李少妮，崔繼紅，李菲菲，陳富林，李 錚，馮 雪

(陜西西安:1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，710032;2.西北大學(xué)生命科學(xué)院，710069)

近年來，對于正畸骨改建越來越重視，機(jī)械力學(xué)刺激不僅對骨骼系統(tǒng)的生長發(fā)育、正常骨量的維持、骨折修復(fù)和塑型都具有極為重要的作用［1－2］，同時也可作為一種胞外信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)信號的級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、分泌等生物學(xué)效應(yīng)［3－4］。針對機(jī)械刺激成骨細(xì)胞的研究多在基因?qū)用妫?］，對細(xì)胞表面糖譜的研究卻很少涉及。解析細(xì)胞表面糖譜，將有助于解析糖基化修飾下隱藏的重要生命現(xiàn)象［6］。本研究以Flexcell細(xì)胞應(yīng)力培養(yǎng)系統(tǒng)對人成骨肉瘤MG－63細(xì)胞施以不同加載時間的周期性張應(yīng)變，利用凝集素芯片技術(shù)對不同加載時長成骨樣細(xì)胞的糖蛋白糖譜的影響進(jìn)行研究，篩選出糖蛋白糖譜中差異表達(dá)糖蛋白糖鏈，從而分析糖蛋白糖鏈在不同加載時長情況下與骨改建中細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

人成骨肉瘤 MG－63細(xì)胞(ATCC，MI，美國);MEM(北京賽默飛世爾公司);胎牛血清(北京民海生物公司);6孔彈性基底膜培養(yǎng)板(Flexcell，美國);BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德公司);Cy3熒光染料(Amerhsma公司，美國);76 mm×25 mm×1 mm玻璃片基(Gold Seal公司);37種凝集素(表1);FX－4000T細(xì)胞加載裝置(Flexcell公司，美國);晶芯 SmartArrayer48點(diǎn)樣儀(北京博奧生物公司);雜交箱HL－2000(UVP公司，美國);生物芯片掃描儀4000B(Axon，美國)。

表1 凝集素及其特異結(jié)合糖鏈

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和加力

取MG－63細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基(含有100 mL/L FBS、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素)，在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長后，以2×105/孔接種于Ⅰ型膠原包被的BioFlex彈性基底膜6孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞生長融合達(dá)到80%時，更換含20 mL/L FBS的MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。然后，將細(xì)胞隨機(jī)分為4個實(shí)驗(yàn)組和1個對照組，4個實(shí)驗(yàn)組采用FX －4000T細(xì)胞加載系統(tǒng)分別加載 4、8、12、24 h。加載條件:形變率為12%，波形為正弦波，頻率為0.1 Hz。對照組不加載，在相同條件下靜態(tài)培養(yǎng)。

1.3 提取總蛋白

取對照組和各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)板，分別于每孔加入100 μL裂解液;充分吹打，冰上裂解細(xì)胞30 min;將溶液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中12000 r/min 4℃離心20 min，吸取上清分裝做下游分析;用BCA法定量后分裝保存于－20℃。

1.4 凝集素芯片檢測糖鏈差異

1.4.1 凝集素芯片的制備

將37種凝集素分別溶于點(diǎn)樣緩沖液中，BSA做陰性質(zhì)控，Cy3標(biāo)記BSA做位置標(biāo)記，每種凝集素重復(fù)3次，用晶芯48點(diǎn)樣系統(tǒng)以10×12的矩陣點(diǎn)制于環(huán)氧化修飾的玻片上。再在60%濕度中孵育3 h，37℃抽真空干燥3 h，備用。

1.4.2 凝集素芯片的熒光標(biāo)記

各取100 μL對照組和各實(shí)驗(yàn)組總蛋白分別與100 μL Na2CO3混勻，將混合液與Cy3熒光染料孵育標(biāo)記，Sephadex G－25柱分離純化Cy3標(biāo)記蛋白。收取標(biāo)記后蛋白，測定偶聯(lián)熒光蛋白濃度。

1.4.3 凝集素芯片孵育

吸取Cy3標(biāo)記后的對照組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白各 20 μL 與 180 μL 含 0.05%Tween－20 和10 g/L BSA的PBS混勻，吸取50 μL混勻液覆蓋點(diǎn)樣區(qū)，加蓋玻片孵育3 h，之后分別用含0.05%Tween－20的10 mmol/L的PBST和10 mmol/L PBS各清洗2次，每次2 min，最后離心甩干芯片。

1.4.4 數(shù)據(jù)掃描和分析

用GenPix 4000B芯片掃描儀掃描芯片，光電倍增管PMT設(shè)為100%，先進(jìn)行預(yù)掃描，調(diào)節(jié)明亮度和對比度，使達(dá)到最佳視覺效果，然后選定點(diǎn)樣區(qū)域，進(jìn)行精確掃描。用GenePix 3.0軟件從掃描結(jié)果圖中獲取熒光信號強(qiáng)度值和背景值等信息進(jìn)行分析。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個點(diǎn)的熒光信號讀數(shù)減去背景熒光讀數(shù)之后所得的值納入后續(xù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用中位值矯正的方法，對不同芯片的熒光讀數(shù)進(jìn)行熒光偏差矯正。矯正后的值每3個重復(fù)點(diǎn)計(jì)算均值和離均差，再經(jīng)SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 凝集素芯片

從芯片掃描圖中，獲得對照組和各實(shí)驗(yàn)組的熒光信號，凝集素芯片上每個點(diǎn)9個重復(fù)。在對照組細(xì)胞中EEL與其糖蛋白有最大結(jié)合，而在8 h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中ACA與其糖蛋白有最大結(jié)合(圖1)。

圖1 細(xì)胞對照組和加力實(shí)驗(yàn)組總蛋白凝集素芯片掃描結(jié)果

2.2 糖譜差異分析

對照組和實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理后，得出均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，發(fā)現(xiàn)8 h實(shí)驗(yàn)組差異表達(dá)的凝集素最多，其中GSL－Ⅰ對應(yīng) Ratio值最大，達(dá)36，說明其對應(yīng)糖鏈表達(dá)升高最顯著。GSL－Ⅰ特異性識別的糖鏈為 αGalNAc，GalNAcα－Ser/Thr(Tn)and αGal，說明在成骨細(xì)胞受機(jī)械加載8 h后該結(jié)構(gòu)大量增加。以Ratio值＜0.5視為表達(dá)降低，則8 h加載后STL對應(yīng)Ratio值最小，說明其對應(yīng)糖鏈表達(dá)降低最顯著。STL特異性識別糖鏈結(jié)構(gòu)為GlcNAc，說明在8 h機(jī)械加載后該結(jié)構(gòu)大量減少(表2，圖2)。

表2 不同加載時長凝集素差異表達(dá)對應(yīng)糖鏈Ratio值

圖2 實(shí)驗(yàn)組與對照組差異表達(dá)凝集素?zé)晒庵当容^

3 討論

蛋白質(zhì)的糖基化修飾是最普遍、最重要的蛋白翻譯后修飾之一。糖蛋白糖鏈部分影響著蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定、運(yùn)輸和定位，并可通過糖－蛋白質(zhì)之間的特異性識別參與各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞調(diào)控、細(xì)胞識別、粘連與運(yùn)動、信號傳導(dǎo)、免疫與應(yīng)答等。在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中，糖蛋白的糖基化程度或糖鏈結(jié)構(gòu)都發(fā)生了改變，導(dǎo)致糖蛋白及其所在細(xì)胞的功能障礙［7－8］。成骨細(xì)胞是骨形成和骨重建中重要的功能細(xì)胞，成骨細(xì)胞的增殖、分化受多種因子的調(diào)節(jié)［9］。

本研究利用凝集素芯片研究了不同加載時長機(jī)械應(yīng)力對成骨細(xì)胞的糖蛋白糖譜及其表達(dá)差異，分析出一系列骨改建相關(guān)糖蛋白糖鏈。在加力后實(shí)驗(yàn)組凝集素Jacalin、GSL－I、DBA的親和作用增強(qiáng)，提示在機(jī)械牽張力作用下成骨樣細(xì)胞表面可能出現(xiàn)增多的N－乙酰半乳糖胺(包括α1－3鏈接方式)，這一分支結(jié)構(gòu)的增加是由于生成這一結(jié)構(gòu)的糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量或是活性增加所致。Hazuki E等通過比較野生型及Galnt1基因敲除小鼠中糖蛋白的表達(dá)，鑒定了N－乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶(pp-GalNAcT－1)是骨糖蛋白中骨橋蛋白(OPN)O糖基化(寡糖鏈連接在Thr和Ser殘基上)必不可少的特異結(jié)合位點(diǎn)［10］。有文獻(xiàn)表明機(jī)械牽張作用可顯著影響成骨細(xì)胞骨橋蛋白(OPN)mRNA的表達(dá)水平［11］。推測在機(jī)械牽張應(yīng)力刺激下成骨細(xì)胞的ppGalNAcT－1表達(dá)增加，之后導(dǎo)致骨橋蛋白(OPN)的受體在細(xì)胞表面駐留，持續(xù)傳遞細(xì)胞生長信號。OPN由成骨細(xì)胞分泌，具有促進(jìn)細(xì)胞的粘附和伸展的作用［12］，是一種能夠誘導(dǎo)成熟成骨細(xì)胞表型表達(dá)并與礦化骨基質(zhì)密切相關(guān)的活性蛋白［13］。在加力后實(shí)驗(yàn)組凝集素LCA、STL的親和作用減弱，提示在機(jī)械牽張力作用后成骨樣細(xì)胞表面可能出現(xiàn)減少的N－乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)。有文獻(xiàn)報(bào)道，Glc-NAc修飾的狀態(tài)和水平能表現(xiàn)出反映細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)節(jié)點(diǎn)，如果GlcNAc修飾全面上升或下降，將會極大影響細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)能力。GlcNAc的修飾能被看成是細(xì)胞內(nèi)的一種信號，在很大程度上決定細(xì)胞如何去削減外界對自身的刺激［14］。

比對不同加載時長，發(fā)現(xiàn) DBA［GalNAcα－Ser/Thr(Tn)and GalNAcα1－3Gal］呈時間依賴性表達(dá)增高。Talaei－Khozani T 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，DBA在軟骨、鈣離子沉淀物及蛋白聚糖產(chǎn)物中都表達(dá)升高，推測DBA能有效誘導(dǎo)骨化及軟骨形成。

凝集素芯片是一種糖捕獲芯片，可用于迅速獲悉糖蛋白不同的糖基化特征，可以快速、高通量地獲得糖蛋白聚糖結(jié)構(gòu)信息［16］。本研究通過凝集素芯片技術(shù)找出一系列骨改建相關(guān)糖蛋白糖鏈。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面糖譜隨加載時長不同而表達(dá)不同，提示糖蛋白糖鏈與許多重要生命事件如細(xì)胞分化、細(xì)胞粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等緊密相關(guān)。但由于凝集素與聚糖鏈結(jié)合具有重疊性，加之目前凝集素所能親和識別的糖鏈信息仍有限［17］，凝集素芯片技術(shù)還需與其他技術(shù)聯(lián)合使用。

［1］Zhang P，Malacinski GM，Yokota H.Joint loading modality:its application to bone formation and fracture healing［J］.Br J Sports Med，2008，42(7):556－560.

［2］Colletti LA，Edwards J，Gordon L，et al.The effects of musclebuilding exercise on bone mineral density of the radius，spine，and hip in young men ［J］.Calcif Tissue Int，1989，45(1):12－14.

［3］Duncan RL，Turner CH.Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain ［J］.Calcif Tissue Int，1995，57(5):344－358.

［4］Jones DB，Nolte H，Scholubbers JG.Biochemical signal transduction of mechanical strain in osteoblast－like cells［J］.Biomater，1991，12(2):101 －110.

［5］Rath B，Nam J，Knobloch TJ.Compressive forces induce osteogenic gene expression in calvarial osteoblasts［J］.J Biomech，2008，41(5):1095－1103.

［6］Pilobello KT，Mahal LK.Deciphering the glycocode:the complexity and a nalytical challenge of glycomics［J］.Curr Opin Chem Biol，2007，11(3):300 －305.

［7］Gabius HJ，Andre S，Kaltner H，et al.The sugar code:functional lectinomics［J］.Biochim Biophy Acta，2002，157(2 － 3)2:165－177.

［8］Varki A，Cllmnlings RD，Esko JD，et al.Essentials of glycobiology［M］.Beijing:Science，2003:416 －417.

［9］Chau JF，Leong WF，Li B.Signaling pathways governing osteoblast proliferation differentiation and function［J］.Histol His-topathol，2009，24(12):1593 －1606.

［10］Miwa HE，Gerken TA，Jamison O，et al.Isoform－specific O－glycosylation of osteopontin and bone sialoprotein by polypeptide N－aceylgalactosaminyltransferase－1［J］.J Biol Chem，2010，285(2):1208 －1219.

［11］劉大為，傅民魁，李盛琳，等.機(jī)械牽張作用對UMR－106細(xì)胞骨橋蛋白mRNA和TGF－β1 mRNA表達(dá)的影響［J］.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2000，35(1):27－30.

［12］王立平，黨耕町.骨橋蛋白在骨愈合過程中的基因表達(dá)［J］.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，30(4):355－357.

［13］Bulter WT.The nature and significance of osteopontin［J］.Connec Tissue Res，1989，23(2 －3):123 －126.

［14］Wells L，Vosseller K，Hart GW.Glycosylation of nucleocytoplasmic proteins:signal transduction and O－GlcNAc［J］.Science，2001，291(5512):2376 －2378.

［15］Ingram RT，Clarke BL，F(xiàn)isher LW，et al.Distribution of noncollagenous proteins in the matrix of adult human bone:evidence of anatomic and functional heterogeneity［J］.Bone Miner Res，1993，8(9):1019－1029.

［16］Angeloni S，Ridet JL，Kusy N，et al.Glycoprofiling with micro－arrays of glycoconjugates and lectins［J］.Glycobiology，2005，15(1):31－41.

［17］Gupta G，Surolia A，Sampathkumar SG.Lectin microarrays for glycomic analysis［J］.OMICS，2010，14(4):419 －436.