郭 睿，郝雁杰，汪京峽，劉 霞，楊文斌

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川750004；2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 皮膚科；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 皮膚科）

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性疾病，其白斑可發(fā)生在身體任何部位，但因病因復(fù)雜，目前尚無滿意的治療方法，因白斑多發(fā)在暴露部位，患者生活質(zhì)量受到影響。近年來，國內(nèi)外許多文獻研究了維生素D受體（Vitamin D Recepter VDR）與自身免疫性疾病的關(guān)系，1，25－二羥膽骨化醇［1，25（OH）2D3］是維生素D的活性形式，介導(dǎo)VDR發(fā)揮與免疫性疾病 有 關(guān) 的 生 物 學(xué) 效 應(yīng)［1］。近 年 發(fā) 現(xiàn) 1，25（OH）2D3和類似物通過VDR影響黑素生成，調(diào)節(jié)機體的免疫功能［2］，從而與白癜風(fēng)的發(fā)病有一定的相關(guān)性，也有研究表明白癜風(fēng)患者存在VDR的低表達，而且發(fā)現(xiàn)維生素D衍生物對白癜風(fēng)具有治療作用［3］。本文運用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（PCR－RFLP）技術(shù)檢測寧夏地區(qū)回漢族白癜風(fēng)患者與正常對照組中VDR基因FokI、BsmI位點的頻率分布，以分析VDR與回漢族白癜風(fēng)患者發(fā)病的相關(guān)性，更重要的是為維生素D治療白癜風(fēng)患者提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 來自本院2008年3月至2011年3月皮膚科門診參照文獻［4］確診的尋常型白癜風(fēng)患者251例，其中漢族136例，回族115例，男性130人，女性121人，年齡3歲－75歲。正常對照組來自本院體檢的健康人263例，漢族142例，回族121例，其中男性137人，女性126人，年齡在18歲－65歲，1，2，3級親屬中均無白癜風(fēng)患者?；颊咧g、對照組之間及患者與對照組之間均無血緣關(guān)系，對照組性別、年齡與患者組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有的研究對象簽署知情同意書，并完成流行病學(xué)調(diào)查表，靜脈采血3－5ml，EDTA抗凝，－20℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 取外周EDTA抗凝血200μl，采用Tangen公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用紫外分光光度法 （A260／280比值）確定DNA純度，A260測定DNA濃度。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 參照文獻［5］設(shè)計引物，F(xiàn)okI： 5′ AGCTGRCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT3′， 5′ GAGGGAGAAGAAGCAAGGTGTTTCCAT3′。 BsmI： 5′ GGGAGACGTAGCAAAAGG3′，5′CAGTGACCCTTGACCTCT3′。

1.2.3 PCR－RFLP檢測兩個SNPs的基因型

1.2.3.1 PCR反應(yīng)體系 ddH2O 5.15μl，2×PCR Mix6.25μl，Primer F（10μmol／L）0.25μl，Primer R （10μmol／L）0.25μl，Taq DNA polymerase（5 U／μl）0.1μl，DNA template（50ng／μl）0.5μl，總體積12.5μl。

1.2.3.2 PCR反應(yīng)條件設(shè)置 預(yù)變性95℃5min，變性95℃30s，退火60℃30s（FokI）、52℃30s（BsmI），延伸72℃30s，總延伸72℃10min，35個循環(huán)。PCR完成后，用2.5%瓊脂糖電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.3.3 限制性核酸內(nèi)切酶的選擇及酶切反應(yīng)條件：分別為FokI和BsmI限制性內(nèi)切酶下37℃孵育16小時。

1.2.3.4 FokI酶切反應(yīng)體系：FokI酶0.25μl，10×NEBbuffer 1μl，ddH2O3.75μl，DNA 模板5μl，總體積10μl；BsmI酶切反應(yīng)體系：BsmI酶0.25 μl，10×NEBbuffer 1μl，ddH2O 3.65μl，100×BSA0.1μl，DNA模板5μl，總體積10μl。酶切孵育完成后進行3%瓊脂糖凝膠電泳，并在Syngene凝膠成像儀下觀察并記錄結(jié)果，判斷基因型。

1.2.4 質(zhì)量控制

1.2.4.1 重復(fù)性試驗 為保證酶切結(jié)果的正確性，隨機抽取了30例樣本進行了2個SNPs位點的PCRRFLP重復(fù)實驗，結(jié)果與先前的分型結(jié)果均一致。

1.2.4.2 實驗結(jié)果的雙遍錄入 用Excel建立數(shù)據(jù)庫，對實驗結(jié)果雙遍錄入和校對。內(nèi)容包括樣本編號、年齡、姓名和2個SNPs的基因分型結(jié)果，然后進行數(shù)據(jù)合并，經(jīng)數(shù)據(jù)整理和校對無誤后應(yīng)用SPSS13.0軟件進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在SPSS13.0軟件中將實驗數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫?；蛐皖l率等計數(shù)資料分析采用χ2檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，用OR值和95%CI確定SNPs多態(tài)性分型與白癜風(fēng)的相關(guān)性。

Hardy－Weinberg平衡定律吻合度、各SNPs間連鎖不平衡（LD）分析和單體型分析均采用SHEsis在線軟件進行分析（http：／／analysis.bio－x.cn／my－Analysis.php）。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡性檢驗（Hardy－Weinberg檢驗）

應(yīng)用SHEsis軟件對患者組和對照組FokI、BsmI兩個位點的基因型分布進行 Hardy－Weinberg平衡檢驗，均符合 H－W 平衡（P＞0.05），說明所選對照組具有群體代表性。

2.2 VDR基因FokI、BsmI位點多態(tài)性酶切結(jié)果

圖1為FokI（C→T）位點酶切電泳圖譜，1泳道為FF野生純合子，產(chǎn)生267bp一個片段，2、3、7、8、9泳道為Ff雜合子，產(chǎn)生267bp、206bp和61bp（由于61bp片段過小，在3%瓊脂糖凝膠電泳中不易分辨，但不影響基因型分析）三個片段，5、6、10泳道為ff突變純合子，產(chǎn)生206bp和61bp兩個片段，M 為100bp－600bp DNA Marker。圖2為BsmI（A→G）位點酶切電泳圖譜，1、2、3、4、6、7、8、9、10泳道為bb純合突變子，產(chǎn)生193bp和165bp兩個片段，5泳道為Bb雜合子，產(chǎn)生358bp、193bp和165bp三個片段，11泳道為BB純合子，產(chǎn)生358 bp一個片段，M為100bp－600bp DNA Marker。

圖1 FokI位點酶切電泳圖譜

圖2 BsmI位點酶切電泳圖譜

2.3 VDR基因FokI、BsmI位點基因型分布及與白癜風(fēng)易感性的關(guān)系。

2.3.1 FokI位點的基因型和等位基因的分布頻率在寧夏回漢族白癜風(fēng)患者和對照組中均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3.2 BsmI位點的基因型和等位基因在寧夏回漢族白癜風(fēng)患者和對照組中的分布頻率見表1－3。

2.4 VDR基因單體型與白癜風(fēng)遺傳易感性的關(guān)聯(lián)分析

連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）分析采用SHEsis軟件分析VDR基因FokI和BsmI的連鎖不平衡系數(shù)（coefficient of linkage disequilibrium，D’），結(jié)果顯示各SNP位點兩兩之間均存在較強連鎖不平衡，各位點間均D’＞0.6。

表1 寧夏回族白癜風(fēng)患者組與對照組BsmI位點基因頻率的分布

表2 寧夏漢族白癜風(fēng)患者組與對照組BsmI位點基因頻率的分布

表3 寧夏地區(qū)白癜風(fēng)患者組與對照組Bsm I位點基因頻率的分布

3 討論

VDR基因位于12號染色體，且有高度多態(tài)性［6］，近年來對VDR的研究主要集中在第二外顯子FokI、第八外顯子BsmI、ApaI、第九外顯子TagI以及在3’端下游區(qū)域的poly－A多態(tài)性［7］。到目前為止，已在多個種族和民族中發(fā)現(xiàn)VDR基因呈多態(tài)性分布，在不同種族和民族中分布有差異［8］。非洲人VDR FokI位點f等位基因的頻率低于亞洲人和高加索人。亞洲人BsmI位點的B等位基因的頻率低于高加索人和非洲人［9］。中國漢族人口中BsmI位點呈多態(tài)性分布，突變型BB基因型頻率與韓國人的分布頻率相似，而遠低于白種人的分布頻率［10］。

目前，國內(nèi)外許多學(xué)者研究了不同地區(qū)及不同民族的白癜風(fēng)患者與VDR基因多態(tài)性的相關(guān)性，而尚無寧夏地區(qū)回、漢族白癜風(fēng)與VDR基因多態(tài)性相關(guān)的研究，本課題分析了VDR基因Fok I和Bsm I兩個位點與寧夏地區(qū)回、漢族白癜風(fēng)患者發(fā)病的相關(guān)性，結(jié)果表明：Fok I位點基因型及等位基因的頻率在寧夏回、漢族病例組與對照組的分布均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而試驗結(jié)果表明寧夏回族白癜風(fēng)患者攜帶BsmI位點的Bb基因型的頻率低于寧夏回族正常人群，分布有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），提示了攜帶Bsm I的Bb基因型的回族正常人群白癜風(fēng)的發(fā)病率可能減少，另外寧夏白癜風(fēng)患者攜帶BsmI位點的Bb基因型的頻率也低于正常對照人群，分布有顯著差異（P＜0.05），推測Bb基因型可能是寧夏地區(qū)尤其是回族人群中白癜風(fēng)發(fā)病的保護因素，在寧夏漢族白癜風(fēng)和對照組中BsmI位點的基因型及等位基因的頻率分布均無統(tǒng)計學(xué)意義。B等位基因在寧夏白癜風(fēng)患者組與對照組間分布差異具有顯著性意義（P＜0.05），提示B等位基因可能也是白癜風(fēng)發(fā)生的保護因子。楊勵［11］等研究了中國西北地區(qū)白癜風(fēng)患者及正常人群中VDR基因BsmI、FokI等位點基因型頻率和等位基因頻率的分布，結(jié)果顯示FokI位點基因型的頻率分布白癜風(fēng)患者與正常對照組無顯著性差異，這一點與我們的研究結(jié)果相同，但不同的是楊勵的結(jié)果中bb基因型在白癜風(fēng)患者中頻率較高，白癜風(fēng)患者與正常對照組有顯著性差異，可能與白癜風(fēng)的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。孫越，韓菁［12，13］等研究表明華中地區(qū) VDR BsmI位點Bb基因型在漢族尋常型白癜風(fēng)患者中頻率較高，攜帶Bb基因型可能會增加漢族人群患白癜風(fēng)的易感性，而本課題的結(jié)果卻是VDR BsmI位點Bb基因型是寧夏地區(qū)尤其是回族人群中白癜風(fēng)發(fā)病的保護因素，這進一步證實了不同民族及不同地區(qū)中VDR多態(tài)性的差異。Uitterlinden［14］在他的VDR的基因和生物學(xué)多態(tài)性一文中提出不同的種族群體中，等位基因頻率的差別很可能是進化進程和人群遺傳學(xué)行為的結(jié)果。白癜風(fēng)還是一種由多種易感基因的組合致病作用和未知的環(huán)境為誘因的復(fù)雜綜合征［15］，所以，生活環(huán)境的差異、飲食習(xí)慣的迥異、體內(nèi)維生素D水平的高低、日照時間的長短以及觀察樣本數(shù)大小等因素也是一些可能發(fā)生此種結(jié)果的合理解釋。白癜風(fēng)作為多基因遺傳疾病，由多個表型效應(yīng)很小的微效基因作用，其表現(xiàn)型是遺傳基因和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，需要結(jié)合周圍環(huán)境因素綜合分析。因此，對于VDR基因多態(tài)性與白癜風(fēng)的關(guān)系還需在其他不同地區(qū)、不同民族之間進行更大樣本的研究，并以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)研究，以及與其他可能的易感基因進行連鎖分析。隨著研究的進一步加深，會為VDR的生化功能與白癜風(fēng)之間的關(guān)系提供基本參考信息。

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