徐 偉，王麗婷

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150076)

秸稈基質中木質素白腐菌降解的SEM特征觀察

徐 偉，王麗婷

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150076)

研究了黃孢原毛平革菌(Phanerochaete Chrysosporium Burdsall)對大豆和稻草秸稈中木質素的降解條件及降解效果。結果顯示:在各5.0g秸稈中，加入合成培養(yǎng)液12mL、菌懸液濃度8.6×106cfu/mL時，種子添加量為0.8mL、培養(yǎng)基pH4.5，降解10d，測得木質素降解率分別為大豆秸稈49.91%、稻草秸稈49.50%。利用SEM對發(fā)酵前后秸稈表觀結構進行觀察，得到黃孢原毛平革菌對大豆和稻草秸稈有明顯的降解效果。經黃孢原毛平革菌降解10d的大豆和稻草秸稈表面空穴增多、增大，甚至相互連通，降解效果明顯。

大豆秸稈，稻草，黃孢原毛平革菌，木質素，掃描電鏡(SEM)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)，菌種編號:40719;大豆秸稈 內蒙古莫旗;稻草 黑龍江省五常農村;PDA培養(yǎng)基 去皮馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L，pH自然;種子培養(yǎng)基［6］葡萄糖20g/L，玉米漿50mL/L，(NH4)2SO40.1g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，VB10.5mg/L;發(fā)酵培養(yǎng)基 稱取5.0g大豆秸稈粉(稻草粉)于250mL三角瓶中，加入合成培養(yǎng)液，高壓蒸氣 121℃滅菌20～30min，取出后備用;合成培養(yǎng)液［7－8］(NH4)2SO415g/L、KH2PO44.0g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl20.2g/L、VB110mg/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L、CoCl2·6H2O 0.1g/L、ZnSO4·7H2O 0.1g/L、CuSO4·5H2O 0.02g/L、AlK(SO4)2·12H2O 0.02g/L、Na2B4O7·10H2O 0.05g/L、(NH4)2MoO4·4H2O 0.02g/L、吐溫－80 3mL/L。

LZDX－50KB高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;DHG－9123電熱恒溫鼓風干燥箱、DHP9162恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;HZQ－C空氣浴振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子開發(fā)技術有限公司;S－3400N掃描電子顯微鏡 HITACHI。

1.2 木質素含量測定方法

采用王萬玉系統(tǒng)分析法［10］:

2 結果與分析

研究黃孢原毛平革菌對木質素降解率的影響因素包括:合成培養(yǎng)液添加量、接種量和pH，均在溫度為35℃，濕度為86%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d。

2.1 合成培養(yǎng)液添加量對降解率的影響

在培養(yǎng)基初始pH 4.5條件下，將種子液以每瓶0.8mL的接種量分別接到合成培養(yǎng)液添加量為6、8、10、12、14、16mL滅好菌的發(fā)酵的培養(yǎng)基中，測定10d后秸稈中木質素的降解率，結果如圖1所示。

圖1 合成培養(yǎng)液添加量對大豆和稻草秸稈木質素降解率的影響Fig.1 The effect of the amount of synthesis adding liquor on the degradation rate of soybean straw lignin and rice straw lignin

固體發(fā)酵培養(yǎng)時，合成培養(yǎng)液添加量過高，三角瓶內的濕度高、溶氧量低不易于菌體生長，菌體產酶量低，導致木質纖維素降解率低。合成培養(yǎng)液添加量過低，同樣會影響菌體生長，導致木質纖維素降解率低。在合成培養(yǎng)液添加量為12mL時，大豆秸稈和稻草秸稈木質素降解率最高，分別為 49.91%和49.24%。

2.2 接種量對降解率的影響

將種子液(孢子懸液濃度8.6×106cfu/mL)、分別以0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.7mL的接種量接種到已加入12mL合成培養(yǎng)液、初始pH4.5發(fā)酵培養(yǎng)基中，測定10d后秸稈中木質素降解率，結果如圖2所示。

在實驗室進行固體發(fā)酵時營養(yǎng)條件是一定的，接種量低，菌體之間生存競爭少，菌體生長良好利于菌體產酶，但發(fā)酵周期長。接種量高，菌體之間生存競爭激烈，雖發(fā)酵周期短，但不利于菌體產酶，降解率低。不同菌種對環(huán)境條件以及營養(yǎng)條件的不同需求，導致會有不同的適宜接種量。對于不同的菌種，接種量的選取是十分重要的。由圖2可知接種量達到0.8mL時，大豆和稻草秸稈木質素降解率為49.35%和46.21%。

圖2 接種量對大豆和稻草秸稈木質素降解率的影響Fig.2 The effect of inoculation on the degradation rate of soybean straw lignin and rice straw lignin

2.3 培養(yǎng)基初始pH對降解率的影響

將種子液以每瓶0.8mL的接種量接種到已加入12mL合成培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中，調節(jié)pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，測定10d后秸稈中木質素降解率，結果如圖3所示。

圖3 pH對大豆和稻草秸稈木質素降解率的影響Fig.3 The degradation law’s effect of soybean straw lignin and rice straw lignin by pH

培養(yǎng)基初始pH直接影響菌株生長和代謝活動，一般要求初始pH應使菌株快速生長而且有利于目標物質的代謝合成。黃孢原毛平革菌最適生長pH通常為弱酸性。由圖3可以看出pH為4.5時，大豆和稻草秸稈木質素的降解率最高。這可能是偏酸性條件一方面會促進白腐菌的生長，另一方面是由于木質纖維素酶系的最適pH偏酸性，能使分泌的酶保持較高的活性。侯紅漫［11］等認為當pH低于3時，不利于白腐菌菌體的生長，pH高于6時，雖然可以讓菌體生長良好，但是不利于酶的合成。

2.4 秸稈降解的表征分析觀察(SEM)

白腐菌降解大豆和稻草秸稈時，分泌木質素過氧化物酶系、錳過氧化物酶系、漆酶及過氧化氫酶等，使大豆和稻草秸稈的表面受到破壞。研究秸稈表觀結構在發(fā)酵中的變化，為深入探討白腐菌降解木質素的效果提供參考。通過黃孢原毛平革菌對木質素降解率的影響因素的實驗，最后得到加入合成培養(yǎng)液12mL、種子添加量為0.8mL、培養(yǎng)基pH4.5條件下木質素降解率是最高的。圖4是大豆和稻草秸稈降解前后橫切面和內外表面掃描電鏡結果。

圖4 白腐菌以大豆與稻草秸稈為基質降解10d后SEM結果Fig.4 The SEM results of degradation of soybean straw and rice straw by Phanerochaete Chrysosporium Burdsall for 10d

由圖4(a)、(b)、(e)、(f)可知，原始大豆秸稈表面及內部纖維束均勻、整齊、平滑，呈自然伸展狀態(tài)，結構緊密規(guī)整，質地堅硬。維管內部結構致密、光滑，空穴偶有可見，橫切面維管束壁結構比較緊湊;秸稈表面光滑，被一層蠟所覆蓋，無空穴。原始稻草秸稈的表觀結構緊密規(guī)整，稻草秸稈內表面光滑，被一層蠟所覆蓋，無空穴;外表面有些許凸起粗糙，結構緊密無縫隙。

大豆和稻草秸稈經過黃孢原毛平革菌降解10d后，由圖4(c)、(d)可見，大豆秸稈結構遭到嚴重破壞，橫截面圖可明顯發(fā)現無完整維管束，大部分已被破壞;空穴增多、增大，秸稈被嚴重破壞。圖4(g)、(h)可見稻草秸稈的內、外表面均存在很多的裂縫和孔洞。

3 結果與討論

木質素是由苯基－丙烷結構單元通過醚鍵、碳－碳鍵聯(lián)結而成的具有三維結構的芳香族高分子化合物［12－15］。木質素很難降解，同時也無法形成發(fā)酵性糖類，黃孢原毛平革菌中含有降解木質素能力的酶類。通過實驗得到在合成培養(yǎng)液12mL、種子添加量為0.8mL、培養(yǎng)基pH 4.5條件下，經黃孢原毛平革菌降解10d木質素降解率最高，測得降解率分別為大豆秸稈49.91%、稻草秸稈49.50%。同時通過大豆和稻草秸稈降解10d與未降解時的SEM對比觀察發(fā)現，降解10d的大豆和稻草秸稈表面空穴增多、增大，甚至相互連通，說明降解效果明顯。

黃孢原毛平革菌降解大豆和稻草秸稈時，先降解秸稈表面木質素，生成空穴，之后菌絲通過空穴進入秸稈內部，分泌酶系進一步降解秸稈內部成分。黃孢原毛平革菌反應條件溫和、處理成本低、能耗低、專一性強、不存在環(huán)境污染等優(yōu)點。可見由黃孢原毛平革菌降解農作物秸稈，使其資源化、環(huán)境化，是具有可行性的。

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Observation and utilization of characteristics of white－rotfungi degrades lignin of the straw’s stroma by SEM

XU Wei，WANG Li－ting

(College of Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)

The degradation law of soybean straw lignin and rice straw lignin by Phanerochaete chrysosporium was studied.The results showed that the amount of synthesis adding liquor was 12mL and quantity was 0.8mL in the two kind 5g straw powder，the quantity of inoculum which concentration of Phanerochaete Chrysosporium Burdsall was 8.6×106cfu/mL，inoculation was 0.8mL，the medium of initial pH was 4.5，the degradation time was 10d.Then the degradation rates of the soybean straw lignin was 49.91%and the rice straw lignin was 49.50%，respectiely.By using scanning electron microscopy(SEM)，the apparent structure of straw before and after fermentation was observed.The results showed that the capacities of degrading soybean straw and rice straw by Phanerochaete Chrysosporium Burdsall was strong.The surface holes of soybean straw and rice straw increased in number and largen in volume and evensome linked together after degradation for 10d by Phanerochaete Chrysosporium Burdsall.The degradation impaction was obvious.

soybean straw;rice straw;Phanerochaete Chrysosporium Burdsall;lignin;SEM

TS210.1

A

1002－0306(2012)08－0225－03

黑龍江省是全國農業(yè)大省，大豆秸稈和稻草產量非常大，但大多秸稈資源被焚燒，造成了大氣污染。秸稈是一種豐富的纖維素資源，在木質纖維質原料的細胞壁結構中，纖維素是被木質素和半纖維素包裹著的，因此，將木質素降解，對其進行預處理，是提高纖維質原料后續(xù)發(fā)酵效率的重要方式。利用微生物降解大豆和稻草秸稈中的木質素，是使其資源化、環(huán)境化的有效途徑。秸稈主要由木質纖維素以及少量蛋白質、脂肪、醇類、醛、酮和有機酸等組成［1－3］，木質纖維素由木質素、纖維素、半纖維素三者構成［4］。大豆秸稈木質素含量約為18%、稻草秸稈木質素含量約為15%［5］。以含有木質素的農業(yè)廢棄物秸稈為基質，利用黃孢原毛平革菌降解木質纖維素的復雜結構，對于有效地利用和轉化秸稈資源，擴大發(fā)酵產品工業(yè)原料來源，減少工業(yè)用糧，降低發(fā)酵產物成本，都具有一定的現實意義。

2011－07－04

徐偉(1963－)，女，博士，副教授，研究方向:微生物發(fā)酵工程。

黑龍江教育廳科技面上項目(12511130)。