闞秀芳，趙麗晶，李 浩，李丁洋，邵 晨，謝愛(ài)國(guó)，趙麗娟＊

（1.長(zhǎng)春市第二醫(yī)院 內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130062；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系；3.沈陽(yáng)軍區(qū)空軍招收飛行學(xué)員體檢隊(duì)）

常染色體顯性遺傳多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是一種較常見(jiàn)的單基因遺傳性疾病，在人群中發(fā)病率高達(dá)1／1000－1／400，占我國(guó)終末期腎衰竭病因的第4位。ADPKD病變以雙腎多發(fā)性進(jìn)行性囊泡為主要特征，繼發(fā)引起腎功能改變，終末期導(dǎo)致腎衰。ADPKD病程長(zhǎng)，給病人和社會(huì)造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較大。目前，除應(yīng)用腎移植和透析治療終末期腎衰，尚無(wú)能夠阻止囊泡的發(fā)生和生長(zhǎng)的有效藥物［1－2］。因此，針對(duì)ADPKD的發(fā)病機(jī)制，尋找預(yù)防或延緩ADPKD發(fā)病甚至逆轉(zhuǎn)其病程的新藥物是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

我們的前期研究結(jié)果表明：8周齡jck小鼠腎臟顯著增大，出現(xiàn)多發(fā)、大小不一的腎囊泡。囊泡上皮細(xì)胞呈扁平狀，提示由于囊液過(guò)度分泌引起的囊內(nèi)壓增加所致。jck腎囊泡上皮細(xì)胞表達(dá)AQP2、AQP3和AQP4，提示其腎囊泡上皮細(xì)胞來(lái)源于腎集合管，并具有腎集合管的功能特性［3］。

目前認(rèn)為多囊腎病腎囊泡的發(fā)生和進(jìn)展主要是三個(gè)病理過(guò)程共同作用的結(jié)果：腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度增殖、囊泡內(nèi)液體的積聚和細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)［4，5］。激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）可以使細(xì)胞內(nèi)cAMP增加，激活PKA，在生長(zhǎng)因子和細(xì)胞內(nèi)低鈣的共同作用下，通過(guò)激活 Raf－1／B－Raf－MEK－ERK通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖。但MAPK在jck多囊腎動(dòng)物模型多囊腎囊泡發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬應(yīng)用jck PKD小鼠模型，評(píng)價(jià)信號(hào)通路蛋白在jck小鼠腎囊泡上皮細(xì)胞的調(diào)控，確定jck PKD腎囊泡上皮細(xì)胞異常增殖過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路所起的作用，為研究腎囊泡生成和增大機(jī)制，探討抑制PKD囊泡增大的藥物作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料 H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK、ERK、c－fos和β－actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，ECL Plus試劑盒購(gòu)自Amersham公司。

1.2 動(dòng)物模型 雜合子jck PKD小鼠模型購(gòu)于Jackson Lab，潔凈級(jí)條件飼養(yǎng)，經(jīng)雜合子相互交配獲得純合子小鼠。12周齡時(shí)稱(chēng)體重，取雄性小鼠血進(jìn)行血尿素測(cè)定，分離腎臟進(jìn)行腎臟指數(shù)、腎臟組織學(xué)、蛋白表達(dá)調(diào)控分析。同窩雄性野生型小鼠作對(duì)照。

1.3 組織學(xué)觀察 將腎臟組織標(biāo)本用10%甲醛固定后，石蠟包埋、切片，然后進(jìn)行蘇木精伊紅（HE）染色。光學(xué)顯微鏡下觀察、照相。

1.4 Western blot 腎組織超聲勻漿30s，用Biorad蛋白定量試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行蛋白定量。配制12%SDS－PAGE凝膠，取20μg蛋白質(zhì)樣品，加入等體積2×上樣緩沖液，100V恒壓電泳，采用Bio－Rad轉(zhuǎn)膜儀將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF蛋白轉(zhuǎn)移膜上，再將PVDF膜置于5% 脫脂奶粉中室溫封閉60 min。TBS－T漂洗2次，加入1∶500倍稀釋的抗H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK、ERK、c－fos、和 β－actin多克隆抗體，4℃下反應(yīng)過(guò)夜，TBS－T洗膜10 min×3次，加入1∶10 000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育30min，TBS－T洗膜。ECL Plus試劑盒顯影。

2 結(jié)果

2.1 jck PKD小鼠表型 12周齡jck純合子小鼠體重明顯低于同窩野生型小鼠（圖1A），可見(jiàn)腹部明顯增大，活動(dòng)受限。jck純合子小鼠的腎臟指數(shù)大于野生型小鼠腎臟4倍以上（P＜0.01，圖1B）。血尿素水平在jck純合子小鼠超過(guò)60mM，為野生型的7倍以上（P＜0.01，圖1C），提示已出現(xiàn)嚴(yán)重的腎功能損傷。

2.2 jck PKD小鼠腎臟組織形態(tài) 12周齡jck純合子小鼠腎臟組織表現(xiàn)多發(fā)、大小不一囊泡，囊泡上皮細(xì)胞呈扁平狀，腎囊泡占腎組織的90%以上（圖2A）。而同窩野生型小鼠腎臟則呈現(xiàn)正常腎組織結(jié)構(gòu)（圖2B）。

2.3 MAPK信號(hào)通路蛋白在腎臟的表達(dá)調(diào)控Western Blot分析結(jié)果表明，jck腎臟表達(dá)的 HRas、p－Raf、p－MEK、pERK 和c－fos蛋白水平與野生型腎臟相比明顯上調(diào)，表明囊泡上皮細(xì)胞表達(dá)的Raf、MEK、ERK在jck腎臟的磷酸化明顯高于其在野生型腎臟的表達(dá)水平，其可能是MAPK通路激活所致。見(jiàn)圖3。

圖1 jck小鼠表型

圖2 jck純合子小鼠腎臟異常

圖3 MAPK信號(hào)通路在多囊腎組織調(diào)控分析

3 討論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因自發(fā)突變可引起小鼠PKD。這些PKD小鼠模型多為常染色體隱性遺傳，但其病理學(xué)特征類(lèi)似人常染色體顯性遺傳PKD［6］，常被用作PKD模型研究PKD的發(fā)病機(jī)制和研發(fā)治療PKD候選藥物。小鼠常染色體隱性遺傳?。╦uvenile cystic kidney，jck）是一常用PKD小鼠模型［7，8］。jck純合子小鼠3天齡時(shí)出現(xiàn)腎囊泡，4－5周齡時(shí)發(fā)展成明顯多囊腎病，發(fā)病小鼠可存活4個(gè)多月。

大量的動(dòng)物體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和來(lái)源于人ADPKD腎臟標(biāo)本的研究結(jié)果均表明：cAMP介導(dǎo)的信號(hào)通路是調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞表型變化（過(guò)度增殖）和囊液積聚的最主要信號(hào)通路。目前研究已發(fā)現(xiàn)Ras－BRaf－MEK－ERK信號(hào)通路在ADPKD的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用。在ADPKD上皮細(xì)胞中，高水平的細(xì) 胞 內(nèi) cAMP 通 過(guò) 促 進(jìn) Ras－B－Raf－MEK－ERK信號(hào)通路促進(jìn)囊泡上皮細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。在ADPKD上皮細(xì)胞中，囊泡上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2＋水平降低，PI3K－AKT途徑對(duì)B－Raf的抑制作用減弱，導(dǎo)致EGF等生長(zhǎng)因子主要通過(guò) Ras－B－Raf－MEK－ERK信號(hào)通路，上調(diào)周期蛋白 Egr－l，c－myc，c－fos等細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)水平，促進(jìn)囊泡上皮細(xì)胞的異常增殖［9］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明jck小鼠腎臟囊泡上皮細(xì)胞 MAPK通路中的 H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK和c－fos蛋白水平與野生型腎臟相比明顯上調(diào)，表明Raf、MEK、ERK在jck腎臟囊泡上皮細(xì)胞顯著磷酸化。這些結(jié)果證實(shí)jck腎囊泡上皮細(xì)胞MAPK信號(hào)通路激活，提示其在多囊腎病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，MAPK信號(hào)通路有可能成為治療多囊腎病的候選藥物篩選的藥物靶點(diǎn)。

［1］張樹(shù)忠，胡以平，梅長(zhǎng)林，等.Ⅱ型多囊腎致病基因PKD2突變的研究進(jìn)展［J］.中華腎臟病雜志，2006，7：440.

［2］高晉生，楊寶學(xué).常染色體顯性遺傳多囊腎病的治療研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25：141.

［3］闞秀芳，周 虹，楊寶學(xué).水通道蛋白在多囊腎病小鼠腎囊泡上皮細(xì)胞的表達(dá)與調(diào)控［J］.中華腎臟病雜志，2010，26：39.

［4］Gabow PA.Polycystic kidney disease：clues to pathogenesis［J］.Kidney Int，1991，40：989.

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［7］Atala A，F(xiàn)reeman MR，Mandell J，et al.Juvenile cystic kidneys（jck）：a new mouse mutation which causes polycystic kidneys［J］.Kidney Int 1993，43：1081.

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