杜曉旭，鐘 潔，段玉峰，鄒柯婷，楊 聞

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

蒲公英糖蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)分析

杜曉旭，鐘 潔，段玉峰*，鄒柯婷，楊 聞

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

通過(guò)DEAE－52纖維素柱層析和Sephadex G－100葡聚糖凝膠層析手段分離純化，從蒲公英中分離純化得到三種蒲公英糖蛋白(TMGP)－a、b、c，采用薄層層析法對(duì)其純度進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示三種成分均為均一組分。經(jīng)分析，蒲公英糖蛋白粗品TMGP和均一品TMGP－a、TMGP－b、TMGP－c中多糖的含量為79.12%、71.23%、70.25%、74.35%;蛋白質(zhì)的含量為:13.35%、19.79%、20.78%、17.60%。β－消除反應(yīng)說(shuō)明三種蒲公英糖蛋白均一品都含有O－連接型糖蛋白。經(jīng)紅外光譜分析，TMGP－a糖蛋白可能含有少量硫酸基;TMGP－b糖鏈中可能是硫酸化多糖;TMGP－c含有吡喃糖β－糖苷鍵。

蒲公英，糖蛋白，分離，純化，結(jié)構(gòu)分析

蒲公英糖蛋白粗制品 實(shí)驗(yàn)室自制;DEAE－52纖維素、SephadexG－100 英國(guó)Whatman產(chǎn)品;葡萄糖、正丁醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、氯仿、苯酚、乙醚、氫氧化鈉、雙氧水、硫酸等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DBS－100型電腦全自動(dòng)部分收集器、DHL－A型電腦恒流泵 上海滬西分析儀器廠(chǎng);RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng);800B型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);微量移液器 日本NICHIRYO公司;半微量凱氏定氮蒸餾裝置 上海貝特儀電設(shè)備廠(chǎng);T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;EQUINX55型傅立葉變換紅外光譜儀德國(guó)Brucher公司;層析柱(2.6cm×80cm和1.5cm× 50cm) 北京昌陽(yáng)永川實(shí)驗(yàn)器材銷(xiāo)售中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒲公英糖蛋白粗品純化［5－6］取蒲公英糖蛋白粗品0.5g，用10mL蒸餾水完全溶解，上DEAE－52纖維素柱(2.6cm×80cm)，洗脫速度為0.5mL/min，依次用0.1、0.2、0.3、0.5mol/L的NaCl溶液洗脫，用部分收集器收集，每管收集10mL。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)280nm處蛋白質(zhì)吸收峰，同時(shí)各管用苯酚－硫酸法檢測(cè)490nm處糖吸收峰，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，做洗脫曲線(xiàn)，收集蛋白質(zhì)和多糖重合的峰，收集液濃縮，透析、冷凍干燥。

取上述所得蒲公英糖蛋白5mg，用蒸餾水配成濃度為0.5mg/mL的樣品溶液，上Sephadex G－100凝膠層析柱(1.5cm×50cm)，用0.1mol/mL NaCl作為洗脫液，洗脫速度為0.5mL/min。每管收集10mL，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)280nm處蛋白質(zhì)吸收峰，同時(shí)用苯酚－硫酸法檢測(cè)490nm處糖吸收峰，收集蛋白和多糖重疊的峰，收集液濃縮，透析、冷凍干燥。

1.2.2 蒲公英糖蛋白的純度鑒定［7］采用薄層層析法。

1.2.3 蒲公英糖蛋白的理化性質(zhì)測(cè)定

1.2.3.1 蒲公英糖蛋白的蛋白含量和糖含量測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定用凱氏定氮法［8］。糖含量測(cè)定采用苯酚－硫酸法［9］，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)糖。

1.2.3.2 蒲公英糖蛋白的定性實(shí)驗(yàn)［10］定性實(shí)驗(yàn):顏色、狀態(tài)、溶解性、菲林試劑反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)、碘－碘化鉀反應(yīng)、CTAB絡(luò)合反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)。

1.2.4 蒲公英糖蛋白的紫外光譜分析［11］取蒲公英糖蛋白均一品，用蒸餾水溶解，再分成兩等份，其中一份加入1.5mL蒸餾水，另一份加入1.5mL 0.4mol/L NaOH溶液，測(cè)反應(yīng)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)(2h)的紫外吸收光譜，并記錄開(kāi)始與結(jié)束時(shí)240nm處的吸光值。

1.2.5 蒲公英糖蛋白的紅外光譜分析［12］將樣品和KBr置于瑪瑙研缽內(nèi)，研細(xì)混合均勻，取少許放在模具中壓片，于紅外光譜儀測(cè)定樣品在500～4000cm－1區(qū)間的透光率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英糖蛋白的純化

2.1.1 DEAE－52離子交換層析 蒲公英糖蛋白粗品經(jīng)過(guò)DEAE－52離子交換柱分離，洗脫結(jié)果如圖1～圖4所示。

圖1 DEAE－52柱層析0.1mol/L NaCl洗脫曲線(xiàn)Fig.1 Elution curve by 0.1mol/L NaCl on DEAE－52 column

由圖1～圖3可知，蒲公英糖蛋白粗品在DEAE－52柱上分別利用0.1、0.2、0.3mol/L NaCl溶液洗脫得到了有效地分離，有明顯的多糖和蛋白重疊峰，收集多糖和蛋白重疊的高峰部分，濃縮、透析、凍干得蒲公英糖蛋白分別命名為T(mén)MGP－1、TMGP－2、TMGP－3。

由圖4可以看出，沒(méi)有較大的蛋白質(zhì)和多糖的重疊吸收峰，本次實(shí)驗(yàn)沒(méi)有收集，也沒(méi)有做進(jìn)一步的研究。

2.1.2 Sephadex G－100凝膠層析 將上述糖蛋白溶解后經(jīng)Sephadex G－100凝膠層析柱進(jìn)一步分離純化，洗脫結(jié)果如下:經(jīng)DEAE－52柱層析所分離純化后的TMGP－1在Sephadex G－100柱層析過(guò)程中第5～15管出現(xiàn)了一個(gè)重疊、對(duì)稱(chēng)的吸收峰，收集多糖和糖蛋白重疊的主峰部位，得到蒲公英糖蛋白均一品命名為T(mén)MGP－a，經(jīng)濃縮、透析、真空冷凍干燥后得到糖蛋白的質(zhì)量為4.17mg，得率為83.4%;經(jīng)DEAE－52柱層析所分離純化后的TMGP－2在Sephadex G－100柱層析過(guò)程中第10～25管出現(xiàn)了一個(gè)重疊、較對(duì)稱(chēng)吸收峰，收集多糖和糖蛋白重疊的主峰部位，得到糖蛋白均一品命名為T(mén)MGP－b，經(jīng)濃縮、透析、真空冷凍干燥后得到糖蛋白的質(zhì)量為4.05mg，得率為81%;經(jīng)DEAE－52柱層析所分離純化后的 TMGP－3在Sephadex G－100柱層析過(guò)程中第10～20管呈現(xiàn)了單一對(duì)稱(chēng)吸收峰，說(shuō)明TMGP－3經(jīng)DEAE－52柱層析中得到了有效分離，收集主峰部位，經(jīng)濃縮、透析、真空冷凍干燥得糖蛋白均一品命名為T(mén)MGP－c，質(zhì)量為4.27mg，得率為85.4%。

圖2 DEAE－52柱層析0.2mol/LNaCl洗脫曲線(xiàn)Fig.2 Elution curve by 0.2mol/L NaCl on DEAE－52 column

圖3 DEAE－52柱層析0.3mol/L NaCl洗脫曲線(xiàn)Fig.3 Elution curve by 0.3mol/L NaCl on DEAE－52 column

圖4 DEAE－52柱層析0.5mol/LNaCl洗脫曲線(xiàn)Fig.4 Elution curve by 0.5mol/L NaCl on DEAE－52 column

2.2 蒲公英糖蛋白的純度鑒定

蒲公英糖蛋白TMGP－a的薄層層析結(jié)果顯示，以氨制硝酸銀噴霧顯色，有淺褐色斑點(diǎn)，因?yàn)槎嗵桥c氨制硝酸銀可以發(fā)生銀鏡反應(yīng)，可證明其中含有多糖;用水合茚三酮噴霧顯色，有紫色斑點(diǎn)，證明其中含有蛋白質(zhì)成分;用20%硫酸噴霧，有一褐色斑點(diǎn)，蒲公英糖蛋白被硫酸氧化。測(cè)得Rf值分別為0.49、0.46、0.45，因此證明該組分是一種糖蛋白均一品。蒲公英糖蛋白TMGP－b、TMGP－c薄層層析圖也出現(xiàn)了與TMGP－a一樣的現(xiàn)象，因此可以證明TMGP－b和TMGP－c兩種組分也是糖蛋白均一品。

2.3 蒲公英糖蛋白的理化性質(zhì)

蒲公英糖蛋白粗品和蒲公英糖蛋白均一品TGM－a、b、c的理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 TMGP的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical characteristics of TMGP

由表1可知，蒲公英糖蛋白均易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。雙縮脲反應(yīng)和CTAB絡(luò)合反應(yīng)均為陽(yáng)性，與碘－碘化鉀反應(yīng)、斐林試劑反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)都呈陰性，說(shuō)明蒲公英糖蛋白是非淀粉類(lèi)多糖，雙縮脲反應(yīng)呈陽(yáng)性，說(shuō)明含有蛋白質(zhì)成分。

2.4 蒲公英糖蛋白紅外光譜分析

TMGP－a的紅外光譜圖分別在 3410.18、2923.29、2856.67、1626.51、1353.42、1230.05、1023.24、611.68cm－1處有吸收峰;TMGP－b的紅外光譜圖分別在 3437.18、2922.69、2847.28、1629.57、1353.64、1273.45、1032.13cm－1處有吸收峰;TMGP－c的紅外光譜圖分別在3425.70、2922.75、2312.39、1627.06、1332. 66、1022.84、890.31、599.01cm－1處有吸收峰。

由蒲公英糖蛋白的紅外圖譜得知:蒲公英糖蛋白均一品 TMGP－a、b、c分別在3425、2922、1640、1352、1022cm－1附近都有吸收峰，這些區(qū)域的吸收峰都是多糖和蛋白分子的特征吸收峰。其中在3425cm－1左右吸收峰是羥基O－H的伸縮振動(dòng)［13］，由于分子內(nèi)羥基間形成氫鍵而使吸收峰變寬;在2922cm－1左右較弱的吸收峰是糖的C－H伸縮振動(dòng)所引起;在1640cm－1附近出現(xiàn)的吸收峰是C=0(羧基或酰胺羰基)伸縮振動(dòng)和 N－H變角振動(dòng)［14］，在1400cm－1左右較弱的吸收峰是C－H變角振動(dòng)吸收;在1000～1022cm－1處出現(xiàn)的吸收峰為C－O鍵吸收峰，表明三種糖蛋白分子都含有吡喃環(huán)［15］。TMGP－a在1230cm－1處的較弱吸收峰可能是S=O的伸縮振動(dòng)吸收，表明該糖蛋白可能含有少量硫酸基;TMGP－b在1353、1273cm－1處的較弱吸收峰分別是磺?；土蛩峄蠸=O的伸縮振動(dòng)吸收，說(shuō)明糖鏈中可能是硫酸化多糖;TMGP－c在890cm－1處有特征吸收峰，表明其糖鏈?zhǔn)桥cβ－糖苷鍵相連。

2.5 蒲公英糖蛋白紫外光譜分析

蒲公英糖蛋白的紫外圖譜顯示，TMGP－a、TMGP－b、TMGP－c三組分在280nm左右有一明顯的尖形峰，此峰是糖蛋白最明顯的特征吸收峰。三種組分的β－消除反應(yīng)前后在240nm處的吸光度值發(fā)生變化，從而可以說(shuō)明蒲公英糖蛋白 TMGP－a、TMGP－b、TMGP－c經(jīng)過(guò)NaOH處理之后，在240nm處產(chǎn)生明顯吸收，說(shuō)明三種蒲公英糖蛋白均一品中都含有O－糖肽鍵，這是因?yàn)樵谙溲趸c溶液作用下，O－型糖肽鍵可以發(fā)生β－消除反應(yīng)，與糖鏈連接的絲氨酸轉(zhuǎn)化成ɑ－氨基丙烯酸，而蘇氨酸則可以轉(zhuǎn)化成ɑ－氨基丁烯酸，所形成的不飽和氨基酸就會(huì)在240nm處有顯著的吸收。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用 DEAE－52纖維素柱層析和Sephadex G－100葡聚糖凝膠層析分離純化手段，從蒲公英中純化得到三種糖蛋白TMGP－a、b、c，采用凝膠柱層析和薄層層析法對(duì)其純度進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示三種成分均為均一組分。通過(guò)各種理化性質(zhì)的檢驗(yàn)，證明蒲公英糖蛋白里不含有淀粉。蒲公英糖蛋白粗品TMGP和純品TMGP－a、TMGP－b、TMGP－c當(dāng)中多糖的含量為79.12%、71.23%、70.25%、74.35%;蛋白質(zhì)的含量為13.35%、19.79%、20.78%、17.60%。通過(guò)紅外光譜分析可知，蒲公英糖蛋白純品TMGP－a、b、c分別在3425、2922、1640、1352、1022cm－1附近都有吸收峰，這些區(qū)域的吸收峰都是多糖和蛋白分子的特征吸收峰。TMGP－a在1230cm－1處的較弱吸收峰可能是S=O的伸縮振動(dòng)吸收，表明該糖蛋白可能也含有少量硫酸基;TMGP－b在1353、1273cm－1處的較弱吸收峰分別是磺?；土蛩峄鵖=O的伸縮振動(dòng)吸收，說(shuō)明可能是硫酸化多糖;TMGP－c在890cm－1處有特征吸收峰，表明其糖鏈?zhǔn)桥cβ－糖苷鍵相連。

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Isolation，purification and analysis of glycoprotein from Taraxacum mongolicum

DU Xiao－xu，ZHONG Jie，DUAN Yu－feng*，ZOU Ke－ting，YANG Wen
(College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)

Three fractions named respectively TMGP－a，TMGP－b，TMGP－c were isolated and purificated from Taraxacum mongolicum by using EDAE－52 cellulose and SephadexG－100 column chromatography.The purity was identified by thin layper chromatography(TLC)，and the results showed that three components were all homogeneous.Taraxacum mongolicum glycoprotein crude TMGP and pure TMGP－a，TMGP－b，TMGP－c，which polysaccharide content of 79.12%，71.23%，70.25%，74.35%，protein content:13.35%，19.79%，20.78%，17.60%. β－elimination reaction indicated the linkagetype of three Taraxacummong Dlicum glycoprotein was o－glycoside linkage.The infrared spectrum analysis，TMGP－a glycoprotein might contain a small amount of sulfate，TMGP－b sugar chain might be sulfated polysaccharide sugar，TMGP－c was pyranose β－glycoside linkage.

Taraxacum mongolicum;glycoprotein;isolation;purification;structure analysis

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0198－04

蒲公英(Taraxacum mongolicum)別名蒲公草、黃花地丁、婆婆丁、黃花三七，屬菊科多年生草本植物［1］。這種植物營(yíng)養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、微量元素及維生素等［2］;藥用價(jià)值也高，具有抗腫瘤、降血壓、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗衰老等作用［3］。目前對(duì)蒲公英的研究?jī)H限于蒲公英的總黃酮、酚酸類(lèi)和綠原酸等活性物質(zhì)［4］及蒲公英糖蛋白的提取工藝和抗氧化活性，國(guó)內(nèi)外對(duì)于蒲公英糖蛋白的結(jié)構(gòu)研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究了蒲公英糖蛋白的純化方法，對(duì)糖蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，以期為蒲公英的綜合開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2011－07－27 *通訊聯(lián)系人

杜曉旭(1988－)，女，碩士，研究方向:天然活性產(chǎn)物。

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2006B18)。