李 江，李 玉，曹月婷，荊 瑋，董逸楠，路福平

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457)

一株發(fā)酵乳桿菌的篩選鑒定及其高密度培養(yǎng)的研究

李 江，李 玉*，曹月婷，荊 瑋，董逸楠，路福平

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457)

自黑龍江鶴崗自制酸菜汁中分離得到兩株乳桿菌，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定均為發(fā)酵乳桿菌并命名為發(fā)酵乳桿菌L1和L3，其中L1具有良好的耐酸和耐膽鹽能力。用改良MRS培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵乳桿菌L1 7L發(fā)酵罐的高密度培養(yǎng)進(jìn)行了研究，通過補(bǔ)堿和補(bǔ)糖有效克服了發(fā)酵過程中產(chǎn)酸和碳源短缺對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制，最高菌濃可達(dá)10.19 lgCFU/mL，較分批培養(yǎng)有顯著提高，為發(fā)酵乳桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。

發(fā)酵乳桿菌，耐酸，耐膽鹽，高密度培養(yǎng)，分批補(bǔ)料培養(yǎng)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 取自黑龍江鶴崗的酸菜汁，樣品放入密封瓶中保持4℃低溫;MRS培養(yǎng)基 蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·7H2O 0.2g，磷酸氫二鉀3g，乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，吐溫80 1mL，水1L，pH6.2～6.6，115℃滅菌20min;改良MRS培養(yǎng)基 酪蛋白胨10g，酵母粉10g，葡萄糖10g，K2HPO43.5g，乙酸鈉3g，MgSO4· 7H2O 0.4g，吐溫80 1mL，水1L，pH6.8～7.0，115℃滅菌20min;脫脂乳培養(yǎng)基 脫脂乳粉(完達(dá)山)10g，水100mL，pH自然，115℃滅菌15min;酪蛋白胨 北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司;酵母粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;牛膽鹽 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PTC－200型 PCR基因擴(kuò)增儀 MJ Research Inc.;SBA－40C型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;厭氧培養(yǎng)箱 浙江義烏冷凍機(jī)總廠。

表1 分離出菌株的初步觀察鑒定Table 1 Preliminary identification of isolated strains

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化 取酸菜汁1mL，接種于MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48h，將菌液逐級(jí)稀釋至10－5～10－8。分別取0.1mL稀釋液在添加1%(w/v) CaCO3的MRS固體平板上涂布，37℃厭氧培養(yǎng)48h。挑取有透明圈的單菌落在平板上劃線培養(yǎng)，直到菌落的形態(tài)均一，分別挑取形態(tài)不同的菌落，做革蘭氏染色，選取其中的革蘭氏陽性菌進(jìn)行凝乳實(shí)驗(yàn)(用接種針挑取菌落一環(huán)，接種于盛有10mL脫脂乳培養(yǎng)基的試管中，37℃厭氧箱中培養(yǎng)，觀察凝乳情況，當(dāng)開始結(jié)凍成形并出現(xiàn)少量乳清時(shí)，記錄發(fā)酵時(shí)間，此為該菌株的凝乳時(shí)間)。

1.2.2 16S rDNA序列分析鑒定 細(xì)菌基因組總DNA的提取采用苯酚氯仿法。菌株的16S rDNA采用 通 用 引 物［12］， 正 向 引 物 為:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，反向引物為:5'－GGCTGCTGGCACGTAGTTAG－3'，PCR反應(yīng)程序如下:95℃預(yù)變性5min;94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST在線比對(duì)。

1.2.3 耐酸實(shí)驗(yàn) 將活化好的菌液以2%(v/v)的接種量分別接種于用HCl調(diào)節(jié)pH為1、2、3的MRS液體培養(yǎng)基中，以pH 6.5作為對(duì)照，37℃靜置培養(yǎng)，在0、2、3h取樣，利用傾注平板法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，檢測(cè)菌株對(duì)酸的耐受性。

1.2.4 耐膽鹽實(shí)驗(yàn) 將活化好的菌液以2%(v/v)的接種量分別接種于含0.1%、0.2%、0.3%(w/w)膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，以不含膽鹽的MRS培養(yǎng)基做對(duì)照，37℃靜置培養(yǎng)，在0、2、4、6、8h取樣，用傾注平板法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。繪制菌株的生長(zhǎng)曲線，比較菌株生長(zhǎng)與膽鹽含量的關(guān)系。

1.2.5 7L發(fā)酵罐分批培養(yǎng) 利用經(jīng)過優(yōu)化改良的培養(yǎng)基進(jìn)行7L的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，裝液量5L，初始pH為7，發(fā)酵溫度37℃，每隔2h記錄pH并取樣測(cè)其活菌量和葡萄糖含量。

1.2.6 7L發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng) 每隔2h測(cè)發(fā)酵液pH和葡萄糖含量，通過流加5mol/L的NaOH溶液以調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，補(bǔ)加50%(w/v)的葡萄糖溶液以維持發(fā)酵液中的碳源量進(jìn)行發(fā)酵，每隔2h記錄pH并取樣測(cè)其活菌量和葡萄糖含量。

1.2.7 指標(biāo)測(cè)定

1.2.7.1 活菌量的測(cè)定 平板計(jì)數(shù)法:梯度稀釋后，傾注平板［13］，置于厭氧箱37℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。

1.2.7.2 葡萄糖含量的測(cè)定 取1mL發(fā)酵液，6000r/min離心5min，取上清，稀釋10倍后取25μL在SBA－40C型生物傳感儀中進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

酸菜汁樣品在添加1%(w/v)CaCO3的MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出單菌落后，將有透明圈的菌根據(jù)菌落形態(tài)和菌體形態(tài)進(jìn)行分類，得出五株菌，如表1所示。

由表1可知，L1、L2和L3為G+菌。通過凝乳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L1和L3凝乳快，且為桿狀，推測(cè)可能為乳桿菌。菌株L1和L3的菌落和菌體照片如圖1。

圖1 菌株L1和L3的菌落和菌體形態(tài)(×1000)Fig.1 Colonial morphology and thallus appearance of L.fermentum L1 and L3(×1000)

2.2 16S rDNA序列鑒定

對(duì)L1和L3進(jìn)行基因組的提取和16S rDNA序列的擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，兩株菌擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度均在1500bp左右，將擴(kuò)增出的基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示L1和 L3與 L.fermentum KLDS 1.0615登 錄 號(hào)EU419593.1的16S rDNA基因序列相似性分別為100%和99%，即確定將此兩株菌均為發(fā)酵乳桿菌并命名為發(fā)酵乳桿菌L1和L3。

2.3 耐酸實(shí)驗(yàn)

乳酸菌要想達(dá)到益生的作用，必須能通過消化道定植于腸內(nèi)，并且通常食品中的益生菌數(shù)量不低于107CFU/g時(shí)才能發(fā)揮益生功能。胃液是阻止大多數(shù)微生物進(jìn)入腸道的天然屏障，胃液pH的大小根據(jù)飲食結(jié)構(gòu)不同而波動(dòng)很大，通常pH為2.5左右，空腹或食用酸性食品pH可達(dá)1.5，食用堿性食品pH可達(dá)4～5。所以具有耐胃液能力的乳酸菌才可能以一定的活菌數(shù)量進(jìn)入腸道［14］，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了pH為1、2、3的環(huán)境，菌體在其中的生長(zhǎng)情況如表2所示。

圖2 發(fā)酵乳桿菌L1和L3的16S rDNA基因擴(kuò)增電泳圖Fig.2 PCR amplification pattern of 16S rDNA from L.fermentum L1 and L3

表2 發(fā)酵乳桿菌L1和L3在不同pH中的存活率Table 2 Survival rate of L.fermentum L1 and L3 under different pH conditions

由表2可知，發(fā)酵乳桿菌L1和L3對(duì)低pH環(huán)境均有一定的耐受性，而L1菌種的耐受性更為明顯。pH為1時(shí)，兩株菌都不能生長(zhǎng);pH為2時(shí)，經(jīng)過2h和3h后，菌株 L1的存活率分別是 32.76%和15.86%，其活菌量可保持在7 lgCFU/mL左右，而菌株L3的活菌數(shù)下降很快，存活率低至0.71%，活菌數(shù)只保持在5 lgCFU/mL以上;pH為3時(shí)，菌株L1的活菌含量保持在18.97%水平以上，而菌株L3在3h時(shí)只有2.22%的菌體存活。

2.4 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

人體小腸中膽汁鹽含量在0.03%～0.3%(w/w)范圍內(nèi)波動(dòng)［15］，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，設(shè)計(jì)了濃度為0.1%～0.3%(w/w)的模擬膽鹽環(huán)境，菌體在其中的生長(zhǎng)情況如圖3所示。由圖3可知，兩株菌都顯示出一定的膽鹽耐受性，其中發(fā)酵乳桿菌L1在0.3%的膽鹽濃度下仍可保持活菌量在7 lgCFU/mL以上并且在8h時(shí)活菌量已經(jīng)回升，菌體處于生長(zhǎng)時(shí)期，說明菌體可以在模擬腸道環(huán)境中生存，由此可見，發(fā)酵乳桿菌L1具有開發(fā)優(yōu)良益生菌的潛力。

2.5 7L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)

對(duì)發(fā)酵乳桿菌L1的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，利用優(yōu)化后的改良培養(yǎng)基進(jìn)行7L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，初始pH 7.0，發(fā)酵溫度37℃，間歇攪拌發(fā)酵，發(fā)酵情況如圖4所示。對(duì)圖4的曲線進(jìn)行分析，相對(duì)于三角瓶靜置培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中菌體對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)更為旺盛，達(dá)到最大活菌的時(shí)間也有所縮短，這對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)是有利的，但最大菌體量8.90 lgCFU/mL并沒有比在三角瓶培養(yǎng)時(shí)提高很多，并且穩(wěn)定期持續(xù)不久便進(jìn)入衰亡期，可能因?yàn)闅執(zhí)橇吭?8h時(shí)已經(jīng)維持在很小的水平，碳源的短缺導(dǎo)致菌體無法繼續(xù)生長(zhǎng)，另外，發(fā)酵乳桿菌代謝產(chǎn)酸越來越多，低pH和過量的酸造成的惡劣環(huán)境使菌體不能處于活躍的生長(zhǎng)狀態(tài)，所以本研究設(shè)計(jì)了在發(fā)酵過程中補(bǔ)糖和添加堿中和劑的實(shí)驗(yàn)，以促進(jìn)發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)。

圖3 發(fā)酵乳桿菌L1和L3在不同膽鹽濃度下的生存能力Fig.3 Growth of L.fermentum L1 and L3 exposed to different concentrations of bile salt

圖4 發(fā)酵乳桿菌L1在7L罐的發(fā)酵情況Fig.4 Batch fermentation of L.fermentum L1 in 7L fermenter

2.6 7L發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，發(fā)酵過程中當(dāng)pH下降至5.9時(shí)，開始流加5mol/L的NaOH，維持pH6.0左右，當(dāng)葡萄糖含量降至2g/L時(shí)開始補(bǔ)加葡萄糖，維持葡萄糖含量在2～4g/L。發(fā)酵情況如圖5所示。由圖5可知，通過添加NaOH維持pH在5.9～6.1，添加葡萄糖溶液維持葡萄糖含量在2～4g/L，菌體生長(zhǎng)更加旺盛，有效解除了產(chǎn)酸和碳源短缺對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制，生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期均有所延長(zhǎng)，最高活菌量有顯著提高，24h時(shí)活菌數(shù)最高，達(dá)到10.19 lgCFU/mL，較無補(bǔ)料時(shí)增長(zhǎng)顯著。

圖5 發(fā)酵乳桿菌L1在7L罐的補(bǔ)料發(fā)酵情況Fig.5 Fed－batch fermentation of L.fermentum L1 in 7L fermenter

3 結(jié)論

自黑龍江鶴崗自制的酸菜汁中分離得到兩株乳桿菌，經(jīng)16S rDNA序列鑒定均為發(fā)酵乳桿菌，其中L1具有良好的耐酸和耐膽鹽特性。用優(yōu)化后的MRS培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵乳桿菌L1的7L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)進(jìn)行了研究，通過補(bǔ)堿和補(bǔ)糖有效克服了發(fā)酵過程中產(chǎn)酸和碳源短缺對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制，發(fā)酵最高菌濃可達(dá) 10.19 lgCFU/mL，較分批培養(yǎng)的 8.90 lgCFU/mL有顯著提高，達(dá)到了高密度培養(yǎng)的目的。

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Screening identification and high－density cultivation of Lactobacillus fermentum

LI Jiang，LI Yu*，CAO Yue－ting，JING Wei，DONG Yi－nan，LU Fu－ping
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，College of Biotechnology，Tianjin University of Science＆Technology，Tianjin 300457，China)

Two Lactobacilli were isolated from the sample of traditionally home－made chinese pickle juice in Hegang，Heilongjiang province of China.The strains were identified as Lactobacillus fermentum by using 16S rDNA of molecular methods and were denominated L1 and L3.L.fermentum L1 exhibited a stronger tolerance to 0.3%bile salt and low pH than L3.After high－density cultivation by adding alkali and glucose in enrichment medium with optimized conditions，the count of living cells in fermentation broth could reach to 10.19 lgCFU/mL，which was much higher than the number of batch culture.The result could provide some useful data to the industrial application of L.fermentum.

Lactobacillus fermentum;acid tolerance;bile salt tolerance;high－density cultivation;fed－batch fermentation

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0211－04

發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)作為潛在的益生菌，廣泛分布于人和動(dòng)物的胃腸道中，是腸道、口腔和陰道的正常菌群［1］，目前發(fā)酵乳桿菌多用于豆乳發(fā)酵［2］，香腸發(fā)酵［3］，許多報(bào)道指出發(fā)酵乳桿菌具有水解膽鹽，降膽固醇的功能［4－6］，它能夠調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)微生物菌群的平衡，可以通過口服而到達(dá)腸道［7］，很好地吸附在小腸的上皮細(xì)胞［8］。并產(chǎn)生表面活性成分而阻止有害菌對(duì)腸道的粘附，而改善宿主體內(nèi)系統(tǒng)環(huán)境，對(duì)宿主健康具有促進(jìn)作用［9］。由于發(fā)酵乳桿菌的益生特性不斷被發(fā)掘出來，其在食品發(fā)酵和醫(yī)療保健等領(lǐng)域的應(yīng)用也顯得十分廣闊［1］，然而只有當(dāng)菌體耐受消化道的不良環(huán)境，活著到達(dá)并定植于宿主腸道，且具有一定的細(xì)胞密度，才能發(fā)揮其益生作用［10－11］，因此發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)顯得十分重要。本研究篩選出一株具有耐受胃腸道環(huán)境的發(fā)酵乳桿菌，利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行7L發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵，進(jìn)而為該菌制劑的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

2011－07－22 *通訊聯(lián)系人

李江(1987－)，男，碩士研究生，研究方向:益生菌的研究和生產(chǎn)。

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目(10ZCKFNC01700);國(guó)家自然科學(xué)基金(青年科學(xué)基金項(xiàng)目)(20806060)。