武曉燕，唐源江，吳增丁

(華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系，福建廈門361021)

正交優(yōu)化超聲波提取酸茶總黃酮工藝的研究

武曉燕，唐源江*，吳增丁

(華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系，福建廈門361021)

目的:采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探討酸茶中黃酮提取的最佳工藝條件。方法:運(yùn)用超聲技術(shù)提取酸茶黃酮，用比色法測(cè)定黃酮提取率。結(jié)果:影響超聲提取酸茶中黃酮的因素:乙醇濃度＞提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間，最佳工藝條件為:以50%乙醇為提取溶劑，提取溫度60℃、料液比1∶25、提取時(shí)間40min。最佳工藝條件提取黃酮提取率為7.1617%。結(jié)論:優(yōu)化超聲提取法提取酸茶中的黃酮，提取效率高，方法簡便可行。

酸茶，楊梅葉蚊母樹，總黃酮，超聲波，正交實(shí)驗(yàn)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸茶 泉州市售;蘆丁對(duì)照品 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

V－1200可見分光光度計(jì)、UV－3200PCS紫外－可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司; KQ－250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵 上海申光儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮樣品的提取 精密稱取酸茶粉末0.5g，根據(jù)文獻(xiàn)［5－6］，初步選定提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度為:50℃、30min、1∶20、70%。進(jìn)行120W超聲提取，提取液冷卻后抽濾，再用漏斗過濾，濾液用蒸餾水定容至50mL容量瓶，即為待測(cè)的酸茶樣品液。

1.2.2 黃酮提取率的測(cè)定

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱取干燥至恒重的蘆丁0.0400g，加適量70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，70%乙醇定容至刻度，配制成濃度為0.4mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液備用。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確量取0.4mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mL分別置于25mL容量瓶中，分別加70%乙醇至10mL，再加入5%NaNO2溶液0.5mL，搖勻放置6min;然后再加10%Al(NO3)3溶液0.5mL，搖勻放置6min;最后加入1.0mol/mL NaOH溶液10mL，定容至刻度，搖勻放置15min［7］。在紫外分光光度計(jì)中200～1000nm范圍內(nèi)掃描，測(cè)出最大吸收波長λmax位于510nm處。分別測(cè)量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在最適波長510nm處的吸光度A。數(shù)據(jù)處理得回歸方程:A=12.47143C+0.00447(R2= 0.9998，n=6)，蘆丁溶液在0.008～0.050mg/mL范圍與A值呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2.3 樣品含量測(cè)定 精確吸取樣品液1mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度值，按下式計(jì)算黃酮提取率。

式中，C為待測(cè)液黃酮含量(g/L)，D為稀釋倍數(shù)，V為提取液體積(mL)，W為樣品干重(g)。

1.2.3 黃酮提取工藝

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 以乙醇作為溶劑，分析對(duì)黃酮提取效果影響最顯著的幾個(gè)因素:提取溫度，提取時(shí)間，料液比，乙醇濃度。依次以其中一個(gè)因素為變量，其它各因素條件不變來考察黃酮提取率。

1.2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比和乙醇濃度的三個(gè)水平為主要考察因素，以黃酮提取率作為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，因素水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度的影響 圖1為以70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20，提取時(shí)間為30min，超聲功率120W下，提取溫度對(duì)黃酮提取效果的影響。由圖1可以看出，在30～50℃之間，隨著溫度增加，黃酮提取率不斷增大，50℃時(shí)，黃酮提取率最高，提取溫度超過50℃時(shí)，提取率逐漸下降。根據(jù)分子熱擴(kuò)散原理，溫度升高，分子活動(dòng)頻率加大。在30～50℃之間，隨著溫度升高，黃酮類有效成分活動(dòng)頻率加大，滲出率提高，導(dǎo)致總黃酮提取率呈增加趨勢(shì);在50～70℃之間，黃酮類成分滲出率已經(jīng)達(dá)到最大，且在較高溫度下，黃酮成分可能發(fā)生變化、揮發(fā)等，而導(dǎo)致黃酮提取率略呈下降趨勢(shì)。因此，在單因素考察下，最佳溫度為50℃。

圖1 提取溫度對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on extraction

2.1.2 提取時(shí)間的影響 圖2為以70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20，溫度50℃，超聲功率120W下，提取時(shí)間對(duì)黃酮提取效果的影響。結(jié)果表明，在10～30min之間，隨著提取時(shí)間延長，黃酮提取率有明顯的提高;30～40min之間，隨著提取時(shí)間增加，黃酮提取率下降明顯;40～50min之間，黃酮提取率又呈增加趨勢(shì);但60min后，含量再次下降。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能:a.在時(shí)間40min、溫度50℃、料液比1∶20、乙醇濃度70%組合條件下，部分黃酮類組分不穩(wěn)定; b.酸茶植物組織結(jié)構(gòu)對(duì)黃酮成分有效滲出造成的阻滯延遲;c.儀器造成的誤差等。因此，在單因素考察下，結(jié)合能量損耗和工作效率，提取時(shí)間選擇30min為宜。

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction

2.1.3 料液比的影響 圖3為以70%乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間為30min，溫度為50℃，超聲功率120W下，料液比對(duì)黃酮提取效果的影響。結(jié)果表明，隨著料液比的增大，黃酮提取率也逐漸增大，當(dāng)繼續(xù)增加乙醇的量時(shí)，黃酮提取率呈下降趨勢(shì)。料液比為1∶20時(shí)，黃酮提取效果最好。

表3 回收率測(cè)定結(jié)果Table 3 The determination result of recovery ratio

圖3 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of material－liquid ratio on extraction

2.1.4 乙醇濃度的影響 相比于水，黃酮類化合物在乙醇和甲醇中溶解性更好［8］，而甲醇有毒，一般不宜使用，因此黃酮提取溶劑選擇一定濃度的乙醇。圖4為在提取時(shí)間30min、提取溫度50℃、超聲功率120W下，乙醇濃度對(duì)黃酮提取效果的影響。由圖4可知，乙醇濃度在30%～60%之間時(shí)，隨著濃度增加，黃酮提取率明顯增加;繼續(xù)提高乙醇濃度，黃酮提取率反而下降明顯;80%～90%之間，黃酮提取率幾乎不變。天然黃酮類化合物多以糖苷形式存在，糖易溶于水，但甙元成分不易溶于水，當(dāng)乙醇與水的比例達(dá)到最佳組合時(shí)，提取率最高。因此乙醇濃度為60%比較合適。

圖4 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effect of alcohol concentration on extraction

2.2 黃酮正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

精密稱取酸茶0.5g，以L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行提取。以黃酮提取率為指標(biāo)，考察不同因素對(duì)黃酮提取率的影響。結(jié)果見表2。

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，比較4個(gè)因素的極差R，結(jié)果表明影響黃酮提取率因素的大小順序?yàn)橐掖紳舛龋咎崛囟龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間，這說明乙醇濃度的大小對(duì)黃酮提取率的影響最大，其次是提取溫度和料液比，最小是提取時(shí)間，因此，生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制乙醇濃度。根據(jù)以上分析，結(jié)合其他因素綜合考慮，最佳工藝條件為:乙醇濃度50%，溫度60℃，料液比1∶25，提取時(shí)間40min。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of the orthogonal experiment

精密稱取酸茶0.5g，按最佳提取工藝條件試提取，測(cè)定黃酮的含量(重復(fù)4次)，其含量分別為7.1526%，7.1507%，7.1689%，7.1745%，平均含量為7.1617%，RSD=1.18%。

2.3 顯色穩(wěn)定性和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

精密量取樣品溶液置于容量瓶中，其余操作均同1.2.2.2，每隔30min測(cè)定吸光度，測(cè)定至4h。結(jié)果顯色穩(wěn)定性良好，RSD=0.63%。

采用加標(biāo)回收法［9］，精密稱取已知含量的樣品，分別加入含一定質(zhì)量蘆丁的對(duì)照品溶液，其余操作均同1.2.2.2，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

3.1 通過正交實(shí)驗(yàn)的極差分析得出:乙醇濃度和提取溫度是影響酸茶黃酮提取率的最主要因素。

3.2 提取酸茶黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度50%、提取溫度60℃、料液比1∶25、提取時(shí)間40min，最佳條件提取酸茶中黃酮的平均含量為7.1617%。黃酮提取率較高，提取結(jié)果穩(wěn)定，符合現(xiàn)代提取工業(yè)中省時(shí)、高效、節(jié)能的要求。

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Research of extraction technology of total flavonoids from acid tea using orthogonal experimental design

WU Xiao－yan，TANG Yuan－jiang*，WU Zeng－ding
(Department of Biotechnology and Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China)

Objective:The best extraction conditions of total flavonoids from acid tea were studied using orthogonal experimental design.Methods:Total flavonoids of acid tea were extracted and determined by using ultrasonic technique and colorimetry，respectively.Results:The factors influencing on extraction efficiency of total flavonoids were as follows:alcohol concentration＞temperature＞ratio of material to solution＞extraction time.The optimum technology was as follows:50%alcohol as extracting solvent，extraction temperature 60℃，the ratio of material to solvent 1∶25，the time 40min.The yield of total flavonoids from aicd tea was 7.1617%.Conclusion:The optimum technology of ultrasonic extraction for total flavonoids from acid tea was a more efficient and simple method.

acid tea;Distylium myricoides Hemsl;flavonoids;ultrasonic;orthogonal test

TS272.5+9

B

1002－0306(2012)08－0281－04

酸茶，是采集原植物楊梅葉蚊母樹(Distylium myricoides Hemsl.)嫩葉而經(jīng)與鐵觀音茶相同的工藝而制成的茶成品。楊梅葉蚊母樹隸屬金縷梅科(Hamamelidaceae)蚊母樹屬(Distylium)，國內(nèi)分布于四川、安徽、浙江、福建、江西、廣東、廣西、湖南及貴州東部等地區(qū)［1］。常用作綠化樹木，但由于它具消腫利尿功效，也可入藥用于醫(yī)治水腫、小便不利等癥。在福建、浙江部分地區(qū)有采集其葉加工成茶的習(xí)慣，稱其為野茶(主要浙江)，或酸茶、九條茶(福建)。楊梅葉蚊母樹主要含有黃酮、二苯駢呋喃和鞣質(zhì)類，具有抑制α－淀粉酶、α－葡萄糖苷酶和抗氧化性等活性［2］。據(jù)初步研究，酸茶不僅具有良好的清熱解毒功能，還有較好地降低血脂、膽固醇等功效，因而引起人們的注意。目前，在福建的泉州、莆田等茶產(chǎn)業(yè)比較發(fā)達(dá)的地區(qū)已有成品茶上市，而對(duì)酸茶成品的化學(xué)成分研究目前尚屬空白。超聲波頻率高于20kHz，并且不引起聽覺的彈性波。很多研究表明，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，可加速植物材料中的有效成分進(jìn)入溶劑，從而增加有效成分的提取率，縮短提取時(shí)間，并且還可避免高溫對(duì)提取成分的影響［3－4］。超聲技術(shù)在有效成分提取方法研究中的廣泛運(yùn)用，已越來越為廣大科學(xué)研究者所重視，并顯示出其明顯的優(yōu)勢(shì)。本文采用超聲波提取酸茶中黃酮，采用比色法［5］對(duì)黃酮進(jìn)行含量測(cè)定。以黃酮提取率為考察指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)酸茶中黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。

2011－07－18 *通訊聯(lián)系人

武曉燕(1986－)，女，碩士研究生，主要從事植物種質(zhì)資源研究與應(yīng)用。

華僑大學(xué)高層次引進(jìn)人才資助項(xiàng)目(09BS506)。