徐洪彪，曹 宏，陳學博，趙紅蕾，孫月芳，田曉豐＊

（1.松原市乾安縣醫(yī)院 普外科，吉林 松原131400；2.吉林大學第二醫(yī)院 普外科中心；3.吉林大學 畜牧獸醫(yī)學院）

人 類 同 源 框 （zinc－fingers and homeoboxes，ZHX）蛋白家族，包括ZHX1、ZHX2和ZHX3，分子結構中均包括2個鋅指結構（zinc－finger motifs）和5個同源結構域（homeodomains，HDs）。3種蛋白自身可組成同源二聚體，2種蛋白相互之間也可形成異源二聚體。ZHX蛋白家族在組織中廣泛存在，作為轉錄抑制因子發(fā)揮重要的病理生理功能。ZHX2是ZHX蛋白家族成員之一，是2003年新克隆的轉錄抑制因子，位于染色體8q24.13，含有2個鋅指結構和5個同源結構域，其編碼的蛋白含837個氨基酸殘基，定位于細胞核內［1］。近年來的研究結果顯示，ZHX2參與正常肝細胞中肝癌標志物的轉錄抑制，提示ZHX2的表達缺失可能是肝細胞癌（HCC）發(fā)生的關鍵因素［2］。以往的研究大多采用免疫組織化學染色或RT－PCR半定量技術，這些方法在定量方面仍有缺陷。實時熒光定量PCR技術是用于mRNA擴增定量檢測的一項新技術，與RTRCR半定量分析、Northern印跡法等傳統(tǒng)mRNA定量方法相比，具有特異性高、穩(wěn)定性好和高通量等優(yōu)點。本研究通過實時定量檢測肝癌組織中ZHX2基因的表達情況，并同癌旁組織比較，分析其相對表達水平與肝癌臨床病理分級的關系，旨在為肝癌的臨床診斷、治療及預后提供依據。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

選擇2009年3月到2010年5月吉林大學第二附屬醫(yī)院首診的24例肝癌患者為研究對象，收集手術切除的肝癌新鮮癌組織標本，取6例膽管結石手術切除的正常肝組織為對照，標本均經病理驗證，所有研究對象均有知情同意權。標本于手術摘除后5分鐘內采集，生理鹽水沖洗后立即液氮保存。收集全部HCC患者的年齡、性別、腫瘤大小、病理分級（Edmondson標準）、血清AFP水平、門靜脈癌栓和肝病背景等臨床資料。

1.2 儀器和試劑

Trizol Reagent、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG試劑盒均購自美國Invitrogen公司；Omniscirpt RT反轉錄試劑盒購自德國Qiagen公司；ABI 7500熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3 引物及探針的設計

根據GenBank中ZHX2的基因序列（gi：63079684），利用Primer Premier 5.0軟件輔助分析設計引物，ZHX2產物大小為194bp，上游引物為5’－GCCAGTGACCGCAAGAAGA－3’；下游引物為5’－GATTCGCTGGTGATGTGG－3’。由寶生物工程（大連）有限公司合成。

為對ZHX2mRNA的測定含量進行標準化，使之具備可比性，需設置內參照。GAPDH在各類組織細胞內的轉錄水平較為恒定，故以GAPDH作為內參照。GAPDH產物大小為146bp，上游引物為5’－TCATGGGTGTGAACCATGAGAA－3；下游引物為5’－GGCATGGACTGTGGTCATGAG－3’。

1.4 總RNA的提取

采用Trizol法提取組織總RNA，所提取的RNA立即進行反轉錄操作，方法按照Omniscirpt RT反轉錄試劑盒說明書進行，得到的cDNA保存于－20℃。

1.5 實時定量PCR檢測

逆轉錄和PCR反應嚴格按照試劑盒操作說明進行。PCR反應條件：95℃預變性5min；95℃、10s，60℃、45s，70℃、15s共40個循環(huán)；循環(huán)結束后95℃、10s，65℃延伸1min。溫度每上升1℃取5次熒光值制作熔解曲線，確定擴增產物的特異性。在相同反應條件下進行ZHX2及GAPDH mRNA檢測，如果熔解曲線顯示無基因擴增特異性信號，則認為其不表達該基因。每個反應設4個復孔，結果為3次實驗的平均值。

1.6 結果判斷及統(tǒng)計學處理

RT－PCR擴增曲線陽性標本呈現(xiàn)典型的S型曲線，而陰性對照是一條不規(guī)則的波浪線。熒光定量檢測結果用SDS軟件進行分析，并用RQ＝2－ΔΔCt公式計算相對表達，Ct為循環(huán)閥值，ΔCt＝樣品Ct均值－內參照Ct均值，ΔΔCt＝ΔCt－（隨機陰性對照樣品Ct均值－該樣品內參照Ct均值），以2－ΔΔCt表示樣品中目的基因初始cDNA相對表達量。結果用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結果

2.1 肝組織總RNA提取結果

標本經Trizol法提取總RNA后，分別測定A260／A280，總體比值范圍在1.73±0.24，說明總RNA質量較好。經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見清晰的28s和18s主帶，說明總RNA無降解，無DNA污染，如圖1所示。

圖1 組織標本總RNA提取結果

2.2 FQ－PCR結果

ZHX2mRNA的RT－PCR擴增曲線呈現(xiàn)典型的S型曲線（圖2A），熔解曲線分析可見只有單峰值，排除了非特異性擴增（圖2B）。內參GAPDH mRNA的RT－PCR擴增曲線也呈現(xiàn)典型的S型曲線（圖2A），熔解曲線分析可見只有單峰值，排除了非特異性擴增（圖2B）。表明所建立的ZHX2mRNA的熒光定量方法特異性較好。

2.3 HCC組織及癌旁肝組織中ZHX2基因mRNA的表達

圖2 ZHX2及GAPHD FQ－PCR結果

圖3 組織樣品ZHX2及GAPHD FQ－PCR結果

HCC組織及癌旁肝組織中ZHX2基因mRNA的表達檢測結果如圖3所示，在6例正常肝組織中均有表達；在HCC癌組織中ZHX2mRNA的陽性率為33.3%（8／24），癌旁非瘤組織中ZHX2mRNA的陽性率為62.5%（15／24）；ZHX2mRNA 在 HCC及癌旁組織中的陽性表達率無差異（χ2＝0.2432，P＞0.05）；但ZHX2mRNA在 HCC組織中的表達明顯低于對應的癌旁肝組織，差異具有顯著性（P＜0.05，表1）。

表1 HCC及癌旁組織中ZHX2基因mRNA表達的分析

2.4 ZHX2的表達與HCC臨床病理特征的關系

將HCC按不同的臨床病理特征分組比較ZHX2mRNA的表達，結果顯示，ZHX2mRNA的表達與HCC患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤大小、有無靜脈浸潤以及肝硬化程度無關，而與有無肝外轉移灶、HBV感染和血清AFP值有關（表2）。

在所取的24例肝癌中，有2例門靜脈主干癌栓和2例肝門部淋巴結轉移灶。對這4例HCC轉移灶的檢測顯示，其ZHX2基因mRNA的表達水平較HCC肝內病灶高，差異有顯著性（P＜0.01）。

對收集的24例HCC標本按HBV感染情況進行分類，檢測兩組中ZHX2的mRNA水平，檢測結果經軟件分析，以GAPDH為內對照，統(tǒng)計分析結果顯示，HBV陽性組中ZHX2的整體表達水平低于 HBV陰性組（P＜0.01）。

表2 ZHX2mRNA的表達與HCC臨床病理特征的關系

ZHX2mRNA與AFP血清水平呈負相關關系，ZHX2mRNA在血清AFP＜400ng／ml的HCC組織中的表達水平明顯高于血清AFP≥400ng／ml的 HCC組織（P＜0.01）。

3 討論

ZHX2mRNA長度約4.4kb，在肝、腦、肺等組織中均廣譜表達，但其在卵巢、前列腺、骨骼肌、脾、胰組織中表達水平相對更高［3］。近期研究顯示ZHX2可能參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，ZHX2不僅抑制肝癌細胞AFP的表達，而且在腎病綜合征中參與腎小球內足細胞的調控［4］，另有研究顯示ZHX2表達與多發(fā)性骨髓瘤惡性程度及患者預后呈負相關［5］。上述研究提示ZHX2可能成為一個重要的抑癌基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，ZHX2基因的mRNA在正常肝組織中均有表達，ZHX2mRNA在HCC及癌旁組織中的陽性表達率無差異，但ZHX2mRNA在HCC組織中的表達明顯低于對應的癌旁肝組織；ZHX2 mRNA的表達與HCC患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤大小、有無靜脈浸潤以及肝硬化程度無關，而與有無肝外轉移灶、HBV感染和血清AFP值有關。ZHX2基因mRNA在肝外轉移灶和門靜脈主干癌栓中表達升高。本研究檢測了ZHX2mRNA的表達，結果表明ZHX2基因mRNA的表達在HCC中高于癌旁肝組織，其在低分化HCC中的表達高于高分化HCC，這提示ZHX2基因可能不僅與肝癌的發(fā)生有關，而且與肝癌的惡性程度也有關。本研究結果提示，ZHX2基因參與了HCC的發(fā)生和發(fā)展，同時ZHX2基因的過量表達與HCC的侵襲和轉移密切相關，ZHX2基因有可能成為反映HCC侵襲轉移能力的新指標。

應用定量PCR技術檢測目的基因mRNA定量表達，其前提是樣本間細胞起始數、RNA提取效率、反轉錄效率和目的基因擴增效率均需相同，然而以上條件不可能同時滿足，必須用管家基因對樣本進行標準化，管家基因在細胞或基因組中的拷貝數被視為恒定，可用于代表樣本中所含細胞或基因組的數量［6］。本研究首次利用定量PCR檢測ZHX2基因mRNA在HCC中的表達水平，發(fā)現(xiàn)盡管ZHX2在HCC及癌旁組織中均有較高的表達頻率，但HCC中ZHX2mRNA水平明顯低于對應的癌旁組織。

ZHX2廣泛表達于哺乳動物不同組織，其表達調控機制迄今尚不清楚。2006年，lv等［7］在研究HCC甲基化過程中發(fā)現(xiàn)了在多數HCC組織標本中存在的一個廣泛的甲基化區(qū)域，同源性分析證實該區(qū)域是ZHX2啟動子區(qū)；進一步實驗證實HepG2細胞中去甲基化可以恢復ZHX2表達，提示甲基化是ZHX2表達調控的機制之一。本課題組對ZHX2與HCC發(fā)病機制研究中，同時采用變性高效液相色譜法對HCC中ZHX2啟動子區(qū)域甲基化水平與ZHX2mRNA表達水平及與HCC發(fā)生發(fā)展相互關系進行了研究（另文發(fā)表），結果發(fā)現(xiàn)在正常肝組織未檢測到ZHX2基因啟動子區(qū)域甲基化，而24例HCC癌組織中有11例（45.8%）存在甲基化，提示該甲基化是腫瘤相關性的。另外，有16.6%癌旁肝組織也能檢測到甲基化，但明顯低于癌組織，有可能是由于癌旁肝組織存在不同程度的肝硬化或慢性炎癥，而并非完全正常肝組織，但也說明該甲基化有可能在HCC發(fā)生的早期或者其癌前病變時就已經出現(xiàn)。

［1］Kawata H，Yamada K，Shou Z，et al.fingers and homeoboxes（ZHX）2，a novel member of the ZHX family，functions as a transcriptional repressor［J］.Biochem J，2003，373（Pt 3）：747.

［2］Yamada K，Ogata－Kawata H，Matsuura K，et al.ZHX2and ZHX3repress cancer markers in normal hepatocytes［J］.Front Biosci，2009，14（1）：3724.

［3］Wienk H，Lammers I，Hotzo A，et al.The tandem zinc－finger region of human ZHX adopts a novel C2H2zinc finger structure with a C－terminal extension［J］.Biochemistry，2009，48（21）：4431.

［4］Liu C，Clement L C，Kanwar Y S，et al.ZHX proteins regulate podocyte gene expression during the development of nephritic syndrome［J］.Biol Chem，2007，281（51）：39681.

［5］Armelliui A，Sarasquete M E，Curca－Suuz R，et al.Low expression of ZHX2，but not RCBTB2or RAN，is associated with poor outcome in multiple myeloma［J］.Br J Haematol，2008，141（2）：212.

［6］Huggett J，Dheda K，Bustin S，et al.Real time RT－PCR normalization：strategies and considerations［J］.Gene and Immunity，2005，6（4）：279.

［7］Lv Z，Zhang M，Bi J，et al.Promoter hypermethylation of a novel gene，ZHX2，in hepatocellular carcinoma［J］.Am J Clin Pathol，2006，125（5）：740.