王國澤，袁懷波，徐建文

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014010; 2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009)

糯米蛋白提取工藝優(yōu)化及其水解物性質(zhì)的測(cè)定

王國澤1，袁懷波2，*，徐建文2

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014010; 2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009)

以糯米為原料，采用堿性蛋白酶水解法提取了糯米蛋白。就影響糯米蛋白提取率的5個(gè)因素:料液比(g/mL)、加酶量(E/S)、pH、溫度和提取時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)。研究確立了提取糯米蛋白的最佳工藝條件為料液比1∶12，加酶量2%，pH 9，溫度45℃，提取時(shí)間3h。在此條件下，糯米蛋白的提取率可達(dá)8.529%。實(shí)驗(yàn)表明，糯米蛋白水解物是一類天然的抗氧化氨基酸及其聚合物。

糯米蛋白，提取工藝，抗氧化性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糯米 蚌埠市兄弟糧油食品科技有限公司提供;鹽酸(0.1mo1/L)、氫氧化鈉(0.1mol/L)、無水乙醇、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)、無水乙醇、FeSO4、H2O2、水楊酸鈉、磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)、鐵氰化鉀(1%)、三氯乙酸(10%)、三氯化鐵(0.1%)、維生素C(VC)、考馬斯亮藍(lán)G－250試劑 分析純，天津天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;酸性蛋白酶(活力單位50000U/g)、堿性蛋白酶(活力單位100000U/g)、木瓜蛋白酶(活力單位50000U/g)、中性蛋白酶(活力單位50000U/g)及復(fù)合蛋白酶(活力單位50000U/g)天津利華酶制劑有限公司。

KA－1000型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;JA1003型電子天平 奧豪斯(上海)公司;THZ－92A型恒溫水浴鍋 江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠;THZ－92A型恒溫氣浴漩渦振蕩器 上海浦東物理光學(xué)儀器廠;752型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;JC101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海成順儀器儀表有限公司;FZ102型微型植物試樣粉碎機(jī) 河北黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠;BCD－192ACM型冰箱美的集團(tuán)電冰箱制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糯米樣品制備 糯米→37℃干燥6h→磨碎過40目篩→糯米樣品。

1.2.2 糯米蛋白提取工藝 堿提取法工藝流程:糯米樣品→調(diào)pH→恒溫氣浴中堿解→離心(3000r/min，10min)→上清液→調(diào)節(jié)等電點(diǎn)酸沉→離心(3000r/min，10min)→沉淀→冷凍干燥→糯米蛋白。

酶法提取工藝流程:糯米樣品→加水到預(yù)定量→調(diào)節(jié)pH→加入預(yù)定量的酶→恒溫氣浴中酶解→離心(3000r/min，10min)→取上清液→滅酶→真空濃縮→冷凍干燥→糯米蛋白。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化糯米蛋白提取工藝所選取的因素和水平見表1。

表1 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels in L9(33)orthogonal array design

1.2.4 蛋白質(zhì)提取率計(jì)算 采用考馬氏亮藍(lán)法［14］測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量。

糯米蛋白提取率(%)=上清液蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)/樣品質(zhì)量(g)×100%。

1.2.5 糯米蛋白水解物抗氧化性測(cè)定 采用堿性蛋白酶提取最佳工藝制備糯米蛋白，再利用木瓜蛋白酶在pH=7，溫度60℃條件下對(duì)所制備的糯米蛋白進(jìn)行酶解制備糯米蛋白水解物，測(cè)定糯米蛋白水解物的DPPH自由基［15］和羥自由基清除能力及其還原能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種蛋白酶與堿法提取糯米蛋白的比較

設(shè)定料液比1∶10、加酶量2%，調(diào)節(jié)酸性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶在各自最適溫度和pH對(duì)糯米蛋白進(jìn)行水解，對(duì)比四種蛋白酶與最優(yōu)工藝條件下堿法提取糯米蛋白的提取率，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，酸性蛋白酶的提取率僅為1.940%;中性蛋白酶提取率與復(fù)合蛋白酶提取率為5.500%左右，相差不大，堿法提取率較高為7.132%，而堿性蛋白酶提取率為7.834%。通過比較可知堿性蛋白酶是進(jìn)行糯米蛋白提取實(shí)驗(yàn)最佳選擇。

圖1 糯米蛋白提取率的比較Fig.1 The comparison on extraction rate of sticky rice protein

2.2 堿性蛋白酶提取糯米蛋白的單因素分析

2.2.1 pH對(duì)糯米蛋白提取率的影響 按照1.2.2中酶法提取工藝流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別考察pH為8、9、10、11和12時(shí)的提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 pH對(duì)糯米蛋白提取率的影響Fig.2 The effect of pH on extraction rate of sticky rice protein

由圖2可以看出，在pH 8～10范圍內(nèi)，隨著pH的升高，糯米蛋白的提取率升高，當(dāng)pH為10時(shí)，達(dá)到峰值;隨后再隨pH升高，提取率反而下降，且樣品液顏色變深。這一結(jié)果與堿性蛋白酶的最適pH范圍相吻合［18］。

糯米蛋白質(zhì)中含有較多的二硫鍵，堿液可以使糯米蛋白質(zhì)緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，同時(shí)堿液對(duì)蛋白質(zhì)分子的次級(jí)鍵特別是氫鍵具有破壞作用，并可使某些極性基團(tuán)發(fā)生解離，使蛋白質(zhì)分子表面的分子具有相同電荷，從而對(duì)蛋白質(zhì)分子有增溶作用，這種增溶作用隨堿性強(qiáng)度的增加而增大;但再度提高pH，會(huì)造成蛋白質(zhì)過度水解，提取率降低，同時(shí)氨基酸間有可能發(fā)生縮合反應(yīng)，生成賴氨酰丙氨酸等有害身體健康的物質(zhì)［19］。從圖2中看出，pH=9與pH=10的提取率相差不大，從保護(hù)蛋白質(zhì)特性角度選擇pH =9為最佳。

2.2.2 溫度對(duì)糯米蛋白提取率的影響 按照1.2.2中酶法提取工藝流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別考察溫度為25、35、45、55和65℃時(shí)的提取率。結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，堿性蛋白酶水解糯米蛋白的提取率隨溫度升高逐漸增大，但在溫度達(dá)到45℃左右后，提取率不再增大，溫度繼續(xù)上升，提取率反而減小。這是由于一定范圍內(nèi)溫度的升高，可以增加反應(yīng)的活化分子數(shù)，反應(yīng)速率增大。當(dāng)達(dá)到最適溫度后，繼續(xù)升溫，會(huì)導(dǎo)致酶及蛋白質(zhì)的變性失活，提取率降低［20］。所以45℃是堿性蛋白酶的最適作用溫度。

2.2.3 料液比對(duì)糯米蛋白提取率的影響 按照1.2.2中酶法提取工藝流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別考察料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14時(shí)的提取率，結(jié)果見圖4。

圖3 溫度對(duì)糯米蛋白提取率的影響Fig.3 The effect of temperature on extraction rate of sticky rice protein

圖4 料液比對(duì)糯米蛋白提取率的影響Fig.4 The effect of solid to liquid ratio on extraction rate of sticky rice protein

由圖4可知，隨著料液比的增加，糯米蛋白的提取率開始變大，且上升速度比較快，在1∶6的料液比下，溶液的粘度較大。分子擴(kuò)散速率低，導(dǎo)致體系分散不均勻，并且可能導(dǎo)致局部的pH過高，酶活性降低［21］。隨著料液比的增大，堿性蛋白酶水解糯米蛋白的提取率逐漸增大，在料液比達(dá)到1∶10之后，趨于平緩，且略有下降，1∶10是糯米蛋白提取實(shí)驗(yàn)的最佳料液比。

2.2.4 加酶量對(duì)糯米蛋白提取率的影響 按照1.2.2中酶法提取工藝流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別考察加酶量(E/S)為1%、1.5%、2%、2.5%和3%時(shí)的提取率，結(jié)果見圖5。

圖5 酶用量對(duì)糯米蛋白提取率的影響Fig.5 The effect of enzyme dosage on extraction rate of sticky rice protein

從圖5可以看出，糯米蛋白的提取率隨加酶量的增加而增大，但當(dāng)加酶量(E/S)超過2%之后，提取率趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)樵诘孜餄舛纫欢ǖ那闆r下，反應(yīng)速率與酶濃度成正比例關(guān)系［20］。當(dāng)加酶量(E/S)為2%時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率最高。再提高加酶量時(shí)，蛋白質(zhì)過度水解，提取率下降。所以選取加酶量(E/S)為2%。

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)糯米蛋白提取率的影響 按照1.2.2中酶法提取工藝流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別考察時(shí)間為2、3、4、5和6h的提取率，結(jié)果見圖6。

圖6 時(shí)間對(duì)糯米蛋白提取率的影響Fig.6 The effect of time on extraction rate of sticky rice protein

由圖6可見，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，堿性蛋白酶對(duì)糯米蛋白的提取率逐漸增大，但當(dāng)時(shí)間大于3h后，提取率的變化趨勢(shì)不明顯，所以選取提取時(shí)間為3h。

2.3 堿性蛋白酶提取糯米蛋白最佳工藝的確定

在以上單因素的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如表2所示，根據(jù)單因素的顯著性選取了對(duì)糯米蛋白提取率的料液比、溫度和加酶量顯著的三個(gè)因素，按L9(33)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 單因素方差分析Table 2 Single factor analysis of variance

表3 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析Table 3 Results of L9(33)orthogonal array design experiments and range analysis for SDF yield

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可知正交實(shí)驗(yàn)設(shè)定的三因素對(duì)提取率的影響大小次序?yàn)?A＞B＞C。堿性蛋白酶水解糯米蛋白的最佳反應(yīng)條件為A2B3C2，即溫度45℃、料液比1∶12、加酶量(E/S)2%，pH=9和水解時(shí)間3h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并重復(fù)三次。糯米蛋白平均提取率為8.529%。

2.4 糯米蛋白水解物抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 糯米蛋白水解物清除DPPH自由基的效果分析 由圖7可見，糯米蛋白水解物和VC均有清除DPPH自由基的能力。糯米蛋白水解物隨著濃度的增大，清除DPPH自由基的能力呈增大的趨勢(shì)，在糯米蛋白水解物濃度為1.0mg/mL時(shí)，其清除率約為60.00%。VC對(duì)DPPH的清除率雖然也隨著濃度的增大而增大，但其增幅不大，清除率基本保持在7.00%左右。通過比較可得，糯米蛋白水解物比VC具有更強(qiáng)地清除DPPH的能力。

圖7 糯米蛋白水解物和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.7 Concentration dependence of scavenging rate of hydrolyzate from sticky rice protein and VCagainst DPPH free radicals

2.4.2 糯米蛋白水解物清除羥自由基的效果分析由圖8可見，糯米蛋白水解物和VC均有清除羥自由基的能力。隨著糯米蛋白水解物濃度的增大，其對(duì)羥自由基的清除能力呈增大的趨勢(shì)，在0.2～1.0mg/mL的濃度下，其對(duì)羥自由基的清除率基本保持在35%～50%的范圍內(nèi)緩慢均勻增加。而VC在0.2～0.8mg/mL的條件下，隨著濃度的增大，其對(duì)羥自由基的清除率增大，清除率最高達(dá)到 69.00%。當(dāng) VC濃度高于0.8mg/mL時(shí)，其對(duì)羥自由基的清除率反而下降。

圖8 糯米蛋白水解物和VC對(duì)羥自由基的清除作用Fig.8 Concentration dependence of scavenging rate of hydrolyzate from sticky rice protein and VCagainst hydroxyl free radicals

2.4.3 糯米蛋白水解物的還原能力分析 在還原能力分析中，反應(yīng)產(chǎn)物在700nm中的吸光值越大，表明樣品的還原能力越大。從圖9可見，糯米蛋白水解物和VC均表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力。在糯米蛋白水解物和VC濃度為0.2～0.6mg/mL時(shí)，它們的還原能力基本保持不變;當(dāng)濃度超過0.6mg/mL后，它們的還原能力顯著增強(qiáng)。而且在相同濃度下，糯米蛋白水解物的還原能力比VC強(qiáng)。

圖9 糯米蛋白水解物和VC的還原能力Fig.9 Concentration dependence of reducing power of hydrolyzate from sticky rice protein and VC

3 結(jié)論

通過四種蛋白酶和堿法提取糯米蛋白提取率的比較，得出堿性蛋白酶是提取糯米蛋白的最佳選擇。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出，堿性蛋白酶提取糯米蛋白的最佳工藝條件為:料液比1∶12、加酶量(E/S)2%、溫度45℃、pH=9、水解時(shí)間3h。在此條件下糯米蛋白提取率可達(dá)8.529%?？寡趸钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糯米蛋白水解物具有一定的清除DPPH自由基和羥自由基的能力，且具有較強(qiáng)的還原能力，因此本研究得到的糯米蛋白水解物是一類天然的抗氧化氨基酸及其聚合物。

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Optimization of alkaline protease extraction of sticky rice protein from sticky rice and properties mensuration of hydrolysates of sticky rice protein

WANG Guo－ze1，YUAN Huai－bo2，*，XU Jian－wen2
(1.School of Mathematical Physics and Biology Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，China; 2.School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China)

In order to obtain the extraction of sticky rice protein，sticky rice was used as raw materials by alkaline protease.The influence factors，amount of solid to liquid ratio，enzyme dosage，pH，temperature and time of the alkaline protease，which could affect the efficiency of extracting sticky rice protein，were investigated by singlefactor experiment and orthogonal test.The research results showed that the optimal technical parameters could be obtained as following:solid to liquid ratio 1∶12，enzyme dosage 2%，pH=9，temperature 45℃and time 3h.The max extraction rate of sticky rice protein reached to 8.529%.Antioxidant tests of protein hydrolysates by papain showed that hydrolyzate from sticky rice protein serves as amino acids or their polymer.

sticky rice protein;extraction;antioxidant

TS201.1

B

1002－0306(2012)08－0259－05

糯米蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的蛋白質(zhì)，主要由清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白和谷蛋白四種蛋白組成，它的氨基酸組成平衡合理，且含量較高，是被公認(rèn)為優(yōu)質(zhì)的食品蛋白。糯米蛋白的生物價(jià)很高，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可與魚、雞蛋、牛乳、牛肉等相媲美［1－2］。此外，糯米蛋白是抵抗原蛋白，不會(huì)產(chǎn)生過敏反應(yīng)，在生產(chǎn)嬰幼兒食品方面有著廣泛應(yīng)用。糯米蛋白不僅具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)功能，同時(shí)還具有降低血清中膽固醇含量等保健功能［3－5］。目前提取蛋白的方法主要有物理提取、堿法提取和酶法提取。物理提取是通過破碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)而獲取蛋白的方法，其提取率低，設(shè)備投資較高［6－7］。堿法提取簡(jiǎn)便易行，但在堿液濃度過高情況下，會(huì)影響產(chǎn)品風(fēng)味和色澤，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生不利反應(yīng)，并會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)特性［8－10］。酶法提取反應(yīng)條件溫和，不會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，而且能更多保留蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［11－13］。本文以糯米為原料，采用堿性蛋白酶水解法制備糯米蛋白，以糯米蛋白的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定各因素的最佳提取條件，以提高糯米蛋白的產(chǎn)率，從而提高糯米的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

2011－07－06 *通訊聯(lián)系人

王國澤(1975－)，女，教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏方面的研究。

教育部春暉計(jì)劃合作科研項(xiàng)目(Z2009－1－01039);內(nèi)蒙古科技大學(xué)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2009NC060)。