高丹丹，徐紀(jì)平，李貞子

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030)

木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白水解條件的研究

高丹丹，徐紀(jì)平，李貞子

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030)

采用馬鈴薯渣為原料提取馬鈴薯蛋白，用木瓜蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解。研究水解時(shí)間、溫度、pH和酶與底物濃度比(E/S)四個(gè)因素對(duì)水解過(guò)程的影響。以水解度(DH)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box－Benhnken響應(yīng)面分析法，優(yōu)化木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白質(zhì)的工藝條件。結(jié)果表明，在酶與底物濃度比為6000U/g時(shí)，最佳的水解條件為:溫度為64.70℃、pH為7.41、水解反應(yīng)時(shí)間3.12h。在此條件下，水解度為20.19%。

木瓜蛋白酶，馬鈴薯蛋白質(zhì)，水解度(DH)，響應(yīng)面，Box－Benhnken

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯渣 甘肅省蘭州市榆中縣金芋淀粉廠提供;木瓜蛋白酶(500U/mg) 北京中生瑞泰科技有限公司;TCA、茚三酮、正丁醇、氫氧化鈉、鹽酸等其他試劑 均為分析純。

FE220型中型粉碎機(jī) 北京科偉永興儀器有限公司;3K18型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司; PB－10型精密pH計(jì) Sartorius公司;GL－3250B型控溫磁力攪拌器 江蘇其林貝爾儀器制造有限公司; MP－500B型電子天平 上海天平總廠;Labconco Freezoneil型臺(tái)式凍干系統(tǒng) 照生公司;HH－SH－4型電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠;6010型紫外分光光度計(jì) 惠普有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 馬鈴薯蛋白的提取工藝［6］馬鈴薯渣粉20g→加600mL蒸餾水→用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH→浸提4h→4000r/min離心15min→分離出上清液→用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)上清液的pH為4.5→8000r/min離心15min→得到蛋白質(zhì)凝乳沉淀→冷凍干燥→馬鈴薯蛋白粉(蛋白質(zhì)含量91.07%)。

1.2.2 馬鈴薯蛋白酶解液的制備［7］配制一定濃度的馬鈴薯蛋白質(zhì)溶液，加氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH至酶的最適pH，然后按比例加入木瓜蛋白酶，在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下進(jìn)行水解，95℃水浴滅酶15min，然后加入一定量的10%的TCA(三氯乙酸)，4℃條件下8000r/min離心15min，沉降酶蛋白以及未酶解的馬鈴薯蛋白質(zhì)，取上清液直接使用或保存在－20℃等待分析使用。

1.2.3 水解度的測(cè)定 水解度的測(cè)定方法采用茚三酮比色法［8］。

式中:Ah為不同時(shí)間酶解液中的總游離氨基數(shù)，mmol;A1為原料蛋白強(qiáng)酸水解后的總游離氨基數(shù)，mmol;A0為原料蛋白中固有的游離氨基數(shù)，mmol。

1.2.4 酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以DH(水解度)為評(píng)定指標(biāo)，研究不同的酶解時(shí)間、溫度、pH和酶與底物濃度比(E/S)對(duì)木瓜蛋白酶水解效果的影響，確定各因素的最佳水平。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用Box－Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［9］，選擇對(duì)水解度具有顯著影響的三個(gè)因素:溫度(A)、pH(B)和反應(yīng)時(shí)間(C)采用三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

表1 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design and variables levels for Box－Behnken

1.2.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 采用F檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)意義［10］，數(shù)據(jù)分析軟件采用Design Expert 6.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解效果的影響 在酶與底物濃度比為6000U/g、溫度為50℃、pH=7.5的條件下，每隔1h測(cè)定其水解度。水解度曲線如圖1所示，不同水解時(shí)間木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解程度不同，水解度隨時(shí)間的增加而增加，前4h水解度增加的幅度明顯，4h后，水解度增加趨勢(shì)緩慢，趨于穩(wěn)定，因此認(rèn)為，在工業(yè)生產(chǎn)中，選定最佳的酶解時(shí)間為4h。

圖1 水解時(shí)間對(duì)水解效果的影響Fig.1 Effect of time on the degree of hydrolysis

2.1.2 pH對(duì)水解效果的影響 在酶與底物濃度比為6000U/g、溫度為50℃、酶解時(shí)間為4h的條件下，將反應(yīng)液的pH分別調(diào)節(jié)為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，然后置于反應(yīng)瓶中進(jìn)行水解反應(yīng)，測(cè)定其水解度。

pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響是多方面的，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)使酶發(fā)生可逆性或不可逆性的失活，也可通過(guò)改變酶的空間構(gòu)象而使其失活，且pH還可以改變底物的解離狀態(tài)，影響其與酶的結(jié)合［9］。每種蛋白酶都有其和底物反應(yīng)的最適合pH范圍，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，由圖2可知，pH為7.5時(shí)水解度最高，因此，可確定木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的酶解反應(yīng)的最適pH為7.5。

圖2 pH對(duì)水解效果的影響Fig.2 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.3 溫度對(duì)水解效果的影響 在酶與底物濃度比為6000U/g、pH為7.5、酶解時(shí)間為4h的條件下，將反應(yīng)物分別置于40、45、50、55、60和65℃的溫度下進(jìn)行酶解反應(yīng)，取酶解液測(cè)定其水解度。

不同溫度條件下的木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解度曲線如圖3所示，由圖3可知，溫度由40℃上升至55℃過(guò)程中，水解度升高，而當(dāng)溫度繼續(xù)升至65℃時(shí)，水解度逐漸降低。由于溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響包括兩方面:一方面，隨溫度的升高而使蛋白酶逐步變性，即通過(guò)減少有活性的酶而降低酶的反應(yīng)速度;另一方面，當(dāng)溫度升高時(shí)反應(yīng)速度也加快。在高于最適溫度時(shí)，前一種效應(yīng)為主，在低于最適溫度時(shí)，后一種效應(yīng)為主，因而酶活性喪失，反應(yīng)速度下降。因此，可確定酶解反應(yīng)的最適溫度為55℃。

2.1.4 E/S對(duì)水解效果的影響 在溫度為60℃、pH 7.5、酶解時(shí)間為4h的條件下，將馬鈴薯蛋白質(zhì)溶液置于E/S分別為2000、4000、6000、8000和10000U/g的反應(yīng)瓶中進(jìn)行酶解反應(yīng)，取酶解液測(cè)定其水解度。

圖3 溫度對(duì)水解效果的影響Fig.3 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

不同E/S條件下的木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解度曲線如圖4所示，由圖4可知，隨著加酶量的增大，水解度也相應(yīng)地增大。但E/S從6000U/g (包括6000U/g)往上增加時(shí)，水解度的增幅較小，從實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)濟(jì)成本方面考慮，在不顯著影響水解度的情況下，加酶量應(yīng)盡量減少以降低成本，因此可確定酶解反應(yīng)的最適E/S為6000U/g。

圖4 酶與底物濃度比(E/S)對(duì)水解效果的影響Fig.4 Effect of the substrate/enzyme ratio on the degree of hydrolysis

2.2 木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立與檢驗(yàn) 木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)依據(jù) Box－Behnken中心法設(shè)計(jì)了17組實(shí)驗(yàn)，其中包括5組中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。

利用Design Expert 6.0軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的回歸方程為:Y=15.90﹢3.68A－1.13B－0.18C+0.42A2－1.38B2－3.31C2+0.25AB－2.67AC－1.69BC。

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。由表3中數(shù)據(jù)可知，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(P＜0.0001)［8］。失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著(P=0.0953＞0.05)，說(shuō)明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果干擾小［11］，其決定系數(shù)為0.9972，校正決定系數(shù)為 0.9936，說(shuō)明該二次多項(xiàng)模型能解釋99.36%的響應(yīng)值的變化，僅僅只有總變異的0.64%不能用該二次多項(xiàng)模型來(lái)解釋，表明該模型的擬合度良好，用此模型可以對(duì)木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。

對(duì)回歸方程的回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。由表4中數(shù)據(jù)可知，實(shí)驗(yàn)中A、B、A2、B2、C2、AC和BC這七個(gè)因素對(duì)水解度的影響顯著，表明在木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的過(guò)程中，溫度和pH對(duì)水解度有顯著的影響;且由于AC和BC顯著，說(shuō)明水解的過(guò)程中，溫度和水解反應(yīng)時(shí)間以及pH和水解反應(yīng)時(shí)間之間的交互作用也會(huì)對(duì)水解度造成顯著影響。

表2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果Table 2 Box－Behnken design matrix and the experimental results

表3 二次多項(xiàng)模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化 通過(guò)上述二次多項(xiàng)模型方程的建立可得出一系列響應(yīng)面的曲面圖，如圖5～圖7所示。通過(guò)動(dòng)態(tài)圖即可對(duì)任意兩種因素的交互作用影響水解度的效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，并且可以從中確定最佳因素的水平范圍。等高線的形狀可以反映出交互作用影響效應(yīng)的強(qiáng)弱與大小，橢圓形表示兩種因素的交互作用影響顯著，而圓形則恰好與之相反，表示這兩種因素的交互作用影響不顯著［12］。

由圖5可以看出溫度與pH對(duì)水解度的交互作用的影響效應(yīng)。從等高線圖可知，溫度與pH的交互作用影響不顯著。將水解時(shí)間固定在0水平時(shí)，酶解液的水解度隨著pH和溫度的升高而增加，到達(dá)最大值后開(kāi)始降低，在低溫和低pH條件下，酶的活性很差。從圖5中也可以看出木瓜蛋白酶的耐高溫性比較強(qiáng)，當(dāng)溫度高于65℃時(shí)才開(kāi)始逐漸失活。

圖5 溫度與pH交互作用影響水解度的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface graph of the effects of variables on the degree of hydrolysis versus temperature and pH

圖6顯示了溫度與水解反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的交互作用的影響效應(yīng)。其等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，表明溫度與水解反應(yīng)時(shí)間的交互作用影響顯著。當(dāng)把pH固定在0水平(pH為7.5)，響應(yīng)值最大可以達(dá)到20.61%。

圖6 溫度與反應(yīng)時(shí)間交互作用影響水解度的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface graph of the effects of variables on the degree of hydrolysis versus temperature and time

圖7 pH與反應(yīng)時(shí)間交互作用影響水解度的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface graph for the effects of variables on the degree of hydrolysis versus pH and time

圖7反映了pH與水解反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的交互作用的影響效應(yīng)。從圖7中的等高線圖及曲面圖可知，pH與水解反應(yīng)時(shí)間這兩種因素對(duì)水解度的交互作用影響顯著?？梢?jiàn)pH對(duì)響應(yīng)值的影響較大，在適當(dāng)?shù)膒H條件下，隨著水解時(shí)間的增加，水解度呈增大趨勢(shì)。

2.2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Box－Behnken實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的結(jié)果以及二次多項(xiàng)回歸方程，再利用 Design Expert 6.0軟件可獲得本實(shí)驗(yàn)水解度最高時(shí)的各因素的最佳水解條件為溫度64.70℃、pH為7.41、水解反應(yīng)時(shí)間3.12h。在此水解條件下，水解度為20.45%。對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)行三次，取得木瓜蛋白酶酶解馬鈴薯蛋白的水解度為 20.16%、20.08%和20.33%，平均值為20.19%，與理論計(jì)算值的誤差在±1%以內(nèi)，可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際的水解情況。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定了最適加酶量為6000U/g，最適溫度為55℃，最適pH為7.5，最適水解反應(yīng)時(shí)間為4h。以此為基礎(chǔ)，并且以水解度為最終評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)Box－Benhnken響應(yīng)面分析法對(duì)木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳的水解條件為溫度64.7℃、pH為7.41、水解反應(yīng)時(shí)間3.12h。在此水解條件下，水解度為20.19%。通過(guò)方差分析可知，溫度與pH對(duì)水解度的影響是顯著的，溫度和水解反應(yīng)時(shí)間以及pH和水解反應(yīng)時(shí)間之間的交互作用對(duì)水解度的影響也是顯著的，溫度和pH對(duì)水解度的交互作用影響是不顯著的。由此可知，響應(yīng)面分析法可以有效地優(yōu)化木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解條件，這對(duì)馬鈴薯蛋白的開(kāi)發(fā)和利用有一定的參考意義。

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Study on the optimum conditions of the hydrolyzation of potato protein by papain

GAO Dan－dan，XU Ji－ping，LI Zhen－zi
(College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China)

Potato protein was extracted from potato pulp and hydrolyzed by papain.The influences of the hydrolysis time，temperature，pH，and substrate/enzyme ratio on the degree of hydrolysis of potato protein were investigated. On the basis of single factor tests and Box－Benhnken response surface methodology，the optimal working parameters were worked out and tested.The optimum hydrolysis parameters were as follows:when the substrate/ enzyme ratio was 6000U/g，the potato protein was hydrolyzed for 3.12h at temperature 64.70℃under pH 7.41，and the degree of hydrolysis was reached 20.19%.

papain;potato protein;hydrolysis degree;response surface;Box－Benhnken

TS201.2+1

A

1002－0306(2012)08－0267－05

馬鈴薯的蛋白含量約為2%，折合成標(biāo)準(zhǔn)水分后，蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于小麥、水稻和玉米等糧食作物，可達(dá)到10%左右［1］。馬鈴薯蛋白含人體所必需的8種主要的氨基酸，由于其賴氨酸含量高而可與谷物蛋白營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)，故馬鈴薯蛋白具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。馬鈴薯蛋白的必需氨基酸平衡要優(yōu)于其它植物蛋白，與全雞蛋和酪蛋白相當(dāng)，是一種很好的食用蛋白［2］。但長(zhǎng)期以來(lái)，馬鈴薯蛋白作為馬鈴薯淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)品，大部分用做肥料，只有少部分用做反芻動(dòng)物飼料，沒(méi)有得到很好的開(kāi)發(fā)利用，造成了蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用不同的植物蛋白質(zhì)，通過(guò)酶的水解對(duì)其改性，制備各種各樣的生物活性多肽［3］。目前，國(guó)內(nèi)外比較普遍的是將大豆蛋白經(jīng)蛋白酶水解并經(jīng)分離、精制后得到分子量低于1000為主的低聚肽混合物［4］。但是，采用蛋白酶水解馬鈴薯蛋白，制備生物活性肽的研究還很少見(jiàn)，因此具有較大的研究空間。酶解可使原來(lái)蛋白質(zhì)的功能特性發(fā)生很大變化，這些特性的改變很大程度上取決于水解度的大小。有研究表明，在一定時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)物水解度的大小和其生物活性的高低呈正相關(guān)［5］。所以，對(duì)水解工藝進(jìn)行優(yōu)化和控制具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究立足國(guó)內(nèi)外對(duì)植物蛋白研究的熱點(diǎn)，以馬鈴薯渣為原料提取馬鈴薯蛋白，采用木瓜蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化，并獲得最佳的水解條件，從而為馬鈴薯蛋白的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

2011－06－07

高丹丹(1983－)，女，博士，副教授，研究方向:食品生物技術(shù)。

西北民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(zyz2011072);甘肅省青年科技基金計(jì)劃(1107RJYA018)。