彭曉莉，劉 新，陳衛(wèi)中，程道梅，冷言冰

(成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川成都610083)

響應(yīng)面優(yōu)化龍眼核原花青素的醇提工藝

彭曉莉，劉 新，陳衛(wèi)中，程道梅，冷言冰*

(成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川成都610083)

目的:優(yōu)化龍眼核原花青素醇提條件。方法:在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box－Behnkenk中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)龍眼核原花青素的醇提條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果:通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取溫度為優(yōu)化對(duì)象。建立二次多項(xiàng)式回歸方程預(yù)測(cè)模型Y=1.15+0.034A+0.094B+0.004C－0.036AB+0.044AC－0.11BC－0.24A2－0.23B2－0.087C2。響應(yīng)面分析確定適合的反應(yīng)條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶23(mg/mL)，提取溫度為39℃。預(yù)測(cè)響應(yīng)值為1.16%，驗(yàn)證龍眼核原花青素得率為1.12%。結(jié)論:響應(yīng)面分析法確定的提取條件合理，驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值接近，可以用于龍眼核原花青素的提取。

龍眼核，原花青素，響應(yīng)面

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮龍眼 廣州產(chǎn)，品種為福眼，市售;原花青素標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥95%，天津尖峰天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn);無(wú)水乙醇、石油醚(沸程30～60℃)、硫酸鐵銨、鹽酸、正丁醇 均為分析純，成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。

UV－1102紫外－可見(jiàn)光分光光度計(jì) 天美科技有限公司;THZ－82恒溫振蕩器 江蘇天由有限公司;KDC－12低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;DHG－9053A型鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;FY－135粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;萬(wàn)分之一電子天平 北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龍眼核的處理與提取 新鮮龍眼洗凈，人工剝皮，取核。龍眼核放置于干燥箱，40℃干燥至恒重。粉碎后過(guò)40目標(biāo)準(zhǔn)篩，立即置入30℃石油醚中脫脂8h，陰干得實(shí)驗(yàn)用龍眼核粉樣品，備用。準(zhǔn)確稱取龍眼核粉樣品0.3mg，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，放入恒溫振蕩器，在一定溫度下振蕩一定時(shí)間后取出，離心，過(guò)濾，相同方法提取兩次，將濾液混合，即為龍眼核原花青素提取液。

1.2.2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 龍眼核原花青素的檢測(cè)采用正丁醇－鹽酸比色法分析檢測(cè)［9］。稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品 10.00mg，用甲醇溶解，定容至10mL，制得濃度為1.00mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。再用甲醇稀釋，制成濃度為 0、10、25、50、100、150、200和250μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0.5mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液加入鹽酸－正丁醇溶液(體積比5∶95)6mL、2%硫酸鐵銨溶液0.2mL［10］，混合后置于沸水浴中進(jìn)行顯色反應(yīng)40min，取出立即置入4℃冰浴中降溫3～5min，取出冷至室溫。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)550nm［11］處測(cè)定吸光度。在550nm處以試劑空白調(diào)零，測(cè)定吸光度值A(chǔ)，確定線性范圍，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為 Y=0.0024X+ 0.0253，R2=0.9962，式中:Y為吸光度，X為原花青素濃度，μg/mL。

1.2.3 龍眼核原花青素的測(cè)定 取0.5mL提取液按1.2.2方法檢測(cè)，查標(biāo)準(zhǔn)曲線。龍眼核原花青素計(jì)算公式為［12］:

式中:m－查標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品液OD550對(duì)應(yīng)的原花青素的含量，μg;V1－待測(cè)樣品的取樣體積，mL;V2－樣品定容體積，mL;M－樣品取樣質(zhì)量，g;d－樣品溶液稀釋倍數(shù);W－樣品含水量。

1.3 龍眼核原花青素提取工藝優(yōu)化

1.3.1 龍眼核原花青素提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)龍眼核原花青素提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取0.3mg脫脂龍眼核粉碎粉末5組、每組3份。在料液比1∶7(mg/mL)、提取液pH=3的條件下，分別用體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%，溫度40℃振蕩提取40min后離心過(guò)濾。以龍眼核原花青素得率為指標(biāo)，分析龍眼核原花青素得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系，以確定最佳乙醇提取劑的體積分?jǐn)?shù)。

1.3.1.2 料液比對(duì)龍眼核原花青素提取效果的影響準(zhǔn)確稱取0.3mg脫脂龍眼核粉碎粉末5組，每組3份。按料液比為1∶5、1∶7、1∶10、1∶12、1∶15的比例加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，溫度40℃振蕩提取40min后離心過(guò)濾。以龍眼核原花青素得率為指標(biāo)，分析料液比對(duì)龍眼核原花青素得率的影響，以確定最佳料液比。

1.3.1.3 溫度對(duì)龍眼核原花青素提取效果的影響準(zhǔn)確稱取0.3mg脫脂龍眼核粉碎粉末5組，每組3份。按料液比1∶7，體積分?jǐn)?shù)50%乙醇于30、40、50、60、70℃振蕩提取后離心過(guò)濾，溫度40℃振蕩提取40min后離心過(guò)濾。以龍眼核原花青素得率為指標(biāo)，分析溫度對(duì)龍眼核原花青素得率的影響，以確定最佳提取溫度。

1.3.1.4 提取時(shí)間對(duì)原花青素提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取0.3mg脫脂龍眼核粉碎粉末5組，每組3份。按料液比1∶7、50%乙醇溶液，溫度40℃振蕩提取1、2、3、4、5h后離心過(guò)濾。以龍眼核原花青素得率為指標(biāo)，分析提取時(shí)間對(duì)龍眼核原花青素得率的影響，以確定最佳提取時(shí)間。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化原花青素提取方法 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出影響龍眼核原花青素提取效果的因素。以各因素為自變量，運(yùn)用 Design Expert 8.0.5程序進(jìn)行Box－Behnken設(shè)計(jì)，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化龍眼核原花青工素提取條件?？紤]實(shí)驗(yàn)室條件和可行性，固定提取時(shí)間為4h，用響應(yīng)面法，以龍眼核原花青素得率為響應(yīng)值(因變量Y)，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)和提取溫度(C)3因素的3水平進(jìn)行提取條件的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)龍眼核原花青素提取效果的影響

由圖1可見(jiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，龍眼核原花青素得率值相應(yīng)增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)得率最高。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于40%時(shí)，得率下降，乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)80%后，得率值急劇降低。可能因乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，導(dǎo)致一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些物質(zhì)與乙醇－水分子結(jié)合，影響原花青素的溶出［13］。此次研究確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。把乙醇體積分?jǐn)?shù)30%～50%作為響應(yīng)面法的考察范圍。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取效果的影響Fig.1 Effect of alcohol fraction on the proanthocyanidins yield

2.2 料液比對(duì)龍眼核原花青素提取效果的影響

由圖2可見(jiàn)，隨著料液比的增大，龍眼核原花青素得率增加，料液比為1∶20以后，龍眼核原花青素得率下降。隨著溶劑量的增加，對(duì)原花青素的提取效果也越好，當(dāng)溶劑量過(guò)大時(shí)，溶液中的原花青素提取量將達(dá)到飽和，再增大溶劑量，吸光度值出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，此次研究確定料液比1∶20，把料液比1∶10～1∶30作為響應(yīng)面分析的考察范圍。

圖2 料液比對(duì)龍眼核中原花青素提取效果的影響Fig.2 Effect of ratio of raw material to solvent on the proanthocyanidins yield

2.3 提取溫度對(duì)龍眼核原花青素提取效果的影響

由圖3可見(jiàn)，隨著提取溫度的升高，龍眼核原花青素得率值升高。提取溫度高于40℃后，龍眼核原花青素得率值下降，60℃以后下降趨勢(shì)更明顯。得率值下降的原因可能是與提取物在高溫下不穩(wěn)定，化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變有關(guān)。因此，此次研究確定提取溫度為40℃，把溫度30～50℃作為響應(yīng)面的考察范圍。

圖3 溫度對(duì)龍眼核中原花青素提取的影響Fig.3 Effect of temperature on the proanthocyanidins yield

2.4 提取時(shí)間對(duì)龍眼核原花青素提取效果的影響

由圖4可見(jiàn)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，龍眼核原花青素得率不斷升高，當(dāng)達(dá)到4h以后，龍眼核原花青素得率增加不明顯。提取時(shí)間對(duì)提取的影響主要是因?yàn)閭髻|(zhì)過(guò)程需要有足夠的時(shí)間達(dá)到平衡［14］，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，原花青素在固－液之間的濃度基本達(dá)到了平衡，再延長(zhǎng)時(shí)間，溶液中的原花青素濃度變化不大?？紤]提取效率，此次實(shí)驗(yàn)確定提取時(shí)間為4h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)龍眼核中原花青素提取的影響Fig.4 Effect of time on the proanthocyanidins yield

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化提取龍眼核原花青素

2.5.1 響應(yīng)面優(yōu)化龍眼核原花青素提取條件 按照Design Expert 8.0.5軟件中的Box－Behnken設(shè)計(jì)模式設(shè)計(jì)，見(jiàn)表2。

表2 Box－Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)響應(yīng)結(jié)果Table 2 Box－Behnken Design and response result values for the proanthocyanidins yield

2.5.2 回歸分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的龍眼核原花青素得率進(jìn)行回歸，建立二次回歸模型。從方差分析結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)所選模型F值為7.6，P值為0.0070差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);失擬項(xiàng)F值為4.52，失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著，表明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況較好。信噪比(Adeq Precisior)的值為8.27，該模型可以用于預(yù)測(cè)。R2=0.9072表明此方程有較好的擬合度，方程與實(shí)際情況比較相符，并能作出相對(duì)準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)，但Pred R－Squard值與Adj R－Squared值相差很大，該響應(yīng)面方程需要做進(jìn)一步的優(yōu)化。相應(yīng)的響應(yīng)面方程為:

式中:A代表乙醇體積分?jǐn)?shù)，B代表料液比，C代表提取溫度。

從回歸方程中可以看出，各因素對(duì)龍眼核原花青素提取的影響大小順序?yàn)?料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度。模型與方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)回歸分析結(jié)果，將建立的回歸模型中的任一因素固定在零水平，得到另兩個(gè)因素的交互影響結(jié)果，作出二次回歸方程的響應(yīng)面圖，如圖5～圖7所示。

由圖5～圖7可見(jiàn)兩兩之間交互作用較顯著［15］。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比增大，原花青素得率增加并在某水平達(dá)到極值。原花青素得率隨提取溫度增高而上升，提取溫度進(jìn)一步增高時(shí)，原花青素得率降低。

應(yīng)用Design Expert Box－Behnken對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行最優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到最佳的提取條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶23，提取溫度為39℃，預(yù)測(cè)響應(yīng)值龍眼核原花青素得率為1.16%。

2.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取0.3mg樣品，在最佳條件下提取，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取平均值，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。樣品的平均值響應(yīng)值為 1.12%，與預(yù)測(cè)值相符度為96%。

表3 模型與方差分析結(jié)果Table 3 The experiment variance analysis of response surface design

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)原花青素提取的影響Fig.5 Effect of alcohol fraction and ratio of raw material to solvent on the proanthocyanidins yield

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)原花青素提取的影響Fig.6 Effect of alcohol fraction and temperature on the proanthocyanidins yield

圖7 料液比和提取溫度對(duì)原花青素提取的影響Fig.7 Effect of ratio of raw material to solvent and temperature on the proanthocyanidins yield

3 結(jié)論

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)考察范圍較窄，應(yīng)先確定考查范圍內(nèi)存在最大響應(yīng)值。由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，龍眼核提取液吸光度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取溫度的增加，出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，而在本實(shí)驗(yàn)最長(zhǎng)提取時(shí)間7h內(nèi)吸光度沒(méi)有出現(xiàn)下降趨勢(shì)。分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取溫度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，料液比、乙醇濃度對(duì)龍眼核原花青素提取液的吸光度影響大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。響應(yīng)面法優(yōu)化得出龍眼核原花青素的最佳提取條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶23，提取溫度為39℃?；貧w分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的提取條件合理可行。

［1］MenghiniL，LeporiniL，Scanu N，etal.Effectof phytochemical concentrations on biological activities of cranberry extracts［J］.J Biol Regul Homeost Agents，2011，25(1):27－35.

［2］Zhang FJ，Yang JY，Mou YH，et al.Oligomer procyanidins from grape seeds induce a paraptosis－like programmed cell death in human glioblastoma U－87 cells［J］.Pharm Biol，2010，48(8): 883－890.

［3］Furuuchi R，Yokoyama T，Watanabe Y.Protective effect of structurally diverse grape procyanidin fractions against UV－induced cell damage and death［J］.J Agric Food Chem，2011，59 (8):3738－3746.

［4］Terra X，Pallarés V，Ardèvol A，et al.Modulatory effect of grape－seed procyanidins on local and systemic inflammation in diet－induced obesity rats［J］.J Nutr Biochem，2011，22(4): 380－387.

［5］Chung YC，Lin CC，Chou CC，et al.The effect of longan seed polyphenols on colorectal carcinoma cells［J］.Eur J Clin Invest，2010，40(8):713－721.

［6］Rangkadilok N，Sitthimonchai S，Worasuttayangkurn L，et al. Evaluation of free radical scavenging and antityrosinase activities of standardized longan fruit extract［J］.Food Chem Toxicol，2007，45(2):328－336.

［7］Zheng SQ，Jiang F，Gao HY.Preliminary observations on the antifatigue effects of longan(Dimocarpus longan Lour)seed polysaccharides［J］.Phytother Res，2010，24(4):622－624.

［8］涂佳，鄧學(xué)良，李忠海，等.響應(yīng)面法優(yōu)化野生毛葡萄中原花青素醉提工藝的實(shí)驗(yàn)［J］.湖南林業(yè)科技，2010，37(1):1－6.

［9］洪新，唐克，牟曉剛，等.葡萄籽中原花青素鐵鹽催化比色法的測(cè)定條件研究［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，30(6):41－46.

［10］賈佳，楊磊，祖元?jiǎng)?落葉松樹(shù)皮原花青素的勻漿提取及響應(yīng)面法優(yōu)化［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2009(3):78－84.

［11］李華，肖付才，袁春龍，等.鐵鹽催化比色法測(cè)定葡萄籽超微粉中原花青素［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28(9):114－117.

［12］秦玉玲，車?guó)P斌，李疆，等.新疆特色果品中原花青素含量的分析比較［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，46(3):484－487.

［13］張瑜，張換換，李志洲.紅毛丹果皮中原花青素提取及其抗氧化性［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2011，32(1):188－192.

［14］侍朋寶，陳海菊，柴菊華，等.番茄紅素提取工藝參數(shù)的研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30(11):9－12.

［15］李瓊，何純蓮，李志光，等.響應(yīng)面優(yōu)化百合多糖提取條件［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2010，31(12):37－41.

Optimization of ethanol extraction of proanthocyanidins from longan seed using response surface analysis

PENG Xiao－li，LIU Xin，CHEN Wei－zhong，CHENG Dao－mei，LENG Yan－bing*
(Department of public health，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China)

Objective:To optimize ethanol extraction of proanthocyanidins from longan seed.Methods:A Box－Behnken design in response surface analysis was used to optimization of ethanol extraction of proanthocyanidins from longan seed.Results:Ethanol concentration，ratio of raw material to solvent(W/V)and temperature were selected as experimental factors.The optional conditions of ethanol extraction technology were as follows:ethanol concentration was 40%，ratio of raw material to solvent was 1∶23，temperature was 39℃.The mathematical model was Y=1.15+0.034A+0.094B+0.004C－0.036AB+0.044AC－0.11BC－0.24A2－0.23B2－0.087C2.The predicted values was 1.16%.The measured value of proanthocyanidins yield from longan seed was 1.12%.Conclusion:The obtained model was credible and could be used for actual prediction.

longan seed，proanthocyanidins，response surface analysis

TS255.1

B

1002－0306(2012)08－0305－05

原花青素(proanthocyanidins，PC)是植物中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱，是由黃烷－3－醇縮合而成的聚合物，其中二聚體分布較廣，研究較多。研究發(fā)現(xiàn)，植物中提取的原花青素具有很強(qiáng)的抗氧化和清除自由基能力［1］，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［2－3］、抗炎和改善實(shí)驗(yàn)小鼠肥胖［4］等作用。龍眼亦稱桂圓(Dimocarpus longgana Lour)，無(wú)患子科龍眼屬植物，我國(guó)龍眼資源豐富，但龍眼核多作為食品加工的廢棄物。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)龍眼核提取物能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［5］，具有清除自由基［6］，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠有抗疲勞［7］等作用。響應(yīng)面分析在提取條件分析中具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、周期短、求得的回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn)［8］，因此本文以龍眼核為原材料，運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化法探討龍眼核原花青素提取的最優(yōu)條件，為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用和深入研究打下基礎(chǔ)。

2011－07－06 *通訊聯(lián)系人

彭曉莉:(1979－)，女，碩士研究生，講師，研究方向:營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生。