的血管生成，明顯抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖并誘導(dǎo)其凋亡[2-3]。本研究應(yīng)用攜帶Vasostatin基因的腺病毒感染胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞，觀察其對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。

材料與方法

一、胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞及腺病毒

胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞由本實驗室前期分離、純化，并鑒定[4]。采用含20%胎牛血清、10 ng/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Sigma公司)的專用培養(yǎng)液M131(Cascade公司)常規(guī)培養(yǎng)、傳代。攜帶Vasostatin基因的腺病毒Ad-vasostatin與對照病毒Ad-lacZ由本實驗室前期獲得[2]。

二、損傷修復(fù)實驗[5]

胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)至90%融合后改無血清培養(yǎng)3 h，用移液頭劃個直痕，無血清M131洗兩次，在含2%胎牛血清的M131培養(yǎng)液中分別加入PBS、Ad-vasostatin(MOI=5)和Ad-lacZ(MOI=5)培養(yǎng)0、12、24、48 h，顯微鏡觀察直痕閉合狀況。實驗重復(fù)3次。

三、Transwell小室實驗[6]

分別以PBS、Ad-vasostatin(MOI=1、2、5、10)和Ad-lacZ(MOI=1、2、5、10)感染胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞并重懸于無血清M131培養(yǎng)液，終濃度為5×105個/ml。取100 μl細(xì)胞懸液置于Transwell小室(Corning公司)上層，下層為含1%胎牛血清的M131培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)12 h。取出濾膜，輕擦去上層的未穿膜細(xì)胞，攝片，中性甲醛固定，結(jié)晶紫(Sigma公司)染色。鏡下計穿膜細(xì)胞數(shù)，穿膜細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的百分值為遷移率。實驗重復(fù)3次。

四、小管形成實驗[2-3]

在無菌離心管內(nèi)將冰上過夜融化的100 μl 10×緩沖液和900 μl ECMatrix溶液緩慢混勻，分別取50 μl加入預(yù)冷的96孔板的每孔中，37℃孵育1 h使其凝固，作為小管形成培養(yǎng)基。用MOI為1、5、10的Ad-lacZ和Ad-vasostatin感染細(xì)胞24 h，接種入96孔板，每孔5×104個細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)6 h后倒置顯微鏡下每孔隨機(jī)取5個視野，記錄形成管狀結(jié)構(gòu)的總量。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、細(xì)胞損傷的修復(fù)

隨著時間的推移，對照組與Ad-lacZ組的遷移細(xì)胞數(shù)逐漸增加，劃痕損傷區(qū)域逐漸得以修復(fù)，48 h時幾乎達(dá)到完全恢復(fù)；而Ad-vasostatin組僅見少數(shù)細(xì)胞遷移，且遷移的距離較短，劃痕損傷區(qū)域無明顯恢復(fù)(圖1)。

圖1PBS組(上)、Ad-lacZ組(中)和Ad-vasostatin組(下)單層胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞損傷的修復(fù)(×40)

二、細(xì)胞遷移率

以MOI 1、2、5感染細(xì)胞，Ad-lacZ組的遷移率為(84.7±2.6)%、(80.7±1.7)%和(81.3±4.0)%；Ad-vasostatin組為(77.7±2.1)%、(67.3±2.1)%和(38.8±2.1)%(圖2)，呈劑量依賴性抑制細(xì)胞遷移率。Ad-vasostatin組細(xì)胞的遷移率在MOI為2時較Ad-lacZ明顯減少(F=8.82，P<0.05)；MOI為5時的細(xì)胞遷移率大幅度降低(F=180.88，P<0.05)。

圖2Ad-lacZ組(a)、Ad-vasostatin組(b)和PBS組(c)的穿膜細(xì)胞(×100)

三、小管形成數(shù)量

PBS組細(xì)胞在ECMatrix上呈線形排列，形成中空的管狀結(jié)構(gòu)約120個左右。以MOI 1、5、10感染，Ad-lacZ組的小管形成數(shù)為(118±6)、(120±6)、(82±5)個；Ad-vasostatin組為(65±4)、(21±4)、(4±1)個(圖3)，呈劑量依賴性抑制胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成。Ad-vasostatin組在MOI為1時小管形成即顯著減少(F=102.4，P<0.05)；MOI為5時小管形成進(jìn)一步減少(F=476.17，P<0.05)；MOI為10時已很難形成管狀結(jié)構(gòu)(F=300.85，P<0.05)。

圖3Ad-lacZ組(a)、Ad-vasostatin組(b)和PBS組(c)細(xì)胞形成的小管(×100)

討 論

腫瘤抗血管生成研究多是以人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞或其他正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象的[2,7]。這是一種間接的、模擬的研究，并受到多種因素制約與干擾。隨著細(xì)胞分離技術(shù)的日益成熟，腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞(tumor endothelial cells，TEC)的概念浮出水面。TEC是形成腫瘤內(nèi)部新生血管的、增殖活躍的血管內(nèi)皮細(xì)胞，是腫瘤血管生成的基本單位，也是腫瘤抗血管生成治療的靶細(xì)胞[8]。我們前期已成功分離，純化了胰腺癌TEC[2]，并報道Ad-vasostatin轉(zhuǎn)染可以抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[2-3]。本研究采用Ad-vasostatin感染胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果顯示，Ad-vasostatin感染后，胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞的損傷修復(fù)被抑制、穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少，難以形成管腔結(jié)構(gòu)，從不同層面證實Vasostatin能明顯抑制胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，且具有劑量依賴性，表明Vasostatin基因?qū)σ认侔┑目寡苌勺饔貌坏珰w因于其對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制，而且歸因于其對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制。

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Inhibitoryeffectofvasostatinonmigrationofpancreaticcancerendothelialcells.

LILei,LIUJun,WANXin-jian,LULun-gen,ZHENGPing,DONGYu-wei,HUANGChun-lan,WANGXing-peng,YUANYao-zong.
DepartmentofGastroenterology,ShanghaiFirstPeople′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201620,China

LILei,Email:lilei2968900@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect of vasostatin on the migration of pancreatic cancer endothelial cells.MethodsAd-vasostatin with different concentrations of vasostatin was used to transfect pancreatic cancer endothelial cells. Ad-LacZ transfection and PBS was used as control. The effect of vasostatin gene mediated by adenovirus on the migration of pancreatic cancer endothelial cells was measured by wound-healing assay, transwell migration assay, and tube formation assay.ResultsThe scratched lines in PBS group and Ad-LacZ group were almost healed 48 hours later, while the lines in Ad-vasostatin group were rarely healed. At the MOI of 1, 2, 5, the migration rate of Ad-Laz group was (84.7±2.6)%, (80.7±1.7)% and (81.3±4.0)%, while the corresponding values were (77.7±2.1)%, (67.3±2.1)% and (38.8±2.1)% in Ad-vasostatin group. Transwell migration assay indicated that the number of migrated cells in Ad-vasostatin group was inhibited in a dose-dependant manner, at the MOI of 5, the migration became significantly decreased (F=180.88,P<0.05). At the MOI of 1, 5, 10, the number of tubes in Ad-LacZ group was 118±6,120±6 and 82±5, while the corresponding values were 65±4, 21±4 and 4±1 in Ad-vasostatin group. The number of tubes of pancreatic cancer endothelial cells was inhibited by Ad-vasostatin in a dose-dependant manner, at the MOI of 10, it was difficult to form the tubes (F=300.85,P<0.05).ConclusionsThe vasostatin gene mediated by adenovirus has a significant inhibitory effect on the migration of pancreatic cancer endothelial cells in vitro in a dose-dependent manner.

共同第一作者：劉軍

Pancreatic neoplasms; Cell movement; Endothelial cells; Angiogenesis inhibitors

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.006

國家自然科學(xué)基金(81072006)；上海市自然科學(xué)基金(07ZR14063)；國家留學(xué)基金(2009831457)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院“新百人計劃”

201620 上海，上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(李雷、宛新建、陸倫根、鄭萍、董育瑋、黃春蘭、王興鵬)；復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(劉軍)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化科(袁耀宗)

李雷，Email：lilei2968900@hotmail.com

2011-08-17)

(本文編輯：屠振興)