張曉紅，呼 競(jìng)，華正德，關(guān) 磊

（哈爾濱市婦幼保健院，黑龍江 哈爾濱150070）

維生素A是脂溶性維生素，亦名視黃醇，是體內(nèi)維持正常視覺(jué)、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、維持上皮完整、維持正常免疫功能以及增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力的重要物質(zhì)。其缺乏會(huì)損害兒童免疫功能，增加兒童死亡率。維生素A缺乏病是WHO公認(rèn)的四大營(yíng)養(yǎng)缺乏病之一，發(fā)展中國(guó)家因維生素A缺乏引起干眼病而致盲的患者高達(dá)1000萬(wàn)以上，目前仍是不發(fā)達(dá)國(guó)家中威脅人類健康、尤其是兒童的主要疾病?！笆澜鐑和瘑?wèn)題首腦會(huì)議”及“90年代中國(guó)兒童發(fā)展規(guī)劃綱要”，將消除維生素A缺乏作為2000年戰(zhàn)略目標(biāo)之一。維生素E（Vitamin E）也是脂溶性維生素，又稱生育酚，是維持機(jī)體正常代謝和機(jī)能的必需維生素。生育酚能促進(jìn)性激素分泌，使男性精子活力和數(shù)量增加；使女性雌性激素濃度增高，提高生育能力，預(yù)防流產(chǎn)，還可用于防治男性不育癥、在抗氧化、抗自由基、提高免疫功能、抗衰老、抗癌變等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，缺乏時(shí)會(huì)引起心、肝和肌肉退化以及不生育、習(xí)慣性流產(chǎn)、脫發(fā)、肌營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)變化和貧血等。故及時(shí)了解血液中維生素A、E的含量對(duì)臨床預(yù)防、診斷、治療有重要意義。本文在以往工作基礎(chǔ)上，改良了檢測(cè)條件，建立了高效液相色譜－庫(kù)侖電化學(xué)同時(shí)檢測(cè)人血清中維生素A、E含量的方法，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，回收率和重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果可靠。

1 材料和方法

1.1 原理 用乙醇沉淀蛋白質(zhì)，用己烷萃取維生素A、E，殘留物用乙醇重新溶解，這些化合物用C18柱通過(guò)反相液相色譜法來(lái)分離，用庫(kù)侖陣列電化學(xué)來(lái)檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 美國(guó)ESA的高效液相色譜－庫(kù)侖電化學(xué)檢測(cè)分析系統(tǒng)，542自動(dòng)進(jìn)樣器（含制冷）；582型泵兩臺(tái)（梯度泵）；控溫元件箱。

1.2.2 試劑 標(biāo)準(zhǔn)品由Sigma公司提供，利用無(wú)水乙醇等試劑配制成從低到高5個(gè)不同濃度的混合標(biāo)液，標(biāo)液中含有一定量的維生素A、E及內(nèi)標(biāo)物維生素A醋酸鹽。

1.2.3 色 譜 條 件 色 譜 柱：ESA MD－150C18 Column（150mm×3.0mm，3μm）。檢測(cè)電壓：各通道電壓（mv）：200、400、550、800。

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品采集 采集受檢者靜脈血或末梢血（適用于3歲以下兒童），離心后提取100μl血漿或血清。1.3.2 對(duì)樣品進(jìn)行前處理 將100μl血漿或血清，利用化學(xué)試劑沉淀蛋白后萃取維生素A、E，并用氮?dú)鈱⒁瞥鑫锎党筛稍餇顟B(tài)，殘留物用100μl ETOH／BHA液重新溶解等待測(cè)定。

1.4 測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按上述條件，采用內(nèi)標(biāo)法，用4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 樣品測(cè)定 取處理好的樣品10μl進(jìn)樣，按上述條件進(jìn)行分析，獲得圖譜，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.5 質(zhì)量控制 收集正常人20份血清（或血漿）足量，加入200μg／dl、1 000μg／dl的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用雙水平質(zhì)控，取得有效數(shù)據(jù)作為質(zhì)量控制使用。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖 維生素A、E檢測(cè)的樣品圖見(jiàn)圖1。

2.2 線性范圍和檢出限 配置不同濃度維生素A、E標(biāo)準(zhǔn)溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)3倍基線噪聲所對(duì)應(yīng)的維生素濃度計(jì)算方法的最低檢出限。

2.2.1 線性檢測(cè) 對(duì)維生素A、E標(biāo)液進(jìn)行倍比稀釋，等體積進(jìn)樣，以每種維生素濃度的峰面積作圖，測(cè)出最低檢測(cè)限及線性回歸方程。見(jiàn)表1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性 配置同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)5天進(jìn)行測(cè)定，以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差觀察維生素E、A標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。結(jié)果表明，不同濃度的維生素A、E標(biāo)準(zhǔn)溶液在－20℃比較穩(wěn)定，建議每周進(jìn)行一次標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置。表1 樣品線性范圍和檢出限

圖1 維生素A、E檢測(cè)色譜圖結(jié)果

項(xiàng)目 線性范圍 （μg／L） 線性方程 相關(guān)系數(shù) 最低檢測(cè)限（μg／L）＋0.003051 0.9952 0.052 VA 0.068－200 Y＝0.003984 X VE 0.112－2000 Y＝0.001689 X＋0.0001761 0.9997 0.038

表2 VE標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性

VE濃度（μg／L）VE檢測(cè)的峰面積（微庫(kù)侖：μC）第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 R SD（%）2000 3.79 3.74 3.69 3.66 3.61 1.90 4000 7.39 7.35 7.17 7.19 7.11 1.68 10000 17.0 16.7 16.3 16.5 15.9 2.52 20000 30.2 29.1 28.9 28.7 28.0 2.75

表3 VA標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測(cè)定7次，以峰面積的RSD觀察精密度，維生素E、A的RSD分別為1.91%、2.9%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 VE精密度實(shí)驗(yàn)

2.5 回收實(shí)驗(yàn) 取3份血清樣本，加入3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（n＝3），維生素E、A平均回收率分別在90%－111%、93%－102%，結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

表5 維生素E加標(biāo)回收率結(jié)果

表6 維生素A加標(biāo)回收率結(jié)果

3 方法應(yīng)用

用本方法分別同時(shí)測(cè)定了6歲以下兒童血清／血漿維生素A、E樣品120份；孕婦血清／血漿維生素A、E樣品90份。

結(jié)果表明血清中兒童維生素A的檢測(cè)范圍為26－51μg／L，孕婦維生素 A的檢測(cè)范圍為34－56μg／L，孕婦與兒童的維生素A水平有顯著差異，P＜0.01；6歲以下兒童維生素E的檢測(cè)范圍為342－1410μg／L，孕婦維生素E的檢測(cè)范圍為375－1731 μg／L，孕婦與兒童的維生素E水平無(wú)顯著差異，P＞0.01。

4 討論

4.1 檢測(cè)器的選擇 該系統(tǒng)采用電化學(xué)檢測(cè)器，比二極管檢測(cè)器數(shù)值定性靈敏度高1000倍，穿透式電極，實(shí)現(xiàn)了樣品100%的反應(yīng)，沒(méi)有信號(hào)損失。自動(dòng)進(jìn)樣器，可精確進(jìn)樣最小至1μl，并含有樣品盤(pán)冷卻裝置，保證了熱穩(wěn)定性差、易分解的維生素A、E在分析過(guò)程中無(wú)樣品損失。

4.2 高壓梯度泵的應(yīng)用 通過(guò)連續(xù)不斷地調(diào)整A、B流動(dòng)相的配比，改善分離條件，提高分離效果，縮短分析時(shí)間。

4.3 流動(dòng)相的選擇 由于維生素A、E為脂溶性維生素，故本法選擇以甲醇為主的流動(dòng)相洗脫液。流動(dòng)相為甲醇、水、正丙醇、磷酸鹽緩沖溶液按比例配成。

4.4 流速的選擇 改變流速不僅可以改變保留時(shí)間，同時(shí)對(duì)靈敏度也有一定的影響。實(shí)驗(yàn)證明，在0.8ml／min時(shí)，維生素A、E的峰面積達(dá)最大值。

4.5 色譜柱的選擇 鑒于HPLC法一般使用C8、C18柱，比較了C8、C18柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用C18 3μm的柱子將維生素A、E很好地分離，且峰形好。

4.6 樣品的選擇 通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)論證了采集末梢血，同時(shí)檢測(cè)維生素A、E的目的。

4.6.1 樣品的前處理 實(shí)驗(yàn)表明，連續(xù)2次加入450μl正己烷進(jìn)行二次萃取可達(dá)到分析要求。萃取時(shí)，漩渦混勻的力度和時(shí)間應(yīng)盡量一致，否則影響提取效率和精密度。

4.6.2 樣品的濃縮 用氮?dú)獯蹈奢腿∫簳r(shí)，氮?dú)饬髁繎?yīng)盡量小，以防待測(cè)物質(zhì)的損失。溶解殘?jiān)鼤r(shí)加入的乙醇量應(yīng)準(zhǔn)確，否則影響待測(cè)物濃度。

4.7 暗室的應(yīng)用 為了避免樣品見(jiàn)光分解，樣品處理過(guò)程需在暗處。

4.8 我院引進(jìn)的高效液相色譜－庫(kù)侖電化學(xué)分析系統(tǒng)，其靈敏度高，準(zhǔn)確性好，對(duì)維生素A、E分析結(jié)果表明，此檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、可靠；是目前維生素A、E檢測(cè)的最佳方法。

4.9 運(yùn)用高效液相色譜－庫(kù)侖電化學(xué)分析系統(tǒng)開(kāi)展維生素A、E的聯(lián)合檢測(cè)，達(dá)到了一次采血可同時(shí)準(zhǔn)確分析體內(nèi)維生素A、E的含量。末梢血的采用極大方便了兒童，有利于此項(xiàng)工作在廣大基層開(kāi)展。改變目前濫用維生素制劑的現(xiàn)象，達(dá)到合理用藥的目的，極大的降低了由于維生素A、E缺乏或中毒引起相關(guān)疾病的治療費(fèi)用。

［1］劉雪平.高效液相色譜－庫(kù)侖電化學(xué)檢測(cè)法對(duì)多種脂溶性維生素及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分析［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2003，13（5）：597.

［2］鄭妹鳳.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定兒童血清中維生素A、E含量的研究［J］.安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，14（3）：110.

［3］李影林主編.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)全書(shū)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：157－162.

［4］李靜娜.二極管陳列反相高效液相色譜法測(cè)定人血清中維生素E含量［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（2）：2.