郭洪亮，徐忠信

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京100020；2.北華大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130033）

在缺血性神經(jīng)疾病的研究中，由于體內(nèi)環(huán)境較為復(fù)雜，從體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)試驗(yàn)的研究愈來(lái)愈受到重視，因神經(jīng)元是不可再生細(xì)胞，神經(jīng)元的原代培養(yǎng)難度較大，最終可用于實(shí)驗(yàn)的數(shù)量、純度均受到一定限制。本實(shí)驗(yàn)采用PC12細(xì)胞是由大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤分離并建立起的細(xì)胞系，其在體外經(jīng)NGF刺激誘導(dǎo)后可向交感神經(jīng)元分化，最終導(dǎo)致PC12細(xì)胞在生理、生化方面都具有神經(jīng)元樣的功能，同時(shí)應(yīng)用體外氧糖剝 奪 （oxygen－glucose deprivation，OGD）來(lái)模擬體內(nèi)腦缺血過(guò)程，為今后進(jìn)一步探討缺血缺氧狀態(tài)下對(duì)神經(jīng)元的活力、凋亡、信號(hào)通路機(jī)制的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠PC12細(xì)胞株購(gòu)自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)）。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）（Sigma公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代 將細(xì)胞懸液加入含有DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)液2－3天更換一次。當(dāng)細(xì)胞匯集至80%時(shí)進(jìn)行傳代接種。

1.2.2 鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞 PC12細(xì)胞培養(yǎng)1－2天，觀察細(xì)胞貼壁后，用含NGF終濃度為50ng／ml的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞培養(yǎng)板每日置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞胞體與突起形態(tài)、貼壁與生長(zhǎng)情況。（2）免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定 PC－12細(xì)胞分別在NGF培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后，用NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行鑒定，顯微鏡下觀察，以在細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為陽(yáng)性，每張爬片隨機(jī)選取3個(gè)100×視野，計(jì)數(shù)，取均值，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，其中突起的長(zhǎng)度超過(guò)胞體直徑2倍者計(jì)為陽(yáng)性，每次至少計(jì)數(shù)3個(gè)孔取平均值。

1.3 PC－12細(xì)胞氧糖剝奪模型的建立與評(píng)價(jià)

1.3.1 PC－12細(xì)胞 OGD 模型的建立 PC12細(xì)胞培養(yǎng)48h后，在無(wú)菌操作臺(tái)吸凈培養(yǎng)基，用缺氧缺糖DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，并用該液體孵育細(xì)胞，將培養(yǎng)板快速放入已造成缺氧環(huán)境的缺氧罐中，夾閉進(jìn)氣口和出氣口；將缺氧罐放入37℃孵箱內(nèi)開(kāi)始計(jì)時(shí)；根據(jù)3h、6h、9h、12h、16h、24h將細(xì)胞隨機(jī)分為6組進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2 PC－12細(xì)胞氧糖剝奪模型評(píng)價(jià) （1）MTT法細(xì)胞存活率檢測(cè) 在OGD不同時(shí)間組及對(duì)照組每孔加入10μl MTT溶液后4h，每孔加入100μl二甲基亞砜，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值并計(jì)算細(xì)胞存活率。（2）AO／EB熒光雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞爬片后，將PC－12細(xì)胞依據(jù)不同的時(shí)間點(diǎn)行OGD處理后，取出細(xì)胞爬片，固定，滴加AO／EB混合液10－15μl，應(yīng)用熒光顯微鏡記錄攝片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)

初次復(fù)蘇的PC12細(xì)胞在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)，胞體圓形，直徑10－15μm，處于游離期的細(xì)胞貼壁能力較差，易聚集成團(tuán)，呈半懸浮狀態(tài)；在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24h后的細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)并分裂增殖，吸附期PC12細(xì)胞在培養(yǎng)基中多呈橢圓或多角形，傾向于聚集成團(tuán)簇狀；培養(yǎng)約72h后，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞快速生長(zhǎng)和分裂，細(xì)胞折光性強(qiáng)，數(shù)目明顯增多。見(jiàn)圖1。

圖1 處于不同生長(zhǎng)階段的PC12細(xì)胞

2.2 NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的培養(yǎng)

PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元樣細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯增加，細(xì)胞長(zhǎng)出的突觸增粗增長(zhǎng)，貼壁牢固；培養(yǎng)7d后基本無(wú)法消化傳代；培養(yǎng)10d后細(xì)胞進(jìn)入衰退期。

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)24h，可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)出較短、較細(xì)的突觸；培養(yǎng)48h，突觸數(shù)量及長(zhǎng)度增加；培養(yǎng)72 h，突觸長(zhǎng)度可達(dá)胞體的4－5倍，交織成網(wǎng)狀，呈典型的神經(jīng)元形態(tài)，占總數(shù)96%以上。見(jiàn)圖2。

圖2 NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元不同時(shí)間形態(tài)觀察

2.2.2 NSE免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 NSE免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：藍(lán)色激發(fā)光下可見(jiàn)散在分布、呈星形并帶有較長(zhǎng)突起的綠色熒光區(qū)域，與背景對(duì)比明顯，見(jiàn)圖3－A；紫色激發(fā)光下，可見(jiàn)復(fù)染的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，見(jiàn)圖3－B；圖像融合后證實(shí)綠色熒光區(qū)域?yàn)镻C12細(xì)胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元樣細(xì)胞，NSE免疫熒光染色呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖3－C。

圖3 NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元NSE免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色

2.3 PC－12細(xì)胞氧糖剝奪（OGD）模型的建立與評(píng)價(jià)

2.3.1 氧糖剝奪不同時(shí)間MTT法細(xì)胞存活率檢測(cè)OGD3h細(xì)胞存活率較對(duì)照組略有降低，但無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨OGD時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸下降，OGD12h后下降更為明顯，OGD24h細(xì)胞存活率降至9.08%，與對(duì)照組及OGD3h組比較差異顯著（P＜0.05）。各組細(xì)胞存活率見(jiàn)表1。

2.3.2 AO／EB熒光雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 正常對(duì)照組細(xì)胞AO／EB染色，細(xì)胞核呈綠色熒光，見(jiàn)極少量的橙紅色熒光，細(xì)胞核呈較規(guī)整橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，未見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞；OGD3h、OGD6h橙紅色熒光細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組略有所增加；隨著OGD時(shí)程的延長(zhǎng)，橙紅色熒光細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，可見(jiàn)少數(shù)核形態(tài)不規(guī)則的凋亡細(xì)胞；OGD16h橙紅色熒光的死亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，綠色熒光細(xì)胞數(shù)量稀少；OGD 24h細(xì)胞多數(shù)死亡，可見(jiàn)核碎裂、固縮呈橙紅色熒光。見(jiàn)圖4，表2。

表1 OGD不同時(shí)間PC12細(xì)胞存活率MTT檢測(cè)

圖4 OGD不同時(shí)間PC12細(xì)胞AO／EB熒光染色

表2 OGD不同時(shí)間AO／EB雙染細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

3 討論

本研究于體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞，應(yīng)用NGF刺激誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化，用于神經(jīng)元氧糖剝奪模型建立。結(jié)果顯示PC12細(xì)胞經(jīng)NGF刺激轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元樣細(xì)胞具有典型的神經(jīng)元形態(tài)，細(xì)胞不再增殖分裂，具有神經(jīng)元特性。經(jīng)特異性烯醇化酶（Neurospecific enolase，NSE）免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，見(jiàn)NSE陽(yáng)性神經(jīng)元胞漿及突觸呈綠色熒光，核呈藍(lán)色熒光證實(shí)為神經(jīng)元樣細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

為了研究機(jī)體內(nèi)的急性缺血性腦損傷機(jī)制，我們常通過(guò)建立體外神經(jīng)細(xì)胞的OGD模型，來(lái)模擬機(jī)體缺血性腦損傷過(guò)程［1－3］。在體外建立可模擬機(jī)體急性缺血性腦損傷的神經(jīng)元OGD模型，本研究在建立PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化神經(jīng)元OGD模型的基礎(chǔ)上，在 OGD3h、6h、9h、12h、16h、24h應(yīng)用 MTT法對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示隨OGD時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸由97.23%下降至9.08%（P＜0.05），提示模型建立成功，但 MTT法是以最終溶液OD值間接計(jì)算存活率，難以反應(yīng)細(xì)胞凋亡情況。因此，實(shí)驗(yàn)同時(shí)應(yīng)用細(xì)胞爬片法，應(yīng)用AO／EB雙染對(duì)細(xì)胞原位凋亡進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在OGD12h之前，雖細(xì)胞凋亡率逐漸升高，但變化并不明顯；OGD12h細(xì)胞凋亡率迅速升高至較高水平，兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用的氧糖剝奪方法可明顯造成神經(jīng)細(xì)胞損傷，成功模擬體內(nèi)腦缺血過(guò)程，為研究神經(jīng)細(xì)胞缺血損傷提供有效、簡(jiǎn)單、實(shí)用、可靠的方法和手段。

［1］Jones PA，May GR，McLuckie JA，et al.Apoptosis is not an invariable component of in vitro models of cortical cerebral ischaemia［J］.Cell Res，2004，14（3）：241.

［2］Kaushal V，Schlichter LC.Mechanisms of microglia－mediated neurotoxicity in a new model of the stroke penumbra［J］.J Neurosci，2008，28（9）：2221.

［3］Dugan LL，Kim－Han JS.Astrocyte mitochondria in in vitro models of ischemia［J］.J Bioenerg Biomembr，2004，36（4）：317.