張莎娜，陸 穎，王海平，王全立※

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院輸血科，北京100853;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院輸血科，北京100071)

異嗜性小鼠白血病病毒相關(guān)病毒(xenotropic MULV-related virus，XMRV)是一種新發(fā)現(xiàn)的能夠感染人類的反轉(zhuǎn)錄病毒，該病毒最早在先天免疫功能缺陷的家族性前列腺癌患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。XMRV是第一個能夠感染人類的γ反轉(zhuǎn)錄病毒，越來越多的研究提示，其可能與前列腺癌和慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)密切相關(guān)［1-5］。XMRV 具有直徑約100 nm的多邊形的核殼［6-8］，其基因組全長8185 bp，含有2個不含內(nèi)含子的且相互重疊的開放閱讀框，分別編碼 gag-pro-pol和被膜蛋白(env)。XMRV基因組與小鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MULV)非常相似，兩者核酸序列的一致性高達95%［9］，當用XMRV感染已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了以MULV為構(gòu)建基礎(chǔ)的人前列腺癌細胞時，XMRV能夠修復(fù)復(fù)制缺陷型MULV載體，使其獲得復(fù)制能力而感染正常細胞，揭示XMRV很可能是MULV的一個變種［9］。XMRV是感染人類的、與MULV高度相似的γ反轉(zhuǎn)錄病毒，提示XMRV感染可能與人白血病的發(fā)病有關(guān)。人們對已知病毒的充分認識以及對未知病毒特性的深入研究，將對降低輸血相關(guān)病毒感染的風(fēng)險，提高輸血質(zhì)量與安全具有極其重要的理論和現(xiàn)實意義。因此，本研究主要選取有輸血史的白血病患者為主要研究對象。

1 材料與方法

1.1 標本與試劑 2010年3～7月收集的血液標本297例，其中健康獻血者(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、HBsAg、抗HCV、抗梅毒螺旋體抗體、抗HIV等各項血液化驗均合格)的血樣243例;本院收治的腫瘤患者血樣36例，其中白血病患者25例(以急性白血病為主)，其他腫瘤患者11例總 RNA提取試劑盒(DP419)、Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒(KR103)、DNA分子質(zhì)量標準品DL2000和MarkerⅣ均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 RNA提取 使用總RNA提取試劑盒提取獻血者和腫瘤患者的血液總RNA(包括血液中白細胞內(nèi)的總RNA和血漿或血清中的總RNA)，－70℃凍存，1周內(nèi)進行下一步實驗。用分光光度計(DU 800 Nucleic Acid/Protein Analyzer Beckman Coulter)對RNA樣本進行定量測定:總RNA濃度由A260吸光值計算，平均濃度為 478.24 ng/μL(238.44～573.36 ng/μL)，總RNA純度由A260/A280值來判斷，A260/A280=1.4257(1.3542～1.6934)。總 RNA 完整性通過 1.5% 甲醇變性瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色、紫外凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc 2000，BIO-RAD)采集圖像并判斷。

1.3 反轉(zhuǎn)錄 使用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，－20℃凍存，作為下一步巢式聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的模板。

1.4 巢式PCR 引物序列和XMRV的陽性標準品(NIH3T3細胞的cDNA)均由美國FDA的唐時幸教授所提供，引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴增反應(yīng)條件:均采用25 μL反應(yīng)體系，擴增條件為94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán);最后72℃延伸5 min。巢式PCR采用外引物進行一次PCR擴增后，取PCR產(chǎn)物2 μL，作為第二輪PCR的模板，然后用內(nèi)引物進行第二輪擴增，條件同第一輪。引物序列及反應(yīng)條件見表1。

2 結(jié)果

2.1 標本結(jié)果 共提取標本279例，應(yīng)用巢式RTPCR擴增gag基因片段(413 bp)，并進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，在所檢測的血液樣本中，XMRV均呈陰性(表2和圖1，圖2A、2B)。

2.2 內(nèi)參結(jié)果 各標本對應(yīng)的內(nèi)參引物三磷酸甘油醛脫氫酶基因(hGAPDH))均呈陽性，證明了實驗的可靠性。

表2 XMRV檢測樣本量及結(jié)果

圖2A 健康獻血者的XMRV及hGAPDH巢式RT-PCR結(jié)果

圖2B 腫瘤患者的XMRV及hGAPDH巢式RT-PCR結(jié)果

3 討論

自2006年首次報道XMRV在人群中的感染以來，XMRV的流行特征和致病性引起了各國學(xué)者越來越多的關(guān)注。在一些研究中，XMRV被認為與前列腺癌和CFS兩種重要的人類疾病相關(guān);然而，相反的證據(jù)同樣存在。本研究中，并沒有檢測到XMRV的RNA，分析出現(xiàn)這種情況的可能原因如下:①在中國，可能XMRV的感染率極低，而本研究的樣本量相對小，所以沒有檢測到XMRV的感染。②可能與XMRV的地域性分布差異有關(guān)。③可能XMRV的感染滴度和復(fù)制水平極低，而該項研究應(yīng)用的方法還不夠靈敏。該項實驗中，雖然能夠擴增出內(nèi)參GAPDH的基因，但豐度相對低，說明RNA提取或擴增效率等環(huán)節(jié)仍有待改進。未來將采取擴增前病毒(pro-virus)DNA并結(jié)合定量PCR的方法進行大樣本的研究。現(xiàn)有的研究結(jié)果提示，XMRV感染具有癥狀不明顯、傳染源不易被發(fā)現(xiàn)的特征。因此，對其進行快速、準確的檢測，在XMRV的診治、預(yù)防、流行病學(xué)調(diào)查和疾病早期診斷等方面具有重要的意義。進一步深入開展的XMRV流行病學(xué)研究，還需要擴大樣本量，并針對不同疾病人群，同時采用高靈敏度的檢測方法，以確定XMRV在我國的流行規(guī)律和與人類疾病的相關(guān)性。

目前各國的研究結(jié)果仍存有爭議，分析可能有以下幾方面的原因:①XMRV檢測缺乏公認的標準化、高靈敏度的檢測方法，在各項實驗研究中也沒有一種公認的陽性對照。②檢測樣品中可能存在實驗室污染現(xiàn)象，比如樣本中混入含有XMRV或MULV的污染物，從而造成假陽性結(jié)果。③地域差異可能影響XMRV的分布也是其中的一個原因，不過地域差異并不能解釋所有結(jié)果，因為幾個同在美國的研究就得出了相反的結(jié)論［4-5，10］。第④XMRV基因可能存在變異性，導(dǎo)致一些方法，尤其是PCR檢測結(jié)果為陰性。⑤各研究的臨床篩選標準存在差異，比如CFSCFS的診斷標準不一，可能造成各研究的樣本選擇本身存在差異。

雖然因在外周血單個核細胞中可以檢測到XMRV RNA，推測XMRV可能通過輸血傳播，但目前仍沒有明確的研究能證明這一點，未來還需要進行大量的回顧性和前瞻性研究來進一步證實。盡管如此，為了防止該病毒的可能傳播，有關(guān)國家已經(jīng)采取了嚴格措施，加強對獻血人員的篩查。2010年4月以來，歐美許多國家無限期推遲或禁止已診斷為慢性疲勞綜合征的個人獻血，避免因CFS患者獻血造成XMRV的傳播。XMRV可能參與人類前列腺癌的發(fā)生，并與CFS的發(fā)病有關(guān)。不過目前的研究結(jié)果還存在較大爭議，同樣需要進一步的深入研究。

XMRV的分布可能具有地域差異。XMRV最先在歐美發(fā)現(xiàn)，在中國健康人群和不同疾病人群的感染和流行狀況還不甚清楚。從該病毒本身的重要性和研究的趨勢看，估計在未來幾年內(nèi)能得出明確的結(jié)論。因此，研究XMRV的感染情況以及其與包括前列腺癌和CFS在內(nèi)的人類疾病之間的關(guān)系，將是今后的主要研究方向。

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