郭興軍 田銳 王敏 何政 李旭 謝晨成 趙睿 秦仁義

T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1在胰腺癌中的表達(dá)及其意義

郭興軍 田銳 王敏 何政 李旭 謝晨成 趙睿 秦仁義

T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor,Tiam1)被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)，且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[1-4]，但Tiam1與胰腺癌的關(guān)系尚不明確。本研究檢測(cè)Tiam1在胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，探討其臨床意義。

一、材料和方法

1．材料：收集我院2009年1月至2010年12月手術(shù)切除的胰腺癌組織標(biāo)本27例，術(shù)后病理診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌。人胰腺癌細(xì)胞系PANC1、MIAPaCa2、BxPC3、ASPC1、PC3為本實(shí)驗(yàn)室長期冷凍保存，復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

RPMI 1640培養(yǎng)基購自HyCone公司；新生牛血清購自HyClone公司；Trizol試劑購自invitrogen公司；Reverse Transcription System試劑盒、Tiam1和GAPDH濃縮型兔抗人Tiam1多抗購自abcam公司。SABC、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。蛋白質(zhì)印跡法相關(guān)試劑購自武漢博士德公司。ECL顯色試劑盒、全細(xì)胞蛋白提取試劑盒、BCA法測(cè)蛋白濃度試劑盒均購自碧云天公司。

2．Tiam1 mRNA表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用Trizol提取胰腺癌細(xì)胞總RNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。應(yīng)用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,Tiam1的上游5′-AGACGTACTCAGGCCATGTC-3′，下游5′-ACC-CAAATGTCGCAGTCAGG-3′，產(chǎn)物252 bp；內(nèi)參GAPDH上游5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，下游5′-GACAAGCTTCCC-GTTCTCAG-3′，產(chǎn)物259 bp。引物由Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。mRNA表達(dá)量用2-ΔΔCt公式計(jì)算。ΔΔCt =[Ct(Tiam1)-Ct(GAPDH)]實(shí)驗(yàn)組-[Ct(Tiam1)-Ct(GAPDH)]對(duì)照組。 以MIAPaCa2的表達(dá)量作為對(duì)照，計(jì)為1。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),取均值。

3．Tiam1蛋白檢測(cè)：用細(xì)胞裂解液提取全細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Tiam1蛋白表達(dá)。Tiam1抗體工作濃度為1∶100。用Quality one軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量吸光值分析，以MIAPaCa2的表達(dá)量作為對(duì)照，計(jì)為1。

胰腺癌和癌旁正常胰腺組織采用免疫組化染色法檢測(cè)Tiam1蛋白表達(dá)。Tiam1抗體工作濃度為1∶500,以PBS取代一抗為陰性對(duì)照。胞質(zhì)和胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。高倍鏡下觀察5個(gè)視野。判斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：無染色為陰性，淺黃色細(xì)胞≤10%為可疑陽性(±)，淺黃色細(xì)胞>10%為弱陽性(+)，棕黃色細(xì)胞>30%為陽性(++)，棕黃色細(xì)胞>70%為強(qiáng)陽性(+++)?！?、+為低表達(dá)，++、+++為高表達(dá)。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行處理。免疫組化結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

MIA-PaCa2、PANC1、BxPC3、ASPC1、PC3細(xì)胞的Tiam1 mRNA表達(dá)水平分別為1、0.9883、0.6391、0.5340、0.4067； Tiam1蛋白表達(dá)水平分別為1、0.9711、0.5743、0.3720、0.2902(圖1)。

27例胰腺癌標(biāo)本中均有Tiam1蛋白表達(dá)，而癌旁正常胰腺組織中不表達(dá)Tiam1蛋白(圖2)。胰腺癌組織Tiam1蛋白表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小均無關(guān)，而與胰腺癌的病理分化程度和轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(表1)。

圖1 胰腺癌細(xì)胞Tiam1蛋白的表達(dá)

圖2胰腺癌旁組織(a)、胰腺癌組織Tiam1蛋白低(b)和高(c)表達(dá)(×100)

表1 胰腺癌組織Tiam1蛋白表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系

討論Tiam1基因位于人染色體21q22·1，其編碼產(chǎn)物是由1591個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，屬于Dbl家族成員(diffuse B-cell lymphoma oncogene family)[6]。Tiam1含有許多重要的功能區(qū)：羧基端DH和PHc功能區(qū)，氨基端PHn-CC-EX結(jié)構(gòu)區(qū)和DHR(或稱PDZ)、RBD功能區(qū)等。

Borguignon等[7]報(bào)道，Tiam1可以通過影響下游的rac1調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移。王雅娟等[8]報(bào)道，Tiam1在結(jié)腸癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。Engers等[4]、Ding等[9]報(bào)道，Tiam1表達(dá)與肝癌、前列腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)， Tiam1高表達(dá)患者的預(yù)后明顯較差。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌細(xì)胞系的Tiam1蛋白和mRNA表達(dá)在侵襲能力較弱、分化程度較高的BxPC3、ASPC1、PC3細(xì)胞系中相對(duì)低表達(dá)；在侵襲能力較強(qiáng)、分化程度較低的MIAPaCa2、PANC1細(xì)胞系中相對(duì)高表達(dá)。胰腺癌組織100%表達(dá)Tiam1蛋白，而癌旁胰腺組織不表達(dá)Tiam1蛋白。提示Tiam1基因高表達(dá)參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，其高表達(dá)反映了腫瘤的惡性生物學(xué)行為。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.015

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秦仁義，Email:ryqin@tjh.tjmu.edu.cn

2011-06-22)

(本文編輯：呂芳萍)