史高峰，張 梅，陳學(xué)福，王國英，姚 杰

(蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州730050)

苦豆籽總生物堿還原合成苦參堿的工藝研究

史高峰，張 梅，陳學(xué)福，王國英，姚 杰

(蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州730050)

研究了苦豆籽總生物堿還原制備苦參堿的工藝條件。以粗苦參堿的質(zhì)量為考察指標(biāo)，通過單因素實驗考察了還原劑、還原時間、還原劑濃度、還原劑用量、乙醚萃取量和萃取次數(shù)對反應(yīng)收率的影響，結(jié)果確定最佳合成條件為:苦豆籽總生物堿∶10%NaHSO3=1∶10(m/v)、還原時間為20min，乙醚萃取比例為1∶3(v∶v)、萃取次數(shù)為7次。在最佳合成條件下，苦參堿收率達(dá)25.63%，純度達(dá)到90.81%。

苦豆籽總生物堿，苦參堿，合成

苦參堿(matrine)是一種喹喏里西丁類生物堿，主要存在于中藥苦參和苦豆子等植物中［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，苦參堿和氧化苦參堿(oxymatrine)在抗病毒、抗炎、抗腫瘤、保肝、提高免疫力等方面具有廣泛的藥理活性［2－3］，尤其是在治療肝病、肝癌等方面，具有療效顯著、毒副作用小的優(yōu)勢，已成為治療肝病的特色藥物。但經(jīng)本課題研究結(jié)果表明，寧夏鹽池苦豆籽總生物堿中主要含氧化苦參堿和氧化萊曼堿(N－lehmannine)，且含量基本相當(dāng)，由于氧化萊曼堿的藥理活性和作用機(jī)理尚不明確［4－5］，而它們的結(jié)構(gòu)類似、性質(zhì)相近，難以分離。本實驗為了制備高純度的苦參堿，采用綠色還原劑將其還原得到苦參堿，并通過實驗篩選合成的最佳生產(chǎn)工藝，為臨床治療肝病所需的高純度的苦參堿和氧化苦參堿提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦豆籽 寧夏鹽池;自制GF254薄層硅膠板;乙醇工業(yè)級;HCl、NaHSO3、KI、Na2S2O3、氨水、乙醚、石油醚、30%雙氧水、丙酮 分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司;苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC，95%) 阿拉丁試劑公司。

Surveyor型高效液相色譜分析儀 配有PDA檢測器，美國Finnigan;Nexus670FT－IR型紅外光譜儀美國Nicolet;78HW－1型恒溫磁力攪拌器 杭州儀表電機(jī)廠;FA－1004型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗原理 氧化苦參堿可在室溫下與弱還原劑KI或SO2反應(yīng)，還原生成苦參堿［6］。本實驗中氧化苦參堿和氧化萊曼堿的還原反應(yīng)式如下所示。

1.2.2 苦豆籽總生物堿的提取 準(zhǔn)確稱取100g粉碎(60目)的苦豆籽，置于1000mL的圓底燒瓶中，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液進(jìn)行熱回流提取，固液比為1∶5，提取時間為2h，共提四次，合并濾液并減壓濃縮至150～200mL，3%HCl調(diào)節(jié)濃縮液pH 3～4，石油醚脫脂三次并回收溶劑，所得酸化液用氨水調(diào)節(jié)pH 8～9后，氯仿萃取8次，回收溶劑即得苦豆籽總生物堿，HPLC檢測其主要含氧化苦參堿和氧化萊曼堿，且含量基本相當(dāng)。將苦豆籽總生物堿干燥，備用。

1.2.3 工藝流程 苦豆籽總生物堿→10%NaHSO3還原→氨水調(diào)節(jié)pH→乙醚萃取→回收溶劑→粗苦參堿→石油醚結(jié)晶→過濾→干燥→成品

1.2.4 實驗過程 本實驗中以苦豆籽總生物堿為原料，考察其還原反應(yīng)條件，篩選制備苦參堿的生產(chǎn)工藝。

1.2.4.1 還原劑的篩選 取苦豆籽總生物堿0.5g三份，分別加入10%NaHSO3、10%KI、10%Na2S2O3溶液，常溫下攪拌反應(yīng)24h，取樣分析，采用TLC檢測反應(yīng)程度，噴以碘化鉍鉀顯色。

1.2.4.2 還原時間的確定 取苦豆籽總生物堿0.5g，加入2mL水使其溶解，再加入10%NaHSO3溶液，常溫下攪拌反應(yīng)3h，1h內(nèi)每隔10min取樣檢測，之后每隔1h取樣。

1.2.4.3 還原劑濃度的篩選 取苦豆籽總生物堿0.5g五份，分別加入2mL水溶解，再分別加入1%、5%、10%、15%、20%NaHSO3溶液，常溫下攪拌反應(yīng)20min，氨水堿化至pH=9，乙醚萃取5次，回收溶劑得粗苦參堿。

1.2.4.4 還原劑用量的選擇 取苦豆籽總生物堿0.5g五份，分別加入2mL水使其溶解，再分別加入0.5、2.5、5、7.5、10mL 10%NaHSO3溶液常溫下反應(yīng)，其余步驟與1.2.4.3所述相同。

1.2.4.5 萃取劑乙醚用量的選擇 取苦豆籽總生物堿0.5g五份，分別加入2mL水使其溶解，再加5mL 10%NaHSO3溶液，常溫下攪拌反應(yīng)20min，氨水堿化至pH=9，分別用8、16、24、32、40mL乙醚萃取5次，回收溶劑得粗苦參堿。

1.2.4.6 乙醚萃取次數(shù)的選擇 取苦豆籽總生物堿0.5g，先加入2mL水使其溶解，再加入 5mL 10% NaHSO3溶液，常溫下攪拌反應(yīng)20min，氨水堿化至pH=9，用24mL乙醚萃取，共10次，稱量每次回收乙醚后萃取所得粗苦參堿的重量。

1.2.5 苦參堿收率的計算

式中:m1為苦豆籽總堿還原后所得粗苦參堿的質(zhì)量;m2為原料苦豆籽總堿的質(zhì)量。

1.2.6 分析檢測方法 IR檢測:采用溴化鉀壓片法對苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品和實驗所得樣品進(jìn)行IR定性分析。

HPLC檢測:以苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，采用HPLC法對制得的苦參堿進(jìn)行定性定量分析。

1.2.6.1 HPLC色譜條件 色譜柱為:Hypersil Gold (150×2.1mm，3μm);流動相:甲醇∶3%磷酸(5∶95); PDA、UV為檢測器;柱溫:25℃;流速:0.2mL/min;進(jìn)樣量:1.0μL。

1.2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品2.0mg，用色譜甲醇溶解并定容至10mL，即0.2mg/mL，再從此溶液中準(zhǔn)確吸取5mL置于10mL容量瓶中并定容，即0.1mg/mL，依次稀釋至0.05、0.025、0.0125mg/mL。每個濃度梯度進(jìn)樣1.0μL，在波長200nm處進(jìn)行檢測，以色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣的濃度X為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6.3 實驗所得樣品的檢測 精密稱取實驗所得樣品1.0mg，用色譜級醇溶解并定容至10mL，即0.1mg/mL，取此樣品1.0μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳合成工藝選擇

2.1.1 還原劑的篩選 由圖1可知，NaHSO3還原苦豆籽總生物堿的能力非常顯著，不僅可以將氧化苦參堿還原為苦參堿，而且將氧化萊曼堿中的雙鍵也被還原而得到高純度的苦參堿。KI、Na2S2O3還原苦豆籽總生物堿的能力較弱，幾乎不能還原氧化苦參堿和氧化萊曼堿，因此選用NaHSO3作為該反應(yīng)的還原劑。

圖1 不同還原劑的TLC檢測結(jié)果Fig.1 TLC results of different reductants

2.1.2 還原時間的確定 由表1可知，苦豆籽總生物堿還原成苦參堿的時間非?？?，20min基本完成。圖2和圖3分別為總生物堿反應(yīng)10min和20min時的TLC檢測結(jié)果。

圖2 總堿還原10min的TLC檢測結(jié)果Fig.2 Results of Alkaloids deoxidated for 10min

2.1.3 還原劑濃度的選擇 1%NaHSO3還原苦豆籽總堿時濃度偏低，未反應(yīng)完全，5%、10%、15% NaHSO3均可反應(yīng)完全。20%NaHSO3還原時，會產(chǎn)生抑制作用，且時間延長，抑制作用更明顯。其原因可能是+4價的S被氧化成+6價時，產(chǎn)生硫酸根，與H+結(jié)合形成硫酸，隨著還原劑濃度的增大，硫酸的濃度也依次增大，繼而產(chǎn)生氧化作用，因此對該還原反應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用。NaHSO3溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，最多可放置2d，因在空氣中易被氧化為硫酸鈉，使其還原能力減弱，反應(yīng)時間延長。結(jié)合表2苦參堿的收率，本研究選用新鮮配制的10%NaHSO3為最佳還原劑濃度。

表1 苦豆籽總生物堿還原時間的實驗結(jié)果Table 1 Results of reduction time of total Alkaloids of Kudouzi

表5 乙醚萃取次數(shù)對收率的影響Table 5 Effects of extracting times of Et2O on yiled of reaction

圖3 總堿還原20min的TLC檢測結(jié)果Fig.3 Results of Alkaloids deoxidated for 20min

表2 還原劑濃度對反應(yīng)收率的影響Table 2 Effects of reductant concentration on yiled of reaction

2.1.4 還原劑用量的選擇 由表3可知，總生物堿與還原劑的質(zhì)量體積比為1∶1時，反應(yīng)不完全，收率低。其質(zhì)量體積比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20均可反應(yīng)完全，還原劑的用量對反應(yīng)收率的影響較小，綜合考慮收率、成本等問題，選取1∶10為還原劑的最佳用量。

表3 還原劑用量對反應(yīng)收率的影響Table 3 Effects of reductant dosage on yields of reaction

2.1.5 萃取劑乙醚用量的選擇 由表4可知，乙醚萃取量對反應(yīng)產(chǎn)率的影響較大。在一定范圍內(nèi)，萃取量增大，提取率反而降低，可能是由于乙醚揮發(fā)造成了損失。因此還原液與乙醚的最佳體積比為1∶3。

2.1.6 乙醚萃取次數(shù)的選擇 由表5可知，乙醚萃取次數(shù)越多收率越高，但考慮溶劑的揮發(fā)性和每次的萃取量，以及環(huán)境安全、生產(chǎn)成本等問題，確定萃取次數(shù)為7次。

2.1.7 苦豆籽總生物堿合成苦參堿工藝條件的重現(xiàn)性實驗 取苦豆籽總生物堿0.5、1.0、2.0、5.0g，分別先加入2mL水使其溶解，以10%NaHSO3溶液為還原劑，固液比為1∶10，常溫下攪拌反應(yīng)20min，氨水堿化至pH=9，3倍體積的乙醚萃取7次，回收溶劑得粗苦參堿，其實驗結(jié)果如表6所示。

表4 乙醚萃取量對反應(yīng)收率的影響Table 4 Effects of extracting dosage of Et2O on yields of reaction

表6 苦豆籽總生物堿合成苦參堿的工藝條件重現(xiàn)性實驗結(jié)果Table 6 Results of repetitive experiment of technological conditions on the synthesis of matrine

由上述實驗結(jié)果可知，苦豆籽總生物堿還原制備苦參堿的工藝條件是穩(wěn)定可靠的，并適于工業(yè)化生產(chǎn)，其RSD=3.22%。在此條件下苦參堿的收率可達(dá)25.63%，以苦豆籽為原料制備苦參堿的收率為0.128%左右。

2.2 樣品分析與檢測

2.2.1 樣品定性分析 采用溴化鉀壓片法對苦參堿標(biāo)樣和實驗所得苦參堿進(jìn)行IR定性分析，其紅外光譜圖如圖4、圖5所示。

圖4 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖Fig.4 The IR spectrogram of standard matrine

經(jīng)紅外光譜圖解析，樣品的IR光譜與標(biāo)準(zhǔn)品基本相同，在2796，2750，1646，1624，1468，1092cm－1均有吸收。

2.2.2 樣品定量分析 采用高效液相色譜法(HPLC)對苦參堿標(biāo)樣和實驗所得苦參堿進(jìn)行定性定量分析?？鄥A標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y= 2636X－2784.3，R2=0.9994。圖6為苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖，圖7為實驗所得苦參堿的色譜圖。

圖5 自制樣品的紅外光譜圖Fig.5 The IR spectrogram of sample

圖6 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.6 The HPLC chromatogram of standard matrine

圖7 合成苦參堿的HPLC色譜圖Fig.7 The HPLC chromatogram of matrine by synthetizing

經(jīng)色譜分析得知，苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為6.68min，合成樣品的保留時間為6.67min，其保留時間基本相近，同時樣品苦參堿色譜峰所對應(yīng)的紫外吸收波長為200nm，與文獻(xiàn)值相近［7－9］。經(jīng)樣品的色譜峰面積計算苦參堿純度達(dá)90.81%。

3 結(jié)論

本研究以苦豆籽總生物堿為原料，優(yōu)選出其還原制備苦參堿的最佳合成條件并獲得工藝參數(shù):以NaHSO3為還原劑，苦豆籽總生物堿∶10%NaHSO3= 1∶10(m/v)，還原時間為20min，乙醚萃取比例為1∶3、萃取次數(shù)為7次。經(jīng)重復(fù)性實驗驗證該合成條件可靠穩(wěn)定。同時利用此最佳生產(chǎn)工藝可獲得高純度苦參堿，純度達(dá)90%以上，收率達(dá)25.63%左右，以苦豆籽為原料制備苦參堿的收率為0.128%左右。本文所采用的綠色還原工藝反應(yīng)時間短，簡便易得，成本低廉，制得苦參堿純度高，為臨床治療肝病所需高純度的苦參堿和氧化苦參堿提供了技術(shù)支撐，并為其產(chǎn)業(yè)化奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Technological study on reduction synthesis of matrine from the Alkaloids of Kudouzi

SHI Gao－feng，ZHANG Mei，CHEN Xue－fu，WANG Guo－ying，YAO Jie
(Institute of Petro－Chemical Technology，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China)

The technological conditions on the synthesis of matrine were studied which was obtained by deoxidating with the total Alkaloids of Kudouzi.The influences of reductant，the reduction time，the concentration and dosage of reducing agent，the Et2O extract quantity and times were researched on the yield of matrine.The results showed that the optimal reaction conditions were as following:the total Alkaloids of Kudouzi∶10%NaHSO3=1∶10(m∶v)，reacting for 20min，extracting with 3 volumes of Et2O for 7 times.Under the best conditons，the yield of matrine was 25.63%and the purity was 90.81%.

the total Alkaloids of Kudouzi;matrine;synthesis

TS210.1

B

1002－0306(2012)08－0263－04

2011－07－22

史高峰(1963－)，男，博士，教授，研究方向:天然藥物分離分析及生物制品。